Základy imunohematologie Imunohematologie • •Imunologie aplikovaná na krevní buňky (erytrocyty, granulocyty, lymfocyty, trombocyty) •Nauka o antigenech, protilátkách, imunitních reakcích •Multioborová věda, klinicky využívná při přípravě a podání transfuze a u některých jiných stavů •Řeší specifickou imunologickou problematiku /patologie hemolytického onemocnění novorozence a autoimunitní hemolytické anemie •Uplatnění v transplantologii (hematopoetické bb., solidní orgány) • Imunita • •Obecná definice: odolnost proti nemocem/antigenům •Zajišťuje ji systém buněk, tkání a molekul, tzv. imunitní systém •Jeho funkce: prevence a eradikace infekcí, rozpoznání a odpověď na cizí tkáně a nové antigeny, obrana proti tumorům •Dva typy: imunita přirozená (iniciální protekce proti infekcím) a imunita získaná (pomalejší, ale více efektivní specifická obrana proti infekci) Přirozená/nespecifická/naivní •Stále přítomná u hostitele, brání vstupu antigenů do organizmu a rychle je eliminuje • –Neporušená bariéra epitelu, jeho enzymy a nepatogenní flora –Humorální složky (plazmatické = komplement, cytokiny, interferony) –Buněčné složky (fagocyty, NK lymfocyty) – •Efektem je uniformní typ reakce •Tyto mechanizmy reagují s některými mikroby, ale ne s neinfekčními antigeny Získaná/specifická/adaptivní •Stimulují ji antigeny, které byly invazivní a již vstoupily do tkání • –Buňky-lymfocyty exprimují specifické receptory, které rozpoznávají cizorodé substance –Má dvě specializované funkce •Humorální složku: protilátky tvořené B lymfocyty eliminují mikroby z extracelulárních tekutin •Buněčnou (celulární) složku: T lymfocyty CD4+ a CD8+ eliminují mikroby z buněk • •Lymfocyty působí spolu s nespecifickými mechanizmy (protilátky se navážou na mikroby, to vede k jejich snadnější fagocytoze) Obrázek1 Specifická imunita •Startuje rozpoznáním antigenu v lymfatických orgánech •Proliferace a klonální expanze (rychlá proliferace buněk se stejnou antigenní specifitou) B lymfocytů zajistí rychlou protilátkovou odpověď •Imunitní systém rozliší nejméně bilion různých Ag •Klony lymfocytů se liší jiným receptorem pro Ag • • • • • • • •Imunitní odpověď primární (naivní lymfocyty) x sekundární (paměťové lymfocyty) • B Cell B Cell • • fáze imun odpovědi • Obrázek1 Buňky v imunitní reakci •Lymfocyty •Exprimují specifické receptory pro antigeny (BCR, TCR) •Jsou to povrchové membránové proteiny (CD znaky) –U B ly jsou to membránové Ig = protilátky. Reagují se solubilními Ag a s různými povrchovými Ag, na které se navazují –U T ly jsou receptory pro proteinové Ag: Thelper CD4+, T cytolyticCD8+, Treg/suppressor – •Paměťové lymfocyty přežívají v klidu, po dalším kontaktu s původním antigenem navodí sekundární odpověď • Imunohematologie = protilátkový typ specifické imunitní odpovědi • •Protilátky /imunoglobuliny • •produkty B lymfocytů •přítomné na membráně lymfocytů jako antigenní receptory BCR nebo rozpuštěné jako proteiny v krvi a v mukozních tekutinách •neutralizují a eliminují antigeny z krve a z lumen mukozních orgánů •nepůsobí uvnitř buněk •rozeznávají jen určité typy mikrobiálních molekul (proteiny, sacharidy, lipidy) x T lymfo (proteiny) • • • • funkce protilátek Protilátky / imunoglobuliny •2 funkce: rozpoznání Ag + sekrece Ab •B receptor imunoglobulinu rozeznává tvar antigenu nebo jednoduché chemické skupiny antigenu •B receptor tvoří domény (3-dimenzní tvar), • kterými se klony lymfocytů liší • • • • •Dva typy řetězců: typ L (lehké) a typ H (těžké) •Lehké řetězce: kappa, lambda •Těžké řetězce: mí,delta, gamma, alfa, epsilon • 1_16 Ig variable region •Immunoglobulins (i.e., antibodies) Struktura protilátky •4 polypeptidové řetězce protilátky H2L2 •Každý obsahuje dva identické H a identické L řetězce •Tvoří tvar písmene Y, vzájemně spojené L a H řetězce •Dva fragmenty Fab + jeden fragment Fc, mezi nimi flexibilní pantová oblast •Variabilní část obsahuje oblast (paratop) pro vazbu antigenu • • 0000007 Struktura protilátky •Monomery IgG,IgD,IgE = dvě vazebná místa pro Ag •Dimer IgA = čtyři vazebná místa pro Ag •Pentamer IgM (hexamer) = deset (dvanáct) míst pro Ag 0000007 0000005 0000004 • štěpení Abs afinita • • •Afinita: Síla reakce mezi 1 antigenní determinantou a 1 vazebným místem Ab •Avidita: síla vazby mezi multivalentními Abs a Ag s různými antigenními determinantami •Specifita: schopnost Ab reagovat s jen 1 antigenní determinantou •Cross-reakce: schopnost protilátky reagovat s více antigenními determinantami • Typy protilátek dle způsobu výroby •Polyklonální Abs (lidské): pocházejí z různých buněčných linií lymfocytů, rozeznávají různé typy stejně specifických epitopů •Monoklonální Abs: identické protilátky produkované jedním klonem lymfocytu, • rozeznávají jeden • určitý epitop • • Antigeny • •Cizí substance navozující imunitní odpověď •Cizí oblasti = antigenní determinanty (epitopy) •Jeden antigen může mít různé epitopy •Ne všechny oblasti antigenu jsou cizorodé = imunodominantní •Antigeny v imunohematologii –HLA (histokompatibilní,transplantační) antigeny –Krevní skupiny erytrocytů • Ag determinanty Krevní skupiny •Antigeny erytrocytů = krevní skupiny • - zajišťují transport vody, urey, iontů • - jsou receptory pro mikroorganizmy • - mají adhesivní funkce • - jsou enzymaticky aktivní • - udržují morfologické a strukturální vlastnosti • erys •Antigenicita dle –Typu a hustoty antigenu na erys –Rozpustnosti antigenu v plazmě KS Krevní skupiny •Obvykle velké molekuly, složené sloučeniny (proteiny, polysacharidy, lipidy, NK) •Větší molekuly a komplexy molekul = lepší imunogeny •Imunogenicita závisí na stupni cizorodosti, strukturální stabilitě molekuly, dostatečném počtu Ag determinant, době expozice Ag, způsobu podání •Autoantigeny vznikají při selhání autotolerance •Hapten = malá molekula neimunogenní, spojuje se s větším nosičem • 0000010 Membrána erytrocytů •Vně dvojvrstva fosfolipidů (zeta potenciál + bikonkávní tvar) – na ní antigenní struktury/krevní skupiny •Střed membránové proteiny (vertikální síly) •Uvnitř cytoskeletální proteiny (horizontální síly) • membrána Komplementový systém •Komplex proteinů v plazmě a proteiny vázané na povrchu různých buněk •Převážně proteolytické enzymy –enzymatická kaskáda při aktivaci –aktivované proteiny štěpí další složky komplementu –vzniká velký počet efektorových molekul •Funkce v obranyschopnosti • • komplement aktivac Aktivace komplementu •Mikrobiální nebo protilátkami navázanými na antigenech •3 aktivační cesty: klasická/protilátková • lektinová • alternativní •Odlišné spouštěcí mechanizmy aktivace •V imunohematologii aktivace protilátkami: 1molekula IgM stačí pro vazbu C1q, ale pro stejnou vazbu musí být 2 molekuly IgG • • Působení komplementu na erytrocyty •Velké množství = intravaskulární hemolýza erytrocytů •Malé množství = extravaskulární hemolýza v RES = fagocytóza erytrocytů • • •např. pozdní HTR, HON, warm AIHA …..fagocytoza • •např. akutní HTR při AB0 neshodě, cold AIHA…..i.v.lýza • Komplementové inhibiční mechanizmy • •Regulace na úrovni: • •C1q …………………..C1 INH •C3konvertáza………..DAF, C4BP, CR1 •C5 konvertáza……….CR1, H •MAC…………………..CD59 Imunologická tolerance, autoimunita • •Imunologická tolerance: intaktní imunitní systém rozezná vlastní tkáně od cizích •Vlastní antigeny toleruje = lymfocyty na ně nereagují •Selhání zabezpečovacích mechanizmů vede k poruše autotolerance, ke vzniku autoimunitních