Optické metody Obsah 1.Optické metody - princip, rozdělení 2.Elektromagnetické záření 3.Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii – transmitance, absorbance, Lambertův-Beerův zákon, kalibrační závislost 4.Absorbce, emise záření 5.Spektrofotometry (uspořádání) - zdroj, monochromátor, optické prostředí, detektor 6.Vertikální fotometrie 7.Reflexní fotometrie 8.Turbidimetrie, nefelometrie • • 1. 1. 1. 1. Optické analytické metody Øfyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. Øvyužívají interakce analytu se světlem - výměna energie, změna optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy Ømůže jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem Spektrofotometrie-rozdělení •Podle frekvence elektromagnetického záření: •UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190-400 nm •VIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400-800 nm •IČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800-2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm • • • • • Optické metody-rozdělení •Spektrální: výměna energie mezi látkou a zářením •absorpční – sledují absorbci záření vzorkem (UV,VIS, IČ) •emisní – měření záření emitovaného vzorkem •luminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence •Nespektrální: změna vlastností záření •turbidimetrii, nefelometrii – rozptyl záření •refraktometrie – otáčení roviny polarizovaného světla • • Optické metody • • •jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením •Světlo je druhem elektromagnetického záření •Vlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter • • • •Složku magnetickou a elektrickou •Vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm • • • Elektromagnetické záření • Popisující veličiny elektromagnetického záření •rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s • •vlnová délka - l (nm) • • •Frekvence světelných vln, kmitočet (=počet vln za sekundu) - n(Hz,s-1) • Ø Export1 Popisující veličiny elektromagnetického záření •energie fotonu světelného záření ε •Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) • • •Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou •Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz • • • Elektromagnetické záření - druhy Ømonochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky (lépe velmi blízké vlnové délky); lze je získat z polychromatického světla pomocí různých monochromátorů (např. filtrů, hranolů nebo mřížek). Øpolychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky) Elektromagnetické záření - druhy •polarizované světlo – je záření, jehož kmity jsou pouze v jedné rovině kolmé na směr šíření záření. Lze je získat různými způsoby (lomem, odrazem, dvojlomem). Nejčastěji používáme tzv. Nikolův hranol, který je z islandského vápence. • Barevnost látek •pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná •barvu látky určují vlnové délky odraženého záření jsou to vždy barvy (vlnové délky) doplňkové k barvě absorbovaného světla •bílá barva – odráží záření všech vlnových délek •černá barva – absorbuje všechny vlnové • délky •Doplňkové ( komplementární ) barvy – • dvojice barev, které se vzájemně doplňují • (tj. jejich spojením vznikne bílá barva) • Barevnost látek Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •Propustnost (transmitance): •Množství světla určité vlnové •délky, které prošlo vzorkem • • • • •Kde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I •je intenzita světla ze vzorku vystupujícího • • • • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •Absorbance: • • •Bezrozměrná veličina, definovaná na základě •transmitance, udává jaké množství světla bylo •pohlceno vzorkem. • absorbance x transmitance •Transmitance nabývá hodnot od 0 do 1 (%). •absorbance (A) – udává se v logaritmické stupnici •Udávají o kolik se snížila intenzita původního záření po průchodu zkoumanou látkou • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •Zákon Lambertův-Beerův: •I = I0 . 10-ε l c •Intenzita světelného záření procházející absorbujícím •prostředím klesá exponenciálně v závislosti na délce •absorbující vrstvy a koncentraci absorbující látky • •Zákon byl nezávisle empiricky odvozen fyziky •Bouguerem (1729), Lambertem (1760) a Beerem •(1852). •Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro absorpci •monochromatického záření. Zákon Lambertův-Beerův Ø • • Øabsorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Økoncentraci absorbujících částic ve vrstvě c Økonstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •molární absorpční koeficient ελ •fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky Øtakto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti Øpokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více Øvztah mezi signálem ( absorbancí) a koncentrací se určuje