Fluorometrie, chemiluminiscence Miroslava Beňovská, Petr Breinek Luminiscence •Jev představující vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů - dochází k němu při návratu excitovaných elektronů na základní hladiny •Emise světla vzniká následně po excitaci atomů působením jiného záření, elektronů nebo při chemické reakci apod. a po jejich návratu do základního stavu •Děj, při němž záření o kratší vlnové délce (větší frekvenci) vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce (nižší frekvenci) •Část energie se vyzáří ve formě tepla (nesvítivé deexcitační procesy) •Luminiscence •LUMINOFOR/ FLUOROFOR •TEPLO •Světlo •Emitované záření •LUMINISCENCE •Excitační záření Jev, při kterém vzniká světlo (fotony) po předchozím dodání energie (excitaci) materiálu (luminoforu) Luminiscence je charakteristická svojí dobou trvání, která o několik řádů převyšuje doby života termálních kmitů (záření černého tělesa), t.j. tepelné záření není luminiscence! Druhy luminiscence Luminiscence vzniká po dodání energie v různé podobě •Fotoluminiscence – luminiscence je vyvolána elektromagnetickým zářením (zářivky) - do této kategorie patří fluorescence a fosforescence •Chemiluminiscence – luminiscence je vyvolána chemickou reakcíí (sem patří také bioluminiscence, kdy je emise světelného záření vytvořena živými organizmy – světlušky, medúzy) •Elektroluminiscence – luminiscence je vyvolána elektrickým polem (reklamní panely, nouzové osvětlení) •Katodoluminiscence – luminiscence je vyvolána dopadajícími elektrony (stínítko televizní obrazovky). •Termoluminiscence – luminiscence je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání energie •Radioluminiscence – luminiscence je vyvolána působením radioaktivního záření •Triboluminiscence – luminiscence je vyvolána působením tlaku (při deformaci tělesa) •Sonoluminiscence - vyvolána dopadem ultrazvuku •Bioluminiscence v přírodě medúza •Světlušky, medúzy, dřevokazné houby, hlubokomořské ryby,…… Jellyfish Fotoluminiscence •Podle délky trvání } fluorescence (10-9 -10-5 s ) • } fosforescence (10-2 s až dny) • •Dochází k ní vlivem absorpce energie dopadajícího světelného záření • •Pokud po odstranění zdroje ozařování rychle vymizí } fluorescence • •Pokud přetrvává (doznívá) i po odstranění zdroje ozařování } fosforescence Fotoluminiscence •X + hv ---- } X* + hν´ • X a X* je základní a excitovaný stav molekuly • hν a hν´ dopadající a emitovaná světelná energie •Emitovaná energie záření je nižší než energie dopadajícího (primárního) záření •Emitované (sekundární) záření má nižší frekvenci a delší vlnovou délku než světelné záření primární •Rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a emitujícího záření - Stokesův posun Fluorescence •Přechod mezi tzv. povolenými stavy atomu •K vyzáření fotonů dojde již za pár nanosekund (krátkodobé světélkování - 10-8 až 10-5 s). •Představuje sekundární záření po absorpci elektromagnetického záření Absorpční a fluorescenční spektrum • Posunuto k delším vlnovým délkám než původní • absorpční spektrum (Stokesův posun) • Zaujímá zrcadlovou pozici • Stokesův posun je rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního (primárního) • a emitovaného (sekundárního) záření Fluorimetr •Zdroj světelného záření (xenonová, xenonová-rtuťová oblouková výbojka, laser) •Monochromátor pro výběr excitačního záření •Kyveta (křemenné)/vzorek •Monochromátor pro sekundární (emisní) záření •Detektor (fotonásobič) · • •☼ • • • •Mexctt •Vzorek •Memis •D Přístrojová technika •Zdroje: xenonová oblouková výbojka • xenonová-rtuťová oblouková výbojka • laser •Kyvety: křemenné sklo • křemen •Detektor: fotonásobič • kolmo ke směru dopadajícího • primárního záření •Monochromátory •U imunoanal. metod se stejným fluorofem je nahrazuje: •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál – fixní vlnová délka •12 •Fluorescence •Měření fluorescence •Fluorimetry •Spektrofluorimetry •Fluorescenční skenery •Fluorescenční mikroskopy •Průtokové cytometry Fosforescence •Přechod tzv. zakázaný. • •Při fosforescenci se fotony vyzáří, ale trvá to až několik minut (dlouhodobé světélkování 10-2 s až několik dní) • •Nemá v klinické laboratoři praktické využití Chemiluminiscence •Je luminiscence vyvolaná energií chemické reakce •Vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů (H2O2, O2,…) •Dochází k produkci světelného záření exitovanými molekulami