Úvod do biologie nádorové buňky Stjepan Uldrijan Biologický ústav Lékařská fakulta Masarykova Univerzita Brno uldrijan@med.muni.cz http://foto.tvojeimage.cz/fotogalerie/deti/Adsc09331sm.jpg/view http://badattitudes.com/MT/archives/2009/02/speaking_as_an.html Jednobuněčné x mnohobuněčné organismy http://www.pomoooc.estranky.cz/clanky/listerioza/listerioza-a-jeji-prevence Během života proběhne v lidském těle asi 1016 buněčných dělení (10 000 000 000 000 000!!!) a každé z těchto buněčných dělení by mohlo vést ke vzniku zhoubného nádoru, pokud by se vymklo kontrole. x http://www.profimedia.cz • Benigní (nezhoubné) nádory - Rostou lokalizovaně a neinvadují přilehlé tkáně - Epiteliální nádory považujeme za nezhoubné, pokud nejsou schopny penetrovat bazální membránu (specializovaný typ buněčné matrix, který odděluje epiteliální buňky od podpůrné vrstvy pojivové tkáně – stroma) -Některé nezhoubné nádory se mohou rozvinout v nádory maligní • Maligní (zhoubné) nádory - Prorůstají do okolních tkání a mohou se šířit ve formě metastáz - Primární nádor x metastázy Základní dělení nádorů Retinoblastom Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Nádory narušují normální architekturu tkání A B A: Jaterní metastázy karcinomu tlustého střeva B: Metastázy maligního melanomu do plic (myší model) Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Metastázy maligních nádorů jsou zodpovědné za asi 90% všech úmrtí na nádorová onemocnění Nádory jsou klony pocházející z jedné původní aberantní buňky Primární nádor Metastáza 1. mutace 2. mutace 3. mutace 4. mutace atd. Buňky kumulují mutace, které jim poskytují růstové výhody Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Příklad růstové výhody – ztráta kontaktní inhibice při transformaci kuřecích fibroblastů virem Rousova sarkomu A: Normální fibroblasty rostou pouze v jedné vrstvě (“monolayer”). Je tomu tak proto, že u nich funguje tzv. kontaktní inhibice, tj. zástava dělení vzájemně se těsně dotýkajících buněk. Naproti tomu fibroblasty infikované RSV se zakulatí a ztrácí kontaktní inhibici, tj. dělí se dále, přestože se vzájemně těsně dotýkají. B: Transformace indukovaná RSV (normální fibroblasty vlevo, fibroblasty transformované RSV vpravo) A B 1. Proto-onkogeny / Onkogeny – v nádorových buňkách dochází k jejich aktivaci. • Kódují proteiny, které se účastní přenosu různých signálů v buňce a regulují buněčné dělení nebo diferenciaci. • Mutace nebo zvýšená exprese (produkce) těchto proteinů vede k nadměrnému zvýšení jejich aktivity v buňce (proto-onkogen se mění na onkogen) Příklady: EGFR, Ras, Raf, Src, Myc 2. Nádorové supresory – v nádorech dochází k vyřazení jejich funkce • Zabraňují množení poškozených nebo neregulovaně rostoucích buněk. • Jiné n.s. se podílí na opravách poškozené DNA a zabraňují akumulaci mutací v buňkách. Příklady: p53, p16, Rb, APC, MLH1, MSH2, BRCA1, BRCA2 Geny nejčastěji postižené mutacemi v nádorových buňkách Ke vzniku maligního nádoru je u člověka třeba 4-6 mutací ! Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 Všechny maligní nádory musí během svého vývoje získat několik důležitých vlastností a schopností (růstových výhod) Inhibice apoptózy Růst za nepřítomnosti vnějších růstových signálů Invaze do okolní tkáně a tvorba metastáz Indukce angiogeneze Neomezené dělení Růst v přítomnosti inhibičních signálů Příklady signálních drah, které regulují buněčnou proliferaci a mohou být mutovány v nádorových buňkách Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 U normálních buněk rozhodují signály z vnějšího prostředí o tom, jestli se v G1 fázi buněčného cyklu zastaví, nebo budou pokračovat do S fáze Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Přítomnost růstových signálů umožní normální buňce ukončit G1 a přejít do S fáze. Za absence růstových (mitogenních) faktorů nebo v přítomnosti faktorů inhibujících růst (např. TGFβ) buňky opustí buněčný cyklus a vstupují do tzv. G0 fáze Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. Autokrinní růstové faktory I. Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Autokrinní růstové faktory • Normální buňky obvykle neprodukují růstový faktor, jehož receptor nesou na svém povrchu • Nádorové buňky někdy aktivují expresi genu, jenž takový růstový faktor kóduje a začnou jej produkovat. Tím samy sebe stimulují k růstu a dělení (autokrinní signalizace). Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. Autokrinní růstové faktory II. Receptorové tyrozin kinázy I. II. Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 • Za normální situace receptor aktivuje buněčné signální dráhy jen pokud je na něj navázaný specifický ligand (růstový faktor, growth factor –GF) • Mutace v genu kódujícím receptor mohou způsobit, že receptor je aktivní neustále, i za nepřítomnosti růstového faktoru Mutace receptorových tyrosin kináz http://www.interpharma.ch/biotechlerncenter/_downloads/img_herceptin.gif Herceptin (trastuzumab) – monoklonální protilátka určená pro léčbu HER2+ nádorů, tj. nádorů produkujících nadměrné množství receptoru pro epidermální růstový faktor ErbB2. Herceptin inhibuje funkci receptoru a současně označuje buňky nádoru a ty pak mohou být lépe rozeznány imunitním systémem pacienta HER2+ nádory – příklad možné cílené léčby maligních nádorů Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. Autokrinní růstové faktory II. Receptorové tyrozin kinázy III. Malé G-proteiny: onkogen Ras I. II. III. Aktivace receptorové tyrozin kinázy umožní sestavení proteinového komplexu, který aktivuje protein Ras Lynda Chin Nature Reviews Cancer 3, 559-570 (August 2003) Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 N * Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. II. III. IV. I. Autokrinní růstové faktory II. Receptorové tyrozin kinázy III. Malé G-proteiny: onkogen Ras IV. Kináza Raf B-Raf - serin/threonin kináza, která se podílí na přenosu mitogenních signálů v buňce - mutován v různých typech nádorů, např. karcinomu ovarií, štítné žlázy, kolorektálním karcinomu a zejména v asi 70 % případů maligního melanomu - k mutacím v genu B-Raf dochází již v ranné fázi vývoje maligního melanomu (jsou přítomny v asi 80% benigních névů) Lynda Chin Nature Reviews Cancer 3, 559-570 (August 2003) http://www.diseaseaday.com/wp-content/uploads/2009/03/melanoma.jpg http://www.lib.uiowa.edu/hardin/MD/dermnet/melanoma1.html * Dráha ERK je v nádorech aktivována mutacemi * * VEMURAFENIB Rezistence nádorových buněk: Během několika měsíců se metastázy opět objeví a na léčbu již nereagují.. Potřeba testovat nové přístupy k léčbě nádorů neodpovídajících na terapii. PET scan: Pacient s metastázami maligního melanomu před léčbou a po dvoutýdenní léčbě vemurafenibem Cílená léčba maligního melanomu - inhibice kinázy BRAF VEMURAFENIB Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. Autokrinní růstové faktory II. Receptorové tyrozin kinázy III. Malé G-proteiny: onkogen Ras IV. Kináza Raf V. Nereceptorové tyrozin kinázy I. II. V. III. V. IV. Příklad cílené terapie - inhibice kinázy Abl u CML Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Tzv. Filadelfský chromozóm je detekován ve více než 95% případů chronické myeloidní leukémie (CML). Reciproční translokace mezi chromozomy 9 a 22 vede k tvorbě fúzního proteinu BcrAbl, který si zachovává svoji kinázovou aktivitu, ale tato