kalibrace Kalibrační závislost •Praktické využití Lambertova-Beerova zákona •Provedení: •změříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce •všechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) •blank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky • • • Kalibrační závislost •Sestrojení kalibrační křivky •naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y •hodnoty koncentrace na ose x • •Pokud je závislost lineární, je •možné změřit absorbanci a •vypočítat koncentraci •neznámého vzorku Kalibrační závislost •Vzhledem k tomu, že poměr •cst/Ast je pro měřenou sérii •konstantní používáme ho pro •změřenou sérii jako kalibrační •faktor, kterým vynásobíme •naměřené hodnoty absorbance •vzorků o neznáme koncentraci • •LOD-dolní mez detekce •LOL- horní mez detekce •LOQ-mez stanovitelnosti Limitace Lambertova-Beerova zákona ØOdchylka ελ při vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí ØČástečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku ØFluorescence nebo fosforescence vzorku ØNedokonale monochromatické záření ØNekoherentní světelné záření • •Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu •absorbancí 0,2- 2,0 . Od hodnot absorbance >výrazně •narůstá chyba měření Optické metody-rozdělení •Spektrální: výměna energie mezi látkou a zářením •absorpční – sledují absorbci záření vzorkem (UV,VIS, IČ) •emisní – měření záření emitovaného vzorkem •luminiscenční metody: fluorimetrie, fosforescence, chemiluminiscence • •Nespektrální: změna vlastností záření •turbidimetrii, nefelometrii – rozptyl záření •refraktometrie – otáčení roviny polarizovaného světla • • Absorpce vs. emise záření •Emise záření: dodáním energie (např. kinetické, tepelné) jsou částice látka (složky studovaného vzorku) převedeny do vyššího energetického stavu. Při zpětném přechodu se energie vyzáří ve formě fotonu •Absorpce záření: •Částice látky absorbuje foton a přejde přitom do vyššího energetického stavu. •návrat zpět do energeticky • nižšího stavu již není sledován) Atomová absorpční spektrofotometrie-AAS •zabývá kvantitativním hodnocením změny intenzity záření (obvykle určité vlnové délky) po průchodu analytickým prostředím. Při průchodu ektromagnetického záření z oblasti UV nebo VIS části spektra měřeným roztokem dochází k absorpci záření. •Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra se nazývají fotometry nebo spektrofotometry. Atomová emisní spektrofotometrie •Při této technice se měří emise záření. K emisi záření charakteristické vlnové délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) do základního stavu. • •Přístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření, se nazývají emisní spektrofotometry Spektrofotometry • •Přístroje, které se používají k měření intenzity • záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) • oblasti spektra • •Slouží pro měření absorpce světla vzorkem • •Absorbance je měřena při různých vlnových délkách • Uspořádání spektrofotometru •Zdroj světla •Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky •Monochromátor nebo filtr: k výběru určité • vlnové délky •Absorpční prostředí: kyveta s měřeným • vzorkem •Detekční systém: zařízení k měření • světelného záření, které prošlo vzorkem • Zdroje záření a jejich použití • •Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru •Deuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru •Xenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru •Rtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm • • • Wolframová žárovka – VIS oblast spektra •Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu •Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem Deuteriová výbojka – UV oblast spektra •Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-360 nm Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra •Vysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení • Spektrofotometr - fotometrické filtry •Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. • •Charakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka •filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v •polovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky •propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr •lepší. •Fotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: •barevné absorpční a interferenční • Spektrofotometr - fotometrické filtry •Spektrální pološířka •filtru (h, nm) - odpovídá •intervalu vlnových délek záření •v polovině maximální •propustnosti filtru – •transmitance,je odvozena z •křivky propustnosti). •Čím je rozsah pološířky filtru •užší, tím je filtr lepší. • • •Křivka propustnosti Fotometrické filtry •Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální •čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 •nm •Pevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem •Kapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí • Fotometrické filtry-interferenční filtry •Interferenční filtry využívají mnohonásobnou •interferenci záření mezi hraničními plochami •s výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku •pásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) •než barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je •kovový Fabry-Perotův filtr. • interferfiltr •a, c – polopropustné vrstvičky •b – vrstva dielektrika o tloušťce l/2 •d, e – krycí vrstvy • Fotometrické filtry-interferenční filtry •Na základní desce je mezi dvěma stříbrnými •polopropustnými vrstvičkami vrstva průhledného •dielektrika o tloušťce l/2, přičemž l odpovídá •požadované vlnové délce. •Mnohonásobnými odrazy od zrcadlových ploch •filtru a po vícenásobné interferenci dopadajících •paprsků různé vlnové délky, vznikají velmi úzká •maxima s pološířkou 8 – 10 nm. • interferfiltr Spektrofotometr - monochromátory •Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra •polychromatického světla mechanicky vymezí •pouze jeho určitá část. •Slouží pro kontinuální výběr různých vlnových •délek • • • spec_fig1%20scanning Monochromátor • • •Monochromátor se skládá: •vstupní štěrbiny •pomocné optiky (zrcadla, čočky) •disperzního prvku - mřížka,hranol •výstupní štěrbiny • spec_fig1%20scanning Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina •Vstupní – vymezuje malou část světelného toku •ze zdroje záření •Výstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité •vlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma •(bandpass) a větší monochromatičnost záření. • •Poloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová •délka se nastavuje přímým otáčením disperzního •prvku. • Monochromátor - pomocná optika •Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou •potažena obvykle vrstvou hliníku •Rovinná – nejvíce používaná •Dutá, kulová , parabolická • • Čočky – optický zaostřovací systém • • Optická vlákna – skleněná, křemenná •usměrňují transport světla ve stísněných prostorách •(vertikální fotometry k měření mikrotitračních •destiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla • •Clony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel • Disperzní prvek - optický hranol •rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla •světelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou •Skleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) •Křemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm) • Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka •pracuje na principu odrazu světla •Je tvořena soustavou jemných rovnoběžných • vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) •Na vybroušených ploškách mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření •Rozklad záření je lineární u všech vlnových délek •Má lepší rozlišovací schopnost než hranol • • • • • • Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka Výběr požadované vlnové délky •Přesným pohybem •disperzního prvku •monochromátoru je vzniklé •světelné spektrum •nasměrováno na výstupní •štěrbinu tak, aby jím •prošlo záření požadované •vlnové délky • • • • • • • • • • • • ☼ • • • • •optické zrcadlo •zdroj •světla •difrakční reflexní mřížka •mikrometrický šroub • kyveta • •detektor • Spektrofotometr - Absorpční prostředí •Kyveta s měřeným vzorkem •Rozdělení: •dle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro- •(<0,5 ml), mikro-(<100 μl) •dle typu: nalévací, průtokové •dle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) • automatických bioch. analyzátorech: •kyvety na jedno použití •trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí Absorpční prostředí spektrofotometru • Instr_tech_spektrofotom 008a Instr_tech_spektrofotom 006 •zatavené kyvety z plastické fólie •postup miniaturizace kyvet •400 µl 150 µl •80 µl Spektrofotometr - detekční systém •Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování jeho odezvy • •Detektory •Zařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření •na jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou • •Hradlový selenový fotočlánek •Fotodioda •Fotonásobič •Detektor diodového pole Detektor – hradlový selenový fotočlánek •Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě •Světelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra •Tím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření Detektor – fotodioda (fotonka) •Pracuje na principu fotoelektrického efektu • •Skládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a •různé alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné •ve vakuu • •Fotokatoda uvolňuje při ozáření světlem •elektrony, které jsou přitahovány anodou čímž •vzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě •světelného