biochemické indikátory dietárního příjmu
Ondřej Zvěřina
nutriční epidemiologie
jaro 2018
biochemické indikátory dietárního příjmu
Záměr
využití biochemických indikátorů (biomarkerů) k posouzení
dietárního příjmu nutrientů, případně konkrétních potravin pro
potřeby epidemiologických studií
Zájem kliniků a nutričních specialistů
měření biomarkerů → posouzení nutričního stavu,
pokrytí fyziologických potřeb
Praktický problém
příjem nutrientu je pouze jeden z faktorů
koncentrace v krvi a tkáních řízena absorpcí, transportem,
distribucí, metabolismem, vylučováním (i životním stylem)
měření expozice dietárním faktorům
● recall
● prospektivní jídelníček
● dietní anamnéza
● frekvenční dotazník
● vyšetření biomarkerů
○ E příjem metodou dvojitě
značené vody
○ příjem bílkovin měřením dusíku v
moči
○ fytoestrogeny jako ukazatele
příjmu sóji
○ další a další...
biochemické indikátory dietárního příjmu
Může nás zajímat:
příjem n-3 mastných kyselin s dlouhým řetězcem (EPA, DHA)
✓ koncentrace v tukových tkáních odráží jejich dietární příjem
■ Avšak ovlivňující faktory:
■ prekurzor α-linolenová
■ aktivita desaturačních a elongačních enzymů (tvorba z α-linolenové)
■ koncentrace inzulinu
■ fyzická aktivita
➢ při interpretaci třeba zhodnotit nedietární vlivy
biochemické indikátory dietárního příjmu
lékařský zájem
biomarkery → předpověď výskytu chorob
→ identifikace rizikových skupin
biomarkery nemusejí nutně odpovídat dietárnímu příjmu
náš zájem (nutriční epidemiologie)
zhodnotit a kvantifikovat příjem živin
→ hledáme vztah mezi příjmem živin a odpovídajícími biochemickými ukazateli
příklad
krevní cholesterol
= ukazatel rizika srdečních chorob,
chabá korelace s jeho příjmem
(vlastní tvorba, metabolismus)
využití dietárních biomarkerů
1. náhrada FFQ
● biomarkery jako ukazatel příjmu živin
● „objektivní“
● variabiliní obsah živin ve stejných potravinách (úprava, skladování, zpracování)
● např.: Se v kukuřici v USA (100x rozdíl), ve vepřovém 15x
dotazníkový průzkum nepřesný
(např. u celkových tuků naopak - neexistuje vhodný ind.)
u mnohých živin a potravin možnost volby
2. posouzení nutričního stavu
● př.1.: sérový ferritin - dobrý ukazatel saturace organismu, ne však jeho množství ve stravě
(faktory: hemové/nehemové, spolupříjem vit.C, ztráta krve)
● př.2.: vitamin D - příjem v potravě vs. tvorba v kůži → slabá korelace mezi příjmem a
skutečným stavem vitaminu; lepší korelace nutri.stav (vnitřní dávka) → zdravotní stav
3. validace metod FFQ
● biomarkery jako referenční ukazatel k dotazníkovým průzkumům
● vyžaduje biomarkery silně reflektující příjem
1
2
3
návratnost
VS.
koncentrace
návratné biomarkery (recovery biomarkers)
silná časová souvislost mezi příjmem a biomarkerem
např.: dusík: 80 % bílkovinného dusíku je navráceno v moči
→ 24hodinový příjem bílkovin lze stanovit ve 24h sběru moči
další návratné biomarkery: draslík, sodík
nevýhody: omezené množství biomarkerů; krátký čas,
vztahují se k celkovému příjmu, ne přijaté energii (DLW)
koncentrační biomarkery (concentration biomarkers)
souvislost mezi příjmem živin a koncentrací biomarkeru v organismu
(i když korelace zřídkakdy silná - vnitřní mechanismy)
~ většina živin (například trans-mk v tukových tkáních)
biomarkery
korelace s dotazníkovými studiemi:
koncentrační biomarker polyenové kyseliny ↔ FFQ ▶ korelace FFQ s návratností 24h dusíku
Návratné biomarkery se jeví vhodněji, mnohá omezení vedou k tomu, že právě koncentrační b. bývají jedinou možnou volbou.
základní principy
pokud je vztah mezi příjmem živin a
zdravotním dopadem zavádějící, bude
stejně zavádějící vztah s biomarkerem
příklad
vysoký příjem kyseliny linolenové se u někoho
pojí s příjmem trans-kyselin
⇒ spojitost mezi koncentrací kys. linolenové v
plazmě a srdečními chorobami ?
objektivita biomarkerů
○ biochemické testy objektivní ⇒ dojem nestrannosti
○ dotazníky připravují i vyplňují “pouze” lidé
○ realita: biochemické měření má také mouchy
○ nutností je zajistit spojitost:
příjem ~ biomarker ~ zdravotní význam
možné zdroje chyb
● citlivost biomarkeru k přijímané stravě
● časová integrace
● specifita biomarkeru
● nedietární vlivy a okolnosti
● sběr, skladování a analýza vzorku
základní principy
citlivost k příjmu
Měří naše metoda to, co měřit má?