aktivita není správně regulována. www.antigenics.com/diseases/cml.html http://rebeccanelson.com/leukemia/cml.html Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Na Gleevec odpovídá až 90% pacientů v chronické fázi CML, postupně se však u buněk CML může vyvinout rezistence. Model kinázy Abl Příklady buněčných onkogenů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70, Adapted I. II. V. III. V. IV. VI. VI. VI. I. Autokrinní růstové faktory II. Receptorové tyrozin kinázy III. Malé G-proteiny: onkogen Ras IV. Kináza Raf V. Nereceptorové tyrozin kinázy VI. Transkripční faktory Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Amplifikace genu N-myc u neuroblastomu A B A: Gen N-myc je amplifikován v asi 40% případů neuroblastomu. B: Prognóza onemocnění je velmi dobrá u dětí, které mají v buňkách neuroblastomu jen minimální nebo vůbec žádnou amlifikaci genu N-myc. Naopak pacienti s výraznou amplifikací genu N-myc mají výrazně horší prognózu. Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Nadměrná exprese genu c-myc u Burkittova lymfomu V genomu buněk Burkittova lymfomu je exprese genu c-myc řízena regulačními sekvencemi DNA, které normálně zajišťují silnou expresi těžkého řetězce imunoglobulinu. Příčinou je reciproká translokace mezi chromozómy 8 a 14. - Maligní nádor B-lymfocytů - Nejčastější dětský nádor v rovníkové Africe - Na vzniku choroby se podílí chronická infekce virem Epsteina-Barrové (EBV = lidský herpesvirus 4, způsobuje infekční mononukleózu) a současně parazity způsobujícími malárii Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 Všechny maligní nádory musí během svého vývoje získat několik důležitých vlastností a schopností (růstových výhod) Inhibice apoptózy Růst za nepřítomnosti vnějších růstových signálů Invaze do okolní tkáně a tvorba metastáz Indukce angiogeneze Neomezené dělení Růst v přítomnosti inhibičních signálů Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 Všechny maligní nádory musí během svého vývoje získat několik důležitých vlastností a schopností (růstových výhod) Inhibice apoptózy Růst za nepřítomnosti vnějších růstových signálů Invaze do okolní tkáně a tvorba metastáz Neomezené dělení Růst v přítomnosti inhibičních signálů Indukce angiogeneze • Kyslík se v tkáních přenáší difuzí účinně do vzdálenosti asi 0,2 mm. Buňky, které rostou ve větší vzdálenosti od krevní vlásečnice přestávají růst protože trpí nedostatkem kyslíku (hypoxie) a živin. Pokud není přísun kyslíku zajištěn, buňky odumřou. • Primární nádor nebo metastáza, která dosáhne objemu asi 2 mm3 si musí zajistit napojení na krevní oběh, aby mohla pokračovat v růstu. • Buňky v hypoxii vysílají signál ve formě VEGF (vascular endotheliar growth factor). • VEGF se váže na specifický receptor na povrchu buněk cévního endotelu a indukuje jejich proliferaci a migraci směrem k nádoru. VEGF VEGF ale není jediným regulátorem angiogeneze. Rozsah tvorby nových krevních cév záleží na rovnováze těchto faktorů v dané tkáni. Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 http://www.interpharma.ch/biotechlerncenter/_downloads/img_avestin.gif Avastin (bevacizumab) Chaotické uspořádání cév zásobujících nádor je způsobeno deregulací mechanismů zodpovědných za jejich růst (nadměrná produkce VEGF buńkami nádoru) Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100:57-70 Všechny maligní nádory musí během svého vývoje získat několik důležitých vlastností a schopností (růstových výhod) Inhibice apoptózy Růst za nepřítomnosti vnějších růstových signálů Invaze do okolní tkáně a tvorba metastáz Neomezené dělení Růst v přítomnosti inhibičních signálů Indukce angiogeneze Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Normální buňky mají omezený replikační potenciál, tzn. že se nemohou dělit do nekonečna Např. lidské fibroblasty se v kultuře intenzivně dělí po asi 60 generací a pak se dělit přestanou a vstoupí do stavu,kterému se říká (replikativní) senescence, kdy sice zůstávají životaschopné po velice dlouhou dobu, ale buněčný cyklus navždy opustily. Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 A B A: Pre-senescentní lidské fibroblasty, které se normálně dělí B: Senescentní buňky změní tvar a začnou produkovat některé markery senescence, například zvláštní formu β-galaktosidázy, enzymu, jehož přítomnost můžeme v buňkách snadno detekovat pomocí chromogenního substrátu (modré zbarvení buněk) Senescence vede k výrazné změně morfologie buňky Buněčný cyklus je řízen komplexy cyklinů s cyklin-dependentními kinázami Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 • Každý typ cyklinů interaguje se specifickou cyclin-dependentní kinázou (CDK) • CDK fosforylují cílové proteiny na aminokyselině serinu nebo threoninu • Vazba cyklinu zvyšuje enzymatickou aktivitu CDK, např. navázání cyklinu A na CDK2 zesílí aktivitu of CDK2 400000 x ! • Inhibitory CDK jsou proteiny, které se vážou na CDK a inhibují jejich kinázovou aktivitu • Tyto inhibitory jsou indukovány různými signálními drahami. Např. p15 je indukován TGFβ a umožní vstup do G0, p16 se podílí na indukci senescence, p21 je indukován nádorovým supresorem p53 při poškození DNA Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Např. fibroblasty v kultuře začínají produkovat dva důležité inhibitory cyklin-dependentních kináz, které jsou schopny inhibovat dělení buněk: p21 a p16 K senescenci zřejmě vede postupné zvyšování exprese některých inhibitorů CDK • Uměle indukovaná exprese proteinu p16 ve fibroblastech vede u těchto buněk ke stejným změnám, jaké pozorujeme při replikativní senescenci. • Nádorové buňky expresi p21 a p16 ztrácí a zřejmě právě tímto způsobem dokáží senescenci zabránit Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Počet dělelní buněk také omezuje délka jejich telomer • Telomery jsou tvořeny několika tisíci opakováními krátké sekvence DNA (6 bp) • Funkcí telomer je ochrana konců chromozomů (A) • DNA polymeráza nedokáže účinně replikovat konce chromozomů a tak dochází při každém rozdělení buňky ke ztrátě asi 50-100 bp z konce telomer • Příliš krátké telomery nedokáží plnit svou ochrannou funkci a chromozomy začínají fúzovat (B) a buňky vstupují do tzv. stavu krize (anglicky crisis). • Fúzované chromozomy se nedokáží oddělit během mitózy a dochází ke zlomům, které vedou k velkým změnám karyotypu a obvykle končí programovanou smrtí buňky (apoptózou) Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Krátké telomery mohou vést k opakovaným fúzím a zlomům chromozomů Duesberg P, Chromosomal Chaos and Cancer, Scientific American 2007 May;296(5):52-9. Příklad karyotypu normální a nádorové buňky Figure 11.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Vývoj rakoviny je postupný pomalý proces, často trvající desítky let Ke vzniku maligního nádoru je u člověka třeba 4-6 mutací ! 