DELFIA
Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay
Fluoroimunoanalytická metoda
– velmi citlivá metoda
– specifická metoda
Stanovení analytů
– nízkomolekulárních
– vysokomolekulárních
– finská firma Wallac Oy
využívá časově modulované měření
fluorescence chelátu lanthanidů
– Europium
– Terbium
– Samarium
– Dysprosium
DELFIA - princip
Protilátka nebo antigen označeny fluorescenční
sondou – stabilním chelátem lanthanidu
– nejčastěji Europium
Po proběhlé imunochemické reakci:
– přidání „zesilovacího“ roztoku ke vzniklému
komplexu
• odtržení Eu z komplexu
• přeměna Eu na nový intenzivně fluoreskující
chelát (s novým - luminogenním ligandem)
Cheláty
 komplexní (koordinační) sloučeniny centrálního
atomu a dvoj- nebo vícevazných ligandů
 ligandy tvoří s centrálním atomem cyklická
uspořádání
• chelátový efekt - významné zvýšení stability
komplexů ve srovnání s jednovaznými ligandy
DELFIA - Chelátové značení protilátek
 nejčastěji cheláty lanthanidu s izothiokyanátofenyl-deriváty
polyaminopolyoctových kyselin (EDTA, DTTA, DTPA,…)
DELFIA
Po proběhlé imunochemické reakci vzniká
Fluoreskující chelát (s novým - luminogenním - ligandem):
 Fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra
(rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence)
• Vzorek pulzně excitován zářením o vlnové délce 340 nm
• Fluorescence měřena v dlouhovlnné části viditelného spektra (Eu - 620 nm)
– eliminace pozadí (případná fluorescence matrice se projevuje pouze
v krátkovlnnější oblasti)
DELFIA - Time-resolved fluorometry (TRF)
 fluorescence je dlouhodobá
• doba emise delší než u běžných fluoroforů - řádově stovky mikrosekund
• Fluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekund (začíná v
době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je podstatně kratší –
nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund.
• Cyklus (pulsní excitace - prodleva - měření) trvá 1 milisekundu, během měření
vzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakuje
DELFIA
- Vysoká citlivost a specifičnost
DELFIA
Uspořádání imunochemické
reakce:
- kompetitivní:
- fluorescenční sondou značený antigen
- intenzita fluorescence nepřímo úměrná
koncentraci analytu ve vzorku
- nekompetitivní (sendvičové):
- fluorescenční sondou značená
protilátka
- intenzita fluorescence přímo
úměrná koncentraci analytu
ve vzorku
DELFIA - současné stanovení více analytů
Fluorescence lanthanidů:
 Úzké emisní píky při různých vlnových
délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm)
 Různá doba trvání fluorescence Eu, Sm
- Při měření se nepřekrývají
vlnové délky ani časy
odečtu fluorescence Eu a
Sm - umožňuje současné
stanovení dvou analytů
DELFIA - využití
DELFIA lze použít pro široké spektrum analytů (v principu lze lanthanidem
označit každou stabilní sloučeninu obsahující aminoskupinu):
• Proteiny
• Peptidy
• Oligonukleotidy
• Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…)
Novorozenecký screening (stanovení ze suché krevní skvrny):
• TSH (kongenitální hypotyreóza)
• 17-hydroxy-progesteron (kongenitální adrenální hyperplázie)
• Imunoreaktivní trypsinogen IRT (cystická fibróza)
DELFIA
praktické provedení
 Pracuje se v mikrotitračních destičkách
v uspořádání 8x12 jamek se specifickou
protilátkou (obvykle monoklonální)
vázanou na pevné fázi
DELFIA (suchá krevní skvrna)
1 Vyrážení terčíků (razička) 2 Dávkování činidel 3 Inkubace, třepání
4 Odstranění terčíků z jamek 5 Promytí destičky 6 Měření na fluorometru po
(vakuová odsávačka) (promývačka) přidání zesilovacího roztoku
DELFIA – suchá krevní skvrna
Diagnostický set obsahuje mikrotitrační destičky,
roztoky, kalibrátory a kontroly (ve formě suché krevní
skvrny)
Umístění kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků na
destičce kalibrátor kontrola pacient
Softwarově zpracovaná kalibrační křivka:
kompetitivní uspořádání sendvičové uspořádání
DELFIA x AutoDELFIA
„Manuální“ linka DELFIA Analyzátor AutoDELFIA
• Metodu DELFIA lze plně automatizovat při
práci s kapalným materiálem (plasma, sérum)
• Při práci se suchou krevní skvrnou není dosud
běžná automatizace prvního kroku (vyrážení
terčíků)
Děkuji za pozornost…
…a za to, že
k dané
problematice
nepřistupujete
tímto způsobem…