Možnosti využití metod molekulární biologie a genetiky v medicíně Doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D. Aplikace technik molekulární biologie a genetiky v terapii Molekulární terapie Genová terapie Molekulárně cílená terapie (bioterapie) Perzonalizovaná medicína Molekulární medicína Transfer nového genetického materiálu do buněk jedince za účelem dosažení léčebného efektu Genová terapie Rozdělení GT •Terapie somatických buněk •Terapie buněk zárodečného epitelu nebo buněk embryonálních Zdroj:www.bio.miami.edu/dana/ 104/104F02_25.html. Zdroj: www.biochem.arizona.edu/.../ Lecture25.html. •In vivo •In vitro (Ex vivo) Rozdělení GT Základní strategie GT • Výměna nefunkčního genu za správný • Gene augmentation (posílení) – vpravení kopie zdravého genu bez odstranění původního • Nukleázy - Zinc Fingers (ZFN) – TALENs – CRISPR/Cas9 • Ribozymy • siRNA – interferující RNA • Řízená sebevražda bb (VDEPT – viral directed enzyme production therapy) • Genetická chirurgie • Antisense DNA, RNA (protismyslné oligonukleotidy) RibozymyProtismyslné oligonukleotidy http://gslc.genetics.utah.edu/units/genetherapy/gtapproaches/ Terapeutický gen– vektor – cílová buňka Nástroje pro editaci genů •Zinc Fingers (ZFN) •TALENs •CRISPR/Cas9 Vytváří dvouřetězcové zlomy DNA a jejich oprava není přesná – mutovaný, nefunkční gen CRISPR – Cas9 systém Ledford.2016. Nature 531. 156-159. Systém umožňující adaptivní imunitu u bakterií. Umožňuje zapamatování si virové DNA a po jeho opětovném ataku CRISPR RNA naváděcí sekvence tuto DNA rozpozná a navede na ni enzym Cas9, který ji štěpí. Opravy takto naštěpené DNA vedou k mutacím. Podobně se dá vytvořit naváděcí sekvence k určitému genu a systém použít k jeho inaktivaci, nebo naopak aktivaci, nebo vložení určité sekvence…… Naváděcí sekvence RNA + enzym Cas9 nebo podobný (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) CRISPR – Cas9 systém Ledford.2016. Nature 531. 156-159. (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Inhibice – Cas9 je nefunkční, ale brání vazbě RNA polymerázy Aktivace – na nefunkční Cas9 je navázán protein stimulující expresi daného genu Inducibilní – aktivita Cas9 může být regulována jiným proteinem nebo chemikálií (světlo, doxyciklin) Kandidáti genové terapie • Klasické genetické choroby Vrozené vady metabolismu –Fenylketonurie –Hemofilie A,B –Poruchy srážlivosti –Poruchy imunity – ADA deficience –Cystická fibroza… •Komplexní genetické choroby Rakovina Kardiovaskulární choroby Neurodegenerativní choroby Diabetes…. • Získané genetické vady – virové nemoci (EBV, HBV, HIV) Genové transportní systémy • Nevirové – Mechanické – mikroinjekce, particle bombardment - biobalistika, elektroporace, ultrazvuk – Liposomy (13%) - lipofekce – Receptorem umožněný transport (liganda)- Transferin – Polykationty • Virové – retroviry – Adenoviry – AAV – Lentiviry – Vaccinia virus – Herpes viry (HSV, EBV) – Papovaviry (SV 40) Transgen – vnášený gen Porovnání vektorů Vektor Výhody Nevýhody Retroviry Stabilní exprese, relativně bezpečný po odstranění vlastních genů Vyžaduje dělící se bb, náhodná integrace, nízký titr Adenoviry Všechny typy bb Vysoký titr Toxicita (virové geny), imunitní odpověď AAV Bezpečný (odstranění virových genů), všechny bb, stabilní exprese Menší inzert pracné Liposomy Absence viru Větší DNA Nestálé, nedostatečný transport do jádra Genom retroviru Geny pro kapsidu, polymerázu, obal Může obsahovat i onkogen Signál pro obalení viru „psí“ LTR LTRψ Repetitivní sekvence – obsahují silné promotory a enhancery, umožňují inzerci „krotký“ (terapeutický) virus – obsahuje požadovaný gen, je schopen tvořit virové částice, není