0 10 000 20 000 30 000 40 000 50 000 60 000 under15 15-24 25-34 35-44 45-54 55-64 65-74 75+ Age at diagnosis Numberofnewcases 0 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 Rateper100,000population Male cases Female cases Male rates Female rates Figure 2.1: Number of new cases and rates, by age and sex, all malignant neoplasms (exc NMSC), UK, 2006 http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/incidence/age/ Rakovina je převážně nemocí vyššího věku Figure 11.8a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 11.10 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Kumulace mutací a progrese adenokarcinomu střeva Mutace vedoucí ke vzniku nádorů Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 1. Somatické mutace – vynikají de novo v somatických buňkách a mění jejich vlastnosti. Přenáší se do dceřiných buněk, ale nedědí se. 2. Zárodečné mutace – vznikají v genomu spermie nebo vajíčka, nebo jejich prekurzorů v gonádách. Mutace se mohou přenášet na potomstvo a mohou predisponovat k různým typům nádorů. A B A: Stěna tlustého střeva jedince postiženého familiální adenomatózní polypózou (obvykle způsobena zárodečnými mutacemi v nádorovém supresoru APC). B: Normální tlusté střevo Figure 11.8a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Figure 11.10 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Kumulace mutací a progrese adenokarcinomu střeva Nádorový supresor p53 a kontrola buněčné odpovědi na stresové podněty p53 je transkripční faktor, který reguluje odpověď na různé stresové podněty Vousden & Lane 2007, Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 275-83 Li-Fraumeni syndrom • Dědičný nádorový syndrom • Postižení jedinci nesou mutace v genu pro p53 • Jsou náchylní k celé řadě různých nádorů: sarkomy, nádory mozku, prsu, plic atd. • Některé z těchto nádorů se objevují již v dětství nebo v průběhu dospívání Indukce p53 a zástava buněčného cyklu při poškození DNA ionizujícím zářením Poškození DNA indukuje rychlou stabilizaci p53 a indukci exprese cílových genů, např. inhibitoru CDK p21, což vede k zástavě buněčného cyklu, která umožní opravy poškozené DNA Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007, Adapted Thymocyty (leukocyty v brzlíku) myši s vyřazeným genem p53 jsou rezistentní k apoptóze vyvolané ionizujícím zářením Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 3. Nadměrnou expresí buněčných inhibitorů p53 (např. Mdm2, MdmX) • negativně ovlivňují stabilitu a transkripční aktivitu p53 1. mutací v genu pro p53 (asi 40-50% lidských nádorů) 2. Expresí virových proteinů Virus Onkoprotein inhibující pRb Onkoprotein inhibující p53 Papilomavirus (HPV16, HPV18) E7 E6 V nádorech je obvykle vyřazena funkce nádorového supresoru p53: In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-Molecule Antagonists of MDM2 Lyubomir T. Vassilev, Binh T. Vu, Bradford Graves, Daisy Carvajal, Frank Podlaski, Zoran Filipovic, Norman Kong, Ursula Kammlott, Christine Lukacs, Christian Klein, Nader Fotouhi, Emily A. Liu Science 303, 844 (2004) Příklad cílené terapie pro nádory exprimující nadměrné množství Mdm2 http://www.bioscience.org/2008/v13/af/3175/figures.htm • Zhoubné bujení může postihnout mnoho různých buněčných typů - Existuje více než 100 různých typů nádorů • I v rámci jednoho typu nádoru může k jeho vzniku vést celá řada různých mutací, což komplikuje cílenou léčbu Rakovina není jedno onemocnění ! Problém včasné detekce onemocnění: Nádor o velikosti 1 cm3 obsahuje asi 109 buněk! Příklady karyotypů tří různých buněčných linií karcinomu plic http://www.path.cam.ac.uk/~pawefish/cell%20line%20catalogues/ lung-cell-lines.htm Není možné nalézt univerzální lék pro léčbu všech zhoubných nádorů ! Význam prevence !!! Pravděpodobnost onemocnění nejčastějšími zhoubnými nádory je významně ovlivněna stravou, životním stylem a dalšími faktory životního prostředí Weinberg RA. The biology of cancer, Garland Science 2007 Figure 11.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Rakovina plic bývala velice vzácným nádorovým onemocněním !!! Nárůst počtu úmrtí na rakovinu plic opožděn za nárůstem spotřeby cigaret o 30 let !!! Děkuji Vám za pozornost… Robert A. Weinberg