záření • Detektor - fotonásobič •Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí •Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě •Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí •Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu • • • Detektor - fotonásobič • Detektor s diodovým polem •Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše destičky, na kterou dopadá světelné záření po průchodu absorpčním prostředím a následně je rozložené • monochromátorem na jednotlivé vlnové délky Detektor s diodovým polem spec_fig1%20scanning spec_fig2%20diode%20array • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – •monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance • •jednopaprkový (A) x dvoupaprskový spektrofotometr (B) Kontrola kvality spektrofotometru •Linearita spektrofotometru – schopnost vykazovat •lineární odezvu • •měření postupně ředěného roztoku o známé • koncentraci •Výsledkem je přímkový graf závislosti A (osa y) na c (osa x) •Měření se provádí při λ - 257, 341, a 630 nm • • Kontrola kvality spektrofotometru •Rozptýlené světlo •Světlo, které může dopadnout na detektor aniž •by prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé •odstínění optického systému spektrofotometru) •Ověřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru • •Drift signálu •Schopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu •Sledování nulové linie • Vertikální fotometrie •Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru • Využití : proměření absorbance v jamkách mikrotitračních •destiček, které se používají hlavně pro imunochemická •stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným •enzymem za využití imunosorbce) • Vertikální fotometrie •Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. •Každá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách. •Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru. • • • • • • • • Vertikální fotometrie •Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, •které zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. •Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje (obrázek č.8). • Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující. • Vertikální fotometrie •Součásti vertikálního fotometru: •zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. •Interferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm). •Optický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). •Detektor: používají se fotodiody. •Rychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička - 96 •jamek). • Vertikální fotometrie •Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. • Vertikální fotometrie •Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. •Poté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků • Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. • Automatická ELISA linka •Automatická linka provádí: • automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). •Má zabudovanou čtečku čárového kódu, což umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. •Linka má obvykle 3-4 místa pro umístění mikrotitračních destiček. •Dále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků), • promývačky a readeru mikrotitračních destiček. •Transport destiček mezi jednotlivými částmi provádí pomocí robotického ramene. S •systém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen softwarem pro automatické vyhodnocení měření. • Reflexní fotometrie •Princip •měření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy •Použití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů • Reflexní fotometrie •Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). •Měří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky.(matrice) • Reflexní fotometrie •nosič •separační vrstva •vrstva gelu •reagenční vrstva Reflexní fotometrie •Odraz světla od reagenční zóny: Øzrcadlový – na reflexní ploše zrcadla Ødifuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny (zahrnuje i absorpci a rozptyl) • •Zdroj záření: •halogenová lampa • xenonová výbojka •světloemitující dioda • • Reflexní fotometrie •Ulbrichtova koule - jako zdroj difuzního •světla: •dutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). •Světlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku • Reflexní fotometrie •Detektor záření: •uvnitř koule jsou umístěny dva detektory. •Jeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční • • • refl_fotometr Turbidimetrie, nefelometrie Turbidimetrie a nefelometrie •Patří mezi běžné analytické optické metody •v klinické biochemii se používají k stanovení velké skupiny bílkovin – tzv. „specifických proteinů“ •využívají rozptylu světla na heterogenních částicích v koloidních roztocích a mikrosuspenzích Turbidimetrie a nefelometrie •Princip •Rozptyl světla na heterogenních