pokud chybí vztah mezi příjmem
nutrientu a jeho koncentrací v (např.) krvi
→ náhodná klasifikace vzorků
Míru korelace řídí
➢ dostupnost živiny (bioavailability)
➢ homeostáza
➢ rozsah příjmu ve sledované populaci
➢ další nedietární faktory ovlivňující koncentraci
základní principy
homeostáza
regulace živin v tělesných tkáních a tekutinách
mechanismus může být jednoduchý
⊳saturace Fe
⊳vylučování přebytku vitaminu C
nebo složitý
⊳ komplexní hormonální regulace Ca
důsledek homeostázy
závislost příjem-koncentrace jen zřídka lineární,
často dokonce nemonotónní.
Závislost pro většinu nutrientů s rostoucím příjmem slábne,
nebo dosáhne fáze plató.
základní principy
homeostáza
důsledky pro měření
- pokud je plochá část široká,
- pokud cílová skupina saturována
⇒ uniformní výsledky (nepoužitelný indikátor)
při větším rozptylu příjmu v rámci populace lze
alespoň rozlišit příjem velmi malý a průměrný
malé rozdíly
příklad: retinol
- lze ho měřit v séru a plazmě
- má širokou plochou část saturační křivky (plató)
- u dobře živené populace malé rozdíly
- >90% vitaminu A v játrech (pufrovací rezervy)
- sérum proto nereflektuje příjem
- sérový retinol je ukazatel spíš u špatně saturované populace
(zde koreluje s dotazníkovými příjmy i klinickými projevy deficience)
základní principy
homeostáza
základní principy
Bioavailability (biodostupnost)
poměr přivedeného a absorbovaného nutrientu,
dostupného pro využití nebo uložení
Biodostupnost ovlivňuje citlivost biomarkeru k příjmu.
Kromě absorpce ve střevě také účinek prvního průchodu játry
(first pass effect) ovlivňuje množství látky, které se dostane do
oběhu. (Dojde-li k biotransformaci, měříme i produkt?)
...zkoumáme vnitřní dávku?
Při výrazném ovlivnění je biochemické měření
vhodnější ukazatel než tabulkový výpočet.
http://smartypantsvitamins.com/
příklad
různá biodostupnost železa
základní principy
specificita
jeden biomarker může reflektovat více složek
výživy (např. je součástí více potravin)
některé biomarkery jsou navíc produkty
metabolismu
příklad
Karotenoid β-cryptoxanthin v plazmě může korelovat
s vitaminem C a flavonoidem hesperetinem.
Důvod: všechny tři látky jsou obsaženy v citrusovém
ovoci.
příklad 2
Fenolická sloučenina phloretin je obsažena v jablkách.
Zároveň je však metabolitem naringeninu (flavonoid
grepů). Výsledek: Phloretin v moči nereflektuje spotřebu
jablek, ale taky příjem naringeninu.
=
Toleranční testy
● odběr krve nebo moči před a po podání
testovací dávky (např. vitaminu, Glc, ...)
● deficientní jedinci zadrží větší množství
● logistické nároky vyšší → omezení epidemiologie
RDR = relativní odezva na dávku (relative dose respose)
provedení
1. počáteční odběr krve/moči
2. podání testovací dávky látky
3. po nějaké době další odběr
4. srovnání koncentrací
oGTT: orální glukózový toleranční test
Toleranční testy
Příklad: deficience retinolu
Pacientům je podána vysoká jednorázová dávka vitaminu A,
sleduje se vzestup vit.A v séru za 5 hodin. Stanovení
spektrofotometricky.
Retinol se v plazmě váže na retinol vázájící protein (RBP). Při deficienci vitaminu se
RBP hromadí v játrech. Podání vitaminu → RBP uvolněn do krve.
Běžná koncentrace ~ 2 μmol/L, za 5 hodin vzrůst na 7-25.
Deficit při vzestupu menším než na 7 μmol/L.
Při diagnostice malabsorpčního syndromu. Pozitivita testu
koreluje s vylučováním tuků ve stolici
Nevýhody testu:
- nesenzitivní u dobře živené populace.
- logistický náročný (dva odběry)
modifikovaná verze testu
Podává se 3,4-didehydroretinol.
V jediném vzorku séra se 4 h po podání
měří poměr didehydroretinol/retinol (pomocí HPLC).
Při deficienci se velký podíl váže na RBP.
Výhoda: Stačí jediný vzorek.
A novel method to identify fat malabsorption: the Serum Retinyl
Palmitate Test. Raman M. Clinica chimica acta, 2016.
základní principy
Integrační doba
citlivost biomarkeru k příjmu málo/moc velká
pro nutriční epidemiologii zajímavé dlouhodobé závislosti
(např. vznikající aterosklérotické plaky - roky až dekády)
⇒ pro epidemiologii zajímavý dlouhodobý vliv a složení diety
Krátkodobý indikátor zohledňuje pouze hodiny až dny.