schopen replikace „pomocný“ virus- není schopen tvořit virové částice, ale obsahuje geny důležité pro vytvoření virové částice a tím pomáhá v replikaci „krotkého viru“ Retrovirový vektor ψLTR LTR LTR LTR Packaging cell – „balící buňka“ PACIENT •Dr. W. French Anderson National Heart, Lung and Blood Institute •Září 1990 1. klinický experiment (SCID, deficience ADA) – 4 letá holčička Ashanti DeSilva (NIH), Tlymfocyty, transformovány retrovirovým vektorem – terapie ex-vivo Zdroj: http://www.pbs.org/newshour/bb/health/july-dec99/gene_therapy_splash.htm# X-SCID (Severe Combined Immunodeficiency Syndrom)- „Bublinové děti“ • Nefunkčnost –T i B lymfocytů (chybění g-c-řetězce a ztráta cytokinového receptoru) • Infekce • Klasická léčba - transplantace HLA-identické kostní dřeně • Po genové terapii (T-lymfocytů) 9 z 11 dětí zlepšení •Jsou schopny žít doma, ne pouze ve sterilním stanu • Mají normální počet T lymfocytů CD4 i CD8 • Odpovídají normálně na vakcinaci (diphtheria, tetanus, polio – produkce T lymfocytů a protilátek). • Produkce pl, je normální nepotřebují infuze imunoglobulinu R. Michael Blaese, MD with Ashanthi DeSilva (left) and Cindy Kisik at the IDF 2013 National Conference, June 29. https://primaryimmune.org/first-gene-therapy-patients-attend-conference/ Genová terapie v praxi – země, nemoci •Do r. 2012 – 1843 klinických protokolů genové terapie v 31 zemích Ginn et al., J Gene Med 2013; 15: 65–77. Kerstin B. Kaufmann et al.EMBO Mol Med (2013) 5, 1642–1661 • Léčiva na bázi genové terapie • 2004 – Čína Gendicine C – adenivirus p53 – skvamózní Ca hlavy a krku • 2012 -Evropa- Glybera (alipogene triparvovec) - familiární deficience lipoprotein lipázy AAV • 2017 – Luxturna – dědičná slepota, mustace v RPE65 genu https://luxturna.com/ Genová terapie v praxi Genová terapie vs. genetická chirurgie • Genová terapie - geny mají za úkol zasáhnout nebo opravit určitou molekulu zásadní pro existenci nádorové buňky • Genetická chirurgie – cílem je destrukce nádoru jako takového využívá vlastnosti společné pro všechny nádory • Onkolytické viry – sebevražedná GT • Anti-angiogenní therapie • Viroterapie – oncolytické viry (reoviry) • Onkolytické vektory – roznáší protinádorové geny • RNA interference Inhibice overexprimovaných genů (onkogenů), nebo dopravení v nádoru inaktivovaného genu (tumor-supresor) Destrukce nádoru a metastáz onkolytickými viry nebo sebevražednými geny Strategie genové terapie Strategie genetické chirurgie Řízená sebevražda buňky – VDEPT viral directed enzyme production therapy 2. Gancyklovir „prodrug“ HSV-TK 4. Smrt buňky 1. Gen HSV-TK Vpraven specifickým vektorem za specifickým promotorem do nádorové bb 3. GCV triphosphate Toxický – terminace syntézy DNA, DNA fragmentace Gancyklovir – analog nukleosidů - je HSV -TK, fosforylován na monofosfát, který je dále dotvořen buněčnými kinázami na trifosfát -vysoce toxický, protože blokuje syntézu DNA. Rizika a problémy GT •Onkoviry jako vektory •Geneticky manipulované bb Přenos virových genů i onkogenů, virem indukovaná mutageneze Imunitní odpověď vůči proteinům virových vektorů Problémy s udržením hladiny genové exprese Francie 2002 – terapie kmenových bb kostní dřeně Říjen – prosinec 2002!!! děti s X-SCID léčené genovou terapií leukémií T-buněk– leukémie - LMO2 gen V 5 případech z 20 – leukémie Rizika a neúspěchy GT září 1999: USA– zemřel mladík s částečným vrozeným deficitem OTC (ornithine transcarbamylase) – aplikována velká dávka adenovirových částic s OTC genem -zhoršení druhý den po aplikaci- další den upadl do komatu- syndrom akutní respirační tísně - dva dny později smrt na multiorgánové selhání způsobené