částicích je •založen na Tyndallově jevu: •„Rozptýlené záření na částicích má stejnou •vlnovou délku jako záření dopadající na koloidní •částice“. •Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry. •(Tyndall, britský fyzik, 19 st.) Turbidimetrie a nefelometrie •Tyndallův jev - dokonalý difúzní rozptyl •platí pro částice které mají velikost menší než 1/10 (př. IgG-20nm) vlnové délky dopadajícího záření •U částice o velikosti větší 1/10 – 1 (400-1400nm) násobek vlnové délky dopadajícího světelného záření je maximum rozptýleného světla směřováno dopředu a málo dozadu vzhledem k dopadajícímu záření – eliptický rozptyl Turbidimetrie • •Princip je založen na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích při průchodu světelného záření prostředím s velkými molekulami (bílkoviny) • sleduje pokles intenzity záření procházející rozptylující vrstvou •Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci •Závislost turbidance (odpovídá A) na koncentraci analytu je nelineární • • Turbidimetrie •K turbidimetrickému měření zákalu se využívají absorpční fotometry a spektrofotometry -jednoúčelové turbidimetry se dnes v klinické biochemii nevyužívají •měření se provádí v přímém směru, v ose světelného paprsku • • •☼ • •M •Vzorek • • •D Turbidimetrie •měření stupně zákalu - turbidity • •využívají se precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou • •Nutno získat dostatečně stálou suspenzi měřené reakční směsi - k tomuto účelu se používají ochranné koloidy (nejčastěji polyetylenglykol). Turbidimetrie •Na biochemických analyzátorech dosahují turbidimetrické metody reprodukovatelnost asi 5% •Je třeba snížit vliv interferujících látek na minimum – jakýkoliv vliv, který způsobí vznik částic odlišné velikosti (koncentrace činidel, teplota) •Hemolýza a ikterus ruší méně než při nefelometrii • • Nefelometrie • •zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na částicích • •Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry • • nefelo1 •Nefelometrie x turbidimetrie Nefelometrie •Rozdělení •dle použitého zdroje záření: • •Laserový nefelometr •Konvenční nefelometry • • • • • Laserový nefelometr •Helium neonový nebo argonový laser •Tento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti paprsku • •Rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 90° (fotonkou nebo fotonásobičem) Laserový nefelometr •LASER = Light Amplification by Stimulated •Emission of Radiation = zesilování světla pomocí •stimulované (vynucené) emise záření •Hlavní součásti laseru : •zdroj excitační energie •aktivní prostředí •rezonátor • • Laser_DSC09088 Laser •Hlavní součásti laseru : •zdroj excitační energie – budící zdroj působící elektrický výboj •aktivní prostředí -tj. látka obsahující oddělené kvantové energetické hladiny elektronů – může se jednat o plyn (nebo směs plynů), krystaly, polovodiče •rezonátor – tvořen dvěmi zrcadly: 1.Koncové s odrazivostí 100% 2.Výstupní s odrazivostí 99%, tzn. částečně propustné, umožňující vyzařování světelného paprsku • Konvenční nefelometry •Konvenční nefelometry •používají jako světelný zdroj žárovku nebo xenonovou výbojku •Monochromátor - interferenční filtr. •Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90o Xenonová oblouková lampa • • Poskytuje intenzivní světelné záření pomocí elektrického oblouku • Skládá se z oválné baňky vyrobené z křemenného skla ve které jsou proti sobě umístěné katoda a anoda v atmosféře xenonu • Teplota elektrického obloku se pohybuje okolo 6000 ºC • Produkuje vysoce energetické, spojité záření v UV oblasti • • Xenonová oblouková lampa • Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 004 Nefelometrie •Rozdělení podle typu měření •Systém měření v end point režimu– po smíchání antigenu a protilátky proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu - možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu. Proto je nutné nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky • Měření v tomto režimu je o řád citlivější než turbidimetrie (0,1 mgl) • Nefelometrie •Systém měření v end point režimu Nefelometrie •Rozdělení podle typu měření •Systém měření v kinetickém režimu •RATE-reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje Nefelometrie •Systém měření v kinetickém režimu • Průběh imunoprecipitační reakce •Heidelbergova-Kendalova křivka: • Oblast ekvivalence • Oblast nadbytku protilátky •Zákalové metody: nefelometrie, turbidimetrie • Oblast nadbytku antigenu • •Ab - protilátka •Ag - antigen Limitující faktory imunochemických stanovení •Limitující faktor: precipitát se tvoří pouze při optimálním množství antigenu a protilátky, při nadbytku některé ze složek se precipitát začne rozpouštět. • tzn. JEDNA HODNOTA KONCENTRACE •PRECIPITÁTU TAK ODPOVÍDÁ DVĚMA •KONCENTRACÍM ANTIGENU – možnost vydání •falešně negativního výsledku • Imunoprecipitační křivka podle Heidelberga a Kendalla • Detekce nadbytku antigenu •Několik způsobů: •Kontrola přídavkem naředěného antigenu po •proběhnuté imunoprecipotační reakci – následuje •automatické opakování analýzy s vyšším ředěním. • •Přídavek malého množství vzorku k činidlu •před vlastní reakcí – je-li po krátké inkubaci •překročen koncentrační práh zjištěný při kalibraci, •vzorek se měří automaticky znovu při vyšším •ředění • • • Detekce nadbytku antigenu Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 007 1.V případě zachování nadbytku Ab dojde další tvorbě imunokomplexů a nárůstu intenzity rozptýleného světla 2.Pokud byla protilátka již spotřebována, nevede přidání dalšího antigenu k tvorbě imunokomplexů a na detektoru nezjistíme žádnou odezvu – reakce se automaticky opakuje při vyšším ředění 3. Imunochemický systém - IMMAGE 800 •Analyzátor výrobce Beckman Coulter • využívá turbidimetrického a nefelometrického principu •Pracuje v kinetickém režimu - měří zvýšení intenzity světla rozptýleného částicemi v kyvetě v čase • IMMAGE 800 - reagenční část •Reagenční karusel pro 24 reag. kazet •Teplota 15°C •4 lahvičky s pufry bez chlazení •Reag. kazety značené čárovým kódem •Otevřený systém •Softwarová kapacita -50 metod •Kalibrační data- kal. křivka výrobce má 8-12 bodů, provádí se pouze jednobodové ověření • • Vzorková část •Vzorky ve zkumavkách s čár. kódem •Vzorkový karusel pro 8 stojánků po 9 vzorcích • ředící roztoky pro vzorky • ředící segmenty pro ředění vzorků •Kapacita: 180 testů za hodinu, v sérii lze provést 12 metod Reakční část •Reakční karusel – 39 reak. plastových kyvet, • 1 referenční – známá hodnoty rozptylu, nastavení optického systému •Teplota 37°C •Optika – zdroje záření, detektory Turbidimetrie •měření stupně zákalu (turbidity) – v důsledku imunoprecipitační reakce •Měří se snížení intenzity světla při průchodu roztokem částic v kyvetě v důsledku rozptylu světla •Immage pracuje v kinetickém režimu – hodnotí rychlost nárůstu zákalu v čase •NIPIA= imunoanalýza na částicích v blízké • infračervené oblasti • • Turbidimetrie •Zdroj pro NIPIA: světlo emitující dioda – poskytuje monochromatické záření λ = 940 nm •Detekce záření: v přímém směru, v ose světelného paprsku zdroje v blízké IR oblasti (940 nm) •Vyžití: stanovení FLC • Nefelometrie •Zdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm •Detekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku •Využití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči • Nefelometrie •Zdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm •Detekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku •Využití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči • Řešení problému s imunoprecipitační křivkou •Nutno provést taková opatření, aby nedošlo k omylu při odečítání vyšších koncentrací antigenu •IMMAGE : detekce nadbytku antigenu • pomocí přídavku dalšího antigenu po ukončení reakce Jestliže nenavázaná protilátka … Přídavek dalšího antigenu bude mít za následek… Systém IMMAGE… Je přítomna Zvýšení poměrové odezvy Použije k výpočtu výsledku původní poměrovou odezvu Není přítomna Žádné zvýšení poměrové odezvy Vzorek automaticky zopakuje s vyšším ředěním s testem na přebytek antigenu dokud nezíská správný výsledek Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec •Výrobce: Siemens (dříve Dade Behring) •Max. provozní rychlost 180 analýz za hod. •Pracuje v režimu po vzorcích •K dispozici je více než 60 metod •Zdroj světla: LED dioda (840 nm) •Detektor – křemíková fotodioda je umístěn pod úhlem 13-24 º • • • • Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec •Reagenční disk je temperován na 8ºC,v •analyzátoru lze umístit 35 činidel •Reakční disk: 60 polystyrénových kyvet pro opakované použití •Měření probíhá při 37 ºC •Délka inkubace je 6-12 min. •Vzorková část: lze umístit až 100 vzorků, umožňuje používat primární, sekundární zkumavky a kepy • • • Nefelometr Array 360 •Výrobce: Beckman Coulter •Měření v kinetickém režimu •Rychlost 40-80 analýz za hod. •Zdroj světla: halogenová žárovka (400-620 nm) •Detektor:křemíková fotonka •K dispozici asi 60metod •Nevýhoda:pracovní teplota pouze 26,7 ºC, velký mrtvý objem, stabilita kalibrace pouze 14 dní • • Nefelometr - Delta •Výrobce Radim •Zdroj světla laser (670 nm) •K dispozici 100 metod •Rychlost 150 analýz za hod. (startovací čas 30 min., ukončovací čas 15 min. !) •Reagenční část: 54 pozic pro reagencie, chlazená •Reakční část:120 omyvatelných kyvet, temperovaných na 37 ºC •Vzorková část: pro 80 vzorků Turbox plus •Jednoduchý manuální nefelometr •Výrobce: ORION Diagnostica •Lze měřit až 100 vzorků za hodinu •Zdroj světla je LED dioda (635 nm) •Detektor: 2 fotodiody •Tovární kalibrace je na magnetické kartě Děkuji za pozornost