Krevní buňky a principy jejich vyšetřování na hematologických analyzátorech a mikroskopicky Bourková L., OKH FN Brno Příklady webových stránek •hematologický atlas –http://www.hematocytologie.eu/ –http://www.hematologyatlas.com/ –http://www.grsmu.by/files/file/university/cafedry/klinicheskaya-immynologiya/files/fiu/atlas.pdf •RBC –https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=erythroblasts& oq=erythrob&gs_l=img.1.3.0i19l10.6606.9583.0.12410.8.8.0.0.0.0.68.208.8.8.0....0...1ac.1.64.img..0. 8.201.NRIoSeIUgdk –http://www.sekk.cz/infoservis/2006_Morfologie_erytrocytu.pdf •WBC https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=leukocytes&oq=l eukocy&gs_l=img.1.2.0l3j0i30l7.1937.12377.0.15795.7.6.0.1.1.0.244.565.5j0j1.6.0....0...1ac.1.64.img ..0.7.577.pvdZx9LlCHk •PLT https://www.google.cz/search?hl=cs&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw=1280&bih=908&q=platelets&oq=pl atelets&gs_l=img.1.0.0i19l10.1770.5225.0.7869.9.7.0.2.2.0.207.325.6j0j1.7.0....0...1ac.1.64.img..0. 9.349.CiouVP0aXo0 Vyšetřování krevních buněk v periferní krvi Ønesrážlivá periferní krev Øantikoagulační činidlo: K3EDTA, K2EDTA nebo Na2EDTA Øvyšetření: ühematologické analyzátory ümikroskop Ø – http://ruby.fgcu.edu/courses/hogedegb/80026/Hem01Lab1a_files/image032.gif •myeloblast •promyelocyt •neutrofilní •myelocyt •eozinofilní •myelocyt •bazofilní •myelocyt •neutrofilní •metamy •eozinofilní •metamy •bazofilní •metamy • •neutrofilní •tyč •eozinofilní •tyč • •neutrofilní •segment • • •bazofilní •segment •proerytroblast • •středně zralý erytroblast •(polychromní normoblast) •pozdní erytroblast •(ortochromní/oxyfilní normoblast) •retikulocyt •erytrocyt •monoblast •promonocyt •monocyt •magakaryoblast •promegakaryocyt •megakaryocyt •trombocyty •lymfoblast •prolymfocyt •lymfocyt •bazofilní •tyčí •eozinofilní •segment •časný erytroblast •(bazofilní normoblast) •PERIFERNÍ KREV •KOSTNÍ DŘEŇ •plazmat. b. •makrofág C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\AL1\A0070392BB_033.jpg promyelo3 C:\Users\3840\Documents\Cíl-Databáze-10-12\F4\A00717R6DB_057.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\MP4-baso\A0068645BB_012.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_052.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_014.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_025.jpg C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_047.jpg Leukocyty blast promyelocyt myelocyt meatamyelocyt neutrofilní segment eozinofilní segment bazofilní segment lymfocyt lymfocyt monocyt C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F7\8403699442_021.jpg neutofilní tyč proerytroblast1 NRBC-baso,poly,oxy C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F1\A0010172DA_001.jpg mgk-8 aniso 01 Erytrocyty Trombocyty proerytroblast bazofilní NRBC polychromní NRBC oxyfilní NRBC C:\Users\3840\Documents\Databáze-Dif-KO_10-13\F3\8403637449_050.jpg oxyfilní NRBC megakaryocyt Hematologické analyzátory https://www.sysmex.com/us/en/Company/News/PublishingImages/2013_summer_XN-3000_DI-60.jpg https://www.beckmancoulter.com/ucm/idc/groups/public/documents/webasset/glb_bci_052106.jpg http://www.interbiolab.com/wp-content/uploads/2014/07/CD-Sapphire-1.jpg Principy měření hematologických analyzátorů Øhydrodynamická fokusace Øprincipy měření: üimpedanční analýza üoptická analýza –kombinace různých principů analýzy Øspektrofotometrická analýza hemoglobinu •Principy měření umožňují vyšetření: Økvantitativní – počet buněk Økvalitativní – morfologie buněk ütvar buňky ütvar a velikost jádra üobsah cytoplazmy Hydrodynamická fokusace Øusměrnění buněk proudem nosné izotonické kapaliny (diluent) při průchodu měřícím kanálem „po jedné“ http://www.selectscience.net/images/hydrodynamic-focussing.jpg Impedanční analýza Øředění buněčné suspenze üdiluent - vodivý ükrevní buňka – nevodivá Øprůchod buněk mezi elektrodami (stejnosměrné elektrické pole) → impulz üpočet impulzů = počet buněk üvelikost impulzů = velikost buněk Ømožné doplnění vysokofrekvenční analýzou üna buňku superponováno vysokofrekvenční elektrické pole üanalýza vysokofrekvenčního napětí buňky = morfologie buňky • Ø http://eu.idexxbioresearch.com/images/research-analyzers/procyte-laminar-flow-impedance.png