anoxií. Syndrom systémové zánětlivé reakce (SIRS) ačkoli byl virus aplikován do jedné z jaterních cév a měl zůstat v jaterní tkáni, byl nalezen i v ostatních orgánech. $ 517000 finanční vyrovnání rodině pacienta, restrikce lékařům, kteří výkon provedli – snížení investic do GT LMO2 = LIM domain transcription regulator angiogeneze Molekulárně cílená terapie • Inhibitory tyrosin kináz • Anti-angiogenní a antimetastatické látky • Inhibitory signální transdukce • Inhibitory růstových faktorů a jejich receptorů (VEGF a VEGFR; EGFR) • mTOR inhibitory • Inhibitory proteasomu • Inhibitory CDK • Inhibitory Bcl-2 •Cytotoxické látky používané v terapii rakoviny za účelem postihnout molekulární dráhy zodpovědné za kancerogenezi a udržení nádorového fenotypu. •Terapie, která cíleně ovlivňuje pouze rakovinné buňky s minimálním účinkem na buňky normální •Mírnější nežádoucí účinky než klasická chemoterapie. Protilátky Molekulárně cílená terapie– Biologická terapie Biologická terapie (imunoterapie, bioterapie) Protinádorové vakcíny – stimulují nebo restaurují schopnost imunitního systému postihnout nádor. 2 typy: 1) Preventivní (profylaktické) vakcíny - prevence rakoviny u zdravých. 2006 - the U.S. Food and Drug Administration (FDA) vakcína Gardasil® (Silgard)- chrání proti infekci HPV (human papiloma virus) — způsobuje asi 70 % Ca čípku děložního Cervarix® - Evropa 2) Léčebné (terapeutické) vakcíny - léčí rakovinu posílením imunitní reakce. Oslabené nebo usmrcené nádorové buňky nesoucí nádorový antigen. Vlastní pacientovy buňky - autologní vakcína Buňky jiných pacientů - allogenní vakcína - Terapie melanomu. Protilátky v léčbě nádorů Imunokonjugáty (imunotoxiny) Protilátky (monoklonální) konjugovány s cytotoxickou látkou, radioisotopem nebo toxin aktivujícím enzymem za účelem jejich dopravení do nádorové buňky. „Nosiče“ – dopravují cytotoxickou molekulu do nádorových buněk, aniž by poškodily bb normální. • Monoklonální pl po vazbě na nádorovou bb mohou: • Zviditelnit nádorovou buňku pro imunitní systém. Rituxan váže se na CD20 antigen na povrchu B lymfocytů - označuje je pro reakci imunitního systému – léčba leukémií • Blokovat receptory růstových signálů. Cetuximab (Erbitux) - Ca střev, krku a hlavy, váže se na receptory epidermálního růstového faktoru. • Dopravení radiace do nádorových bb - vazba radioaktivní částice na monoklonální protilátku - Ibritumomab (Zevalin) - nonHodgkinův lymfom • Dopravení chemoterapeutik do nádorových bb - Gemtuzumab váže se na specifické receptory leukemických buněk. Protilátky v léčbě nádorů Kerstin B. Kaufmann et al.EMBO Mol Med (2013) 5, 1642–1661 Kmenové buňky jako mediátory genů v genové terapii Použití pro obnovu funkce tkání - nosiče, které dopravují komplexní signály do cílových tkání Budoucnost – léčba iPSC kombinováná s genovou terapií ?! iPSC Nobelova cena 2012 Shinya Yamanaka Transkripční faktory Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 Three dimensional structure of a protein whose activity is implicated in certain cancers. At right is a close-up view of the structure with a bound inhibitory drug (potential chemotherepeutic). „Rational drug design“ racionální návrh inhibitorů, Chemická genetika Strukturní biologie Počítačová metoda („in silico“) – kombinuje strukturní determinaci a počítačové modelování za účelem identifikace malé molekuly, komplementující se zbytky AMK v aktivním místě enzymu 3D – rekonstrukce Léky na AIDS (Argenase, Viracept) vyvinuty na základě krystalické struktury HIV- proteázy Léky na rakovinu – Gleevec (Imatinib; BCR-ABL), Tarceva (EGFR) Léky na chřipku - Relenza, Tamiflu – krystalická struktura neuraminidazy