onemocnění Autoimunita •Reakce proti vlastním antigenům v důsledku selhání fyziologické regulace imunitních procesů = selhání regulačních procesů lymfocytů – unikají kontrole •Nadměrná produkce protilátek nebo cytotoxických lymfocytů vede k poškození tkání •Dědičná dispozice (MHC geny i non-HLA geny) + spouštěcí faktory z okolí (infekce, záněty) •U 1-2% jedinců je manifestní porucha autoimunity •Různé orgánové projevy – revmatoidní artritida, lupus erytematodes, autoimunní hemolytická anemie • aiha Laboratorní techniky používané v imunohematologii Cíl: detekce imunních komplexů Ag+Ab • •Aglutinační reakce (antigen = partikule ery, trc, leu) •Vzácně jiné metody ( ELISA, imunofluorescence, PCR, FCM, chipové..) •Různé aglutinační techniky - testy sklíčkové, zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace v gelu •Testy při teplotě 20-23°C (RT), 4°C, 37°C • pasivní aglutinace titr •Pasivní /přímá aglutinace kvalitativní • Titr / prozona - aglutinace kvantitativní Zeta potenciál – elektronegativní pole brání autoagregaci erytrocytů • • • vazeb Aglutinace •Použití při vyšetření krevních skupin, při vyšetření protilátek proti erytrocytům, v předtransfuzních testech •Přímá a nepřímá (vyžaduje pomoc) aglutinace •Vliv komplementu na výsledek reakce/ hemolýza – falešně negativní výsledek- prevence antikoagulací • • 1114-43586 Obrázek1 Aglutinace přímá •1. fáze senzibilizace •Vytvoření slabé vazby mezi Ag a Ab závisí na • –Izotypu Ig (IgM, IgG, vzácně IgA) –Teplotě (klinický význam 37°C, při vyšší teplotě disociace molekul Ab z vazby, při nižší teplotě prodloužení inkubace) –Iontové síle prostředí (obsah iontů Na a Cl = izotonický roztok PBS, neutralizující efekt. Při použití LISS rychlejší vznik imunních komplexů) –pH prostředí (přijatelné cca 7. Pro některé Ab individuální. PBS zajišťuje alkalizaci. V nižším pH disociace Ab) –Počtu antigenních míst /densitě ( nadbytek Ag x nadbytek Ab), poměr sérum/erys (snížení vede k vyšší senzitivě testu) AgAb ratio •2. fáze aglutinace •Vytvoření pevného spojení mezi Ag a Ab • –Vznik pevných chemických vazeb mezi senzibilizovanými erys (protilátky spolehlivě přemostí a vzájemně spojí erytrocyty) –To lze ovlivnit (vzdálenosti mezi erys) centrifugací, proteolytickými fermenty, koloidy, polymery, additivy testů , chemickými úpravami diagnostických protilátek • – • • agregáty ery Aglutinace nepřímá • – •Zásadní test v imunohematologii •Hlavně pro IgG protilátky, které nejsou schopné přímé aglutinace •Detekuje i jiné typy protilátek podle použitého AGH •Nepřímá aglutinace vyžaduje modifikovat 2. fázi a nějakým způsobem vizualizovat vzniklé imunní komplexy: 1.úprava erytrocytů pomocí enzymů 2.použití testu s AGH sérem (antiglobulin human) • Nepřímá aglutinace 1.Enzymové testy: • –Bromelin, ficin, papain, trypsin •štěpí kyselinu sialovou (neuraminovou) na membráně erys, odkrývá antigenní místa a membránové antigeny se tak stávají dostupnější pro protilátky •snižují elektronegativní povrchový náboj erys a vzájemně je přibližují, umožňují tím navázání protilátky •v prostředí s enzymem získává protilátka vyšší schopnost aglutinovat erys (nevýhoda:mohou se demaskovat nežádoucí antigeny/kryptantigen) • –Obtížná standardizace enzymových testů (nespecifické reakce) –Jednofázový (přidání enzymu do reakce) x dvoufázový (enzymované erys) test – • Nepřímá aglutinace 2.AGH testy: – –Pro vyšetření protilátek v séru a navázaných na erys, zkoušku kompatibility, vyšetření některých krevních skupin –Používají protilátky proti lidským proteinům (antiglobulin = AGH sérum) –Senzitivní technika cca (až150 molekul Ab/ery) –Různé metody: testy zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace –Modifikace testů se zkrácením doby inkubace v LISS, užití PEG –Velké riziko chyb a falešných výsledků – AGH testy •AGH detekuje lidské proteiny: protilátky a komplement •Reaktivita AGH s různými lidskými globuliny (anti-IgG,-IgM,-IgA,-C3d..) •AGH reaguje s navázanými nebo volnými protilátkami za vzniku aglutinace • •Dva typy AGH testů: • 1.Přímý AGH test (PAT) pro detekci protilátek navázaných na erys • 1.Nepřímý AHG test (NAT) pro detekci protilátek v séru Princip AGH reakce • NAT Direct Antiglobulin Test • • • • • •washed patient’s red cells •add antiglobulin •centrifuge • • • • • •Negative •No antibody or complement on red cells • • • • • •Positive •Antibody and/or complement on red cells Indirect Antiglobulin Test •Incubate at 37oC •wash x 3 •add antiglobulin •centrifuge • add patient serum • • • • • •reagent red cells • • • • • •Negative •No antibody in serum • • • • • •Positive •Antibody in serum Coombs_test_schematic AGH reagencie/séra •Polyspecifické AGH (-IgG, -C3d): •Zásadní důležitost: detekuje IgG protilátky navázané (senzibilizující) na erys i protilátky volně přítomné v séru •Detekuje všechny klinicky významné protilátky •Monospecifická AGH: •Anti-IgG sérum: detekuje pouze protilátky IgG na erys •(lze použít) •Anti-C3 sérum: detekuje komplement na erys (jen pro •některé situace) • • • • • Monospecifická AGH séra • 18krvinky8 Monospecifická AGH IgG a C3d • 15krvinky5 Hodnocení •negativní bez rizika hemolýzy •pozitivní do ředění 30 malé riziko hemolýzy •pozitivní vyšší než 30 velké riziko hemolýzy • • • 16krvinky6 IgG1 a IgG3 • 17krvinky7 Co ovlivní senzitivitu AGH testu? • •Teplota prostředí •Ionty v prostředí •Poměr séra/erytrocytů ( 2kp séra : 1kp ery) •Doba inkubace (pro IgG 15min při 37°C v LISS) •Variabilní senzitivita testu (slabý test při méně než 200 molekulách navázané protilátky) • • •Aktuální doporučení: AGH test s použitím roztoku o nízké •iontové síle (LISS), optimální je použití metody sloupcové aglutinace v •gelovém mediu • • • • Nevýhody AGH testů souvisí s promýváním erytrocytů (zkumavkové testy) •Výsledky falešně pozitivní • Spontánní aglutinace, autoprotilátky, kryptantigeny, hypercentrifugace, silikonové zkumavky, volumexpandery, kontaminovaný materiál aj. • • • • • • • •Výsledky falešně negativní • Chyba promytí s neutralizací přidaného AGH volnými protilátkami, časové prodlení, nedodržení teploty, kvalita AGH, podcentrifugování, prozona, technické chyby • • • Kontrola přidáním erytrocytů s navázanou slabou protilátkopu k negativnímu test = vznikne aglutinace techniky Jiné typy imunohematologických vyšetření inhibice heamglutinace •Inhibice hemaglutinace/solubilní Ag imunoelfo • ELISA, RIA • Imunoelektroforeza RIA,ELISA imobilizace Ab imobilizace Ag • Pevná fáze • • •Flowcytometrie •Měření imunofluorescence bb. suspenze •Individuálně prováděné vyšetření •Určení slabě exprimovaných antigenů •Odlišení dvojí populace erys (FMH) • • • • •Molekulárně genetické metody •Určení polymorfizmů krevních skupin při genotypizaci dárce/pacienta/plodu, pacienta po transfuzi apod. • • rx-22 •BloodChip •DNA microarray hybridization •Stanovení genotypů: 33 AB0, 87 RhD, 9 RHCE, 8 KEL, 4 JK, • 4 Fy, 9 MNS, 2 DI, 2 DO, 2 CO • Speciální testy v imunohematologii •Eluční testy k disociaci IgG protilátky z vazby na erys •Adsorpční testy k průkazu protilátky/autoprotilátky, k separaci protilátky ze směsi, k průkazu imunních komplexů a léků na erys, k potvrzení slabých antigenů •Určení tříd Ig – odlišení Ig - disociace aglutinátů tvořených IgM protilátkami •Neutralizace (inhibice) protilátky překrývající jinou protilátku (substance) •Stanovení rozpustných krevních skupin – vylučovatelství •Kombinace technik