http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto2/6/coulter/si000277.gif http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto2/6/coulter/si000276.gif Optická analýza Øředění buněčné suspenze üdiluent – opticky inaktivní ükrevní buňka – opticky aktivní Øinterakce buněk s monochromatickým laserovým paprskem Øpo interakci buňky s paprskem se provádí analýza: üprošlého světla (0°) üodraženého světla üdepolarizovaného světla üfluorescence ocytochemické barvení enzymu (peroxidáza) v buňkách, doplňková analýza absorbce a rozptylu světla dle stupně probarvení cytoplazmy (u některých typů přístrojů) Øvyšetření: ükvantitativní a velikost buňky → detekce ve směru (0°) ükvalitativní/morfologie buňky → detekce odraženého a depolarizovaného světla, fluorescence, případně kombinace s cytochemickou analýzou Ø Ø http://flowcytometry.med.ualberta.ca/wp-content/uploads/2015/04/Flow-Cytometry-how-it-works-Diagram .jpg http://www.eclinpath.com/wp-content/uploads/rbc-analysis1.jpg http://www.eclinpath.com/hematology/tests/hemoglobin/rbc-analysis-2/ Spektrofotometrická analýza hemoglobinu Øhemolýza všech erytrocytů lyzačním (bezkyanidovým) roztokem Øuvolněný HGB je převeden na chromogenní formu s nejvyšší hodnotou absorbance při λ = 540 nm üHGB je převeden na chromogenní formu reagencií (např. imidazolem nebo sodium lauril sulfátem), která vytváří hemoglobinový komplex Øměření absorbance hemolyzovaného vzorku a blanku (lyzační roztok) üměření cca 8x (dle typu přístroje) Øz rozdílu absorbancí je vypočítána koncentrace HGB Ø http://www.healthcare.siemens.com/siemens_hwem-hwem_ssxa_websites-context-root/wcm/idc/groups/publi c/@global/@lab/documents/image/mdaw/mzk3/~edisp/cellavision_dm96_b-00299413/~renditions/cellavision _dm96_b-00299413~10.jpg http://jogjas.com/indogama/wp-content/uploads/olympus-cx21optilab-eshop.jpg http://ptanm.com/wp-content/uploads/2015/09/Mikroskop-Olympus-BX-51-Polarisasi.jpg Mikroskopovací zařízení Zhotovení nátěru krve Øroztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle pod úhlem cca 30 - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku krve a roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; po té rychle krev rozetřít po podložním skle Øsílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr üúhel se řídí hodnotou HCT: čím ↑HCT, tím ↓úhel; čím ↓HCT, tím ↑úhel Ønátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“ Dif-1_nátěr Mikroskopování Ømikroskop üsuchý objektiv: mezi preparátem a objektivem je vzduch (přehledné prohlížení a buněčnost preparátu) üimerzní objektiv: mezi preparátem a objektivem je imerzní olej (morfologie buněk) oimerzní olej má podobný index lomu jako sklo – vznikne opticky homogenní prostředí, zvýší se index lomu prostředí mezi preparátem a objektivem imerzí může být: voda, parafinový olej, glycerol, cedrový olej, kanadský balzám (voda má vyšší index lomu než vzduch, ale nižší než imerzní olej) • • • • Ødigitální morfologie nové generace analyzátorů svým softwarovým vybavením digitálně zpracovávají a vyhodnocují krevní nátěry, hovoří se o virtuální mikroskopii (telehematologie), digitální analýza vytváří databázi digitálních fotografií krvinek, které lze i exportovat e-mailem nebo po internetu odborníkům ke konzultaci https://www.sysmex.com/us/en/Company/News/PublishingImages/2013_summer_CellavisionScreen.png Barvení nátěrů periferní krve a aspirátů kostní dřeně ØPanoptická barvící technika: üfixační roztok May-Grunwald – složení: eozin Y, metylenová modř, metylalkohol, glycerol übarvící roztok Giemsa-Romanowsky – složení: metylenová modř, azur-eozin, azur II, metylalkohol, glycerol, fosfátový pufr pH 6,8-7,0 ØZákladní principy barvení: üAniontové (kyselé) barvivo eosin Y se váže na kationtové části molekul proteinů a barví oranžovočerveně hemoglobin a eozinofilní granula üKationtové (zásadité) barvivo azur B, se váže na aniontové části molekul a barví modrošedě zbarvení nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), nukleoproteiny, granula bazofilů a sekundární granula neutrofilů. • •Celkové obarvení nátěru je výsledkem řady různých kombinací těchto barevných reakcí, které nakonec dávají výsledný vzhled nabarveného preparátu. • •Poznámka: preparáty lze také připravovat na nátěrových a barvících automatech.