Malé molekuly, inhibitory kináz Post-genomická éra a personalizovaná medicína Post-genomická éra • 2003 – HUGO • Asociační genomické studie (Genome-wide association studies - GWAS) • Jednonukleotidový polymorfismus (SNP single nucleotide polymorphism) • Personalizovaná medicína • Farmakogenetika Asociační genomické studie (GWAS) :. Studie zabývající se variacemi lidského genomu zaměřené na identifikaci genů asociovaných s určitými znaky nebo výskytem určitých chorob nebo naopak odolností proti těmto chorobám. Lidský genom obsahuje: - 21 000 genů kódujících proteiny - 2 850 genů pro monogenní mendelistické choroby - 1 100 lokusů ovlivňujících 165 polygenních chorob - 230 genů souvisejících s rakovinou E. S. Lander (2011) : Nature 470. 187-197. Perzonalizovaná medicína „It’s far more important to know what person the disease has than what disease the person has.“ – Hippocrates Navržení léčby na míru jednotlivým pacientům založené na porozumění molekulárním mechanismům choroby a vyšetření pacienta metodami molekulární biologie. The Case for Personalized Medicine 4th Edition | 2014 Paving the Way for Personalized Medicine: FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development . FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development Perzonalizovaná medicína Farmakogenetika Paving the Way for Personalized Medicine: FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development . FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development Perzonalizovaná medicína % pacientů, u kterých dané léky nezabírají Trastuzumab (Herceptin®, Genentech, Inc.) - Robert Weinberg 1979 objev “HER-2” (human epidermal growth factor receptor 2) genu, jehož produkt je zúčastněn v několika drahách řídících růst nádorů - onkogen. 20 let studia Dennis Slamon - Overexprese HER2 se objevuje u 20-25% nádorů prsu, Květen 1998, meeting American Society for Clinical Oncology (ASCO), Slamon presentoval Herceptin – protilátku pro léčbu HER2 pozitivních nádorů – revoluční okamžik – první molekulárně cílená terapie - vypnutí funkce HER2 genu a zpomalující růst nádoru, aniž by poškozovala zdravé tkáně. Září 1998, FDA potvrdila Herceptin pro terapii HER2 pozitivních nádorů prsu. Ve stejný den uveden do praxe HercepTest (DAKO), in vitro assay detekující HER2 overexpresi = zároveň vyvinut cílený lék a cílená diagnostika nemoci U pacientek bez mutace HER2 je lék neúčinný, nebo může průběh nemoci zhoršit!!! Paving the Way for Personalized Medicine: FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development . FDA’s Role in a New Era of Medical Product Development Cílená terapie a diagnostika Vemurafenib (Zelboraf) srpen 2011, FDA současně zavedla vemurafenib (Zelboraf) společně s Cobas 4800 BRAF V600E mutation testem, pro léčbu metastatického melanomu. Vemurafenib inhibuje BRAF V600E mutaci, ta se vyskytuje asi u 50% pacientů s melanomem. Všechny nádory nejsou stejné – ani na nádory 1 orgánu není možno pohlížet jako na 1 nemoc!!! http://www.biopticka.cz/cz/sluzby/molekularni-genetika/diagnostika/HER2- neu.php# Nádory se specifickou mutací The Case for Personalized Medicine 4th Edition | 2014 Výhody perzonalizované medicíny The Case for Personalized Medicine 4th Edition | 2014 The Case for Personalized Medicine 4th Edition | 2014 Léky gb PHARM Warfarin Genetické testy The Case for Personalized Medicine 4th Edition | 2014 gb PHARM Warfarin Perzonalizovaná medicína – genomebased medicine http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMp1006304 http://www.genetherapynet.com/societies.h tml http://www.fda.gov/biologicsbloodvaccines /cellulargenetherapyproducts/default.htm