v průběhu chemické reakce •Chemiluminiscence v živých organismech - bioluminiscence •A + B à X* à P + hν • A a B jsou reaktanty, X* je excitovaný meziprodukt, P je produkt v základním stavu a hν je energie emitovaného světelného záření •Elektrochemiluminiscence - modifikace chemiluminiscence, luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovanými elektrochemicky • Luminometr •Skládá se z měrné komůrky a detektoru (fotonásobiče) •Měrná komůrka (cela) se vzorkem a ostatními reaktanty obsahuje systém zrcadel – soustřeďují světelné záření na detektor •Vznik záblesků světla - fotony •Počet fotonů zachycuje citlivý fotonásobič Fluorofory, luminofory •Fluoreskující látky obsahují konjugované dvojné vazby • •Spontánně fluoreskuje málo biologických molekul - tryptofan a porfyriny • •Luminofory produkují záření při chemických reakcích • •V imunoanalýze jsou fluorofory a luminofory navázány jako značka na protilátky či antigeny nebo tvoří substrát, eventuelně vznikají až po jeho rozštěpení • Fluorofory, luminofory – často jako značka v imunoanalýze •Příklady: • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Methylumbelliferon (MU) • Cheláty platinových kovů (ruténium) • Cheláty lanthanidů (europium) • Luminol, isoluminol • Fluorescein • •Luminol (5-aminoftalhydrazid) • luminol2 •2H2O2 = 2 H2O + O2 (peroxidasa) •Luminol + 2H2O +O2 ® aminoftalát + N2 +3H2O+ světlo • (1928) – oxidace v bazickém prostředí •Ester akridinu → Akridin + světlo • • • •Akridin phenyl ester •Chemiflex™ (Abbott) • •Patentovaný ester akridinu •akridinium(N-sulfonyl)karboxamid •Sloučenina je velmi stálá • •Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) •Využití luminiscence: Automatické imunochemické analyzátory • •Spojení luminiscenčních technik a imunoanalýzy představují automatické imunochemické analyzátory •Na nich většina imunoanalytických metod v laboratorní medicíně •Uplatnění biochemie, sérologie, transfúzní stanice •Automatizace koncem 80. let •Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrací (nmol/l, pmol/l) •Využití reakce antigen – protilátka •Značená protilátka (případně antigen) •Většinou heterogenní imunoanalýza (pevný povrch – paramagnetické částice, kulička) •Doba analýzy 15 – 60 min •Detekce s vysokou citlivostí (chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, fluorescence..) • • • • •Jaká je výhoda při použití luminiscence? üImunoanalytické metody •Vysoká citlivost metod •Např. •Kardiální markery (cTnI, cTnT, BNP, NT-proBNP) •Hormony (TSH, FT4, hCG, testosteron, prolaktin, …) •Léky (digoxin, gentamicin, …) •Tumorové markery (PSA, CEA, CA 125, AFP, …) üChromatografie - detektor •Luminiscenční •Lumino Immuno Assay (LIA) •Chemiluminescent Magnetic Immuno Assay (CMIA) •Immuno Lumino Metric Assay (ILMA) •ElectroChemiLuminiscence (ECL) • Fluorescenční •Fluorescence Immuno Assay (FIA) •Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA) •Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assay (DELFIA) •Time Resolved Aplified Cryptate Emission (TRACE) Citlivosti metod Metoda (g) EMIT 10-6 FIA, FPIA, EIA 10-9 RIA, REA, IRMA 10-12 LIA, ILMA 10-15 •Světluška Princip: oxidace luciferinu luciferin •Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (enzym luciferáza) •Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo • •Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). •světluška •Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii •Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) •Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) •Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev emitovaného záření •Použití GFP v chemii a biologii •Lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly) •Sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... albagreen •30 •FISH •Fluorescence In Situ Hybridization je cytogenetická metoda, která umožňuje detekci a lokalizaci konkrétních sekvencí DNA v chromosomech •Metoda je určená k mapování genů a sledování chromosomálních abnomalit, … •Pro detekci se využívá fluorescenční mikroskopie • AA4 •„Není Fish jako FISH“ •FISH - princip •Krátký jednovláknový (single stranded) úsek DNA, který je komplementární k hledané sekvenci, je označen fluorescenční značkou •V rozpletených úsecích DNA dochází k navázání na komplementární části •Dochází k nalezení a označení části sekvence, která kóduje zkoumaný úsek •