Časová závislost
- kombinace absorpce, distribuce, vylučování
- typ vzorku (pomalá/rychlá výměna)
základní principy
Integrační doba podle druhu vzorku
tělesná úložiště mají rozdílnou rychlost obměny
▶ Jak se zjišťovala časová závislost?
○ manipulovaný příjem při některých studiích
○ průběžné testování jedinců
▶ Lze časová variabilita obejít?
○ opakovaným vzorkováním
○ použitím materiálu s dlouhou int. dobou
● tuková tkáň
pomalá výměna
reflektuje dlouhodobé složení výživy
● červené krvinky
často méně citlivé ke krátkodobým
výkyvům než plazma nebo sérum
● moč
24h sběrný vzorek vypovídá víc než náhodný
● játra
vynikající dlouhodobý materiál, nedostupný
● vlasy, nehty
dostupné keratinové tkáně,
reflektují týdny až měsíce
pro některé živiny velmi vhodné
optimální materiál se liší podle vybraného biomarkeru
○ tuková tkáň: dlouhodobý příjem MK lepší než plazma,
neplatí už pro karotenoidy a rozpustné látky.
○ moč 24h: flavonoidy reflektuje lépe než plazma (ta je
silně ovlivněna stravou posledních hodin)
○ plazma naopak lepší pro vitamin C (moč reflektuje
pouze velmi vysoké dávky).
○ nehty, vlasy vynikající pro kovy
Výběr typu vzorku
nejčastější materiál: sérum, plazma
další možnosti: erythrocyty, moč, vlasy,
nehty, tukové tkáně
integrační doba slabá u séra a plazmy,
delší u tukových tkání nebo nehtů
Zajímají nás materiály bez krátkodobých
výkyvů složení.
Využitelné pro řadu nutrientů, m.j.: MK, Se, kyselina listová
selen
Při zvýšeném příjmu pozvolna roste (300+ dní). Erythrocyty tak reflektují dlouhodobější příjem selenu oproti plazmě.
n-6 polyenové mk
MK z rybího tuku vzrůstají během dní, tedy příliš rychle s ohledem na rychlost tvorby. ⇒ Výměna s plazmou.
Korelace mezi dlouhodobým příjmem MK a koncentrací v erythrocytech silnější než s plazmatickou koncentrací.
kys. listová
Saturace křivky během suplementace daleko dříve u plazmy než erythrocytů.
Výběr typu vzorku
Erythrocyty
červené krvinky
Doba života: cca 120 dní
(lepší časový záznam než sérum nebo plazma)
Nutná inkorporace biomarkeru během tvorby,
nejen jeho výměna s plazmou.
Lepší časový záznam než plazma, ale tato přidaná
hodnota se výrazně liší podle živiny.
Studie: Různé biologické vzorky a jejich reakce na suplementaci Se. (Robinson and Thomson 1981)
Izotopicky značený selenomethionin: erythrocyty reagují pozvolna na suplementaci (300+ dní) i její přerušení.
Odezva v plazmě byla rychlejší (nárůst během 5 dní suplementace, pokles při ukončení rychlejší)
Měření kovů v krvi
hlavní zdroje chyb: odběr, skladování, příprava vzorku
odběr do komerčních nádob
jejich materiál nutné volit s ohledem na analyt:
Al - nevhodné sklo (běžné nadhodnocení, je v prachu)
Cd - nevhodné některé měkčené plasty
Cr, Ni, Mn - vhodná kanyla nebo posilikonovaná jehla
Louhování kovů z povrchu nádoby: nelze simulovat
vodou/kyselinou; biologické analyty obsahují ligandy,
které mohou vázat kovy. ⇒ luhování referenčním vz.
Dekontaminace nádobek HNO3
10%. Pozor na čistotu
přidávaného EDTA, citrátu...
uchování: do 3-5 dnů v ledničce, déle v mrazničce
Certifikované referenční materiály (CRM Sigma /
katalog klinických materiálů) nutné k ověření správnosti Spěváčková, Kontoková: Prvková analýza klinických materiálů, Chem. Listy, 92, 287-293
Výběr typu vzorku
Tukové tkáně
Doba obměny tukové tkáně je velmi dlouhá.
Podkožní tuk = vynikající ukazatel mastných kyselin.
Dayton et al. 1966: 5letá studie kontrolovaného příjmu
linolové kyseliny. Průběžná měření ⇒ doba obměny
tkáně ~ 680 dní.
Katan et al. 1997: Rovnovážný stav EPA a DHA kyselin
nebyl dosažen během 18 měsíců suplementace.
⇒ časová integrace cca 2+ roky × několikatýdenní
obměna cholesterolových esterů
FFQ studie PUFA a trans-MK korelují s koncentrací v
tukové tkání (více než s plazmou nebo erythrocyty).
další využití
■ alkylresorcinol z celozrnné mouky - dobrá
korelace se spotřebou (Jansson, 2010)
■ pentadekanová kyselina (15:0) jako marker
mléčného tuku - v podkožním tuku koreluje s
FFQ
příklad
Campos, Baylin, Willett, 2008: sběr 3600 tkání na Costa Rice,
výzkum příjmu α-linolenové na výskyt infarktu.
Rozsah α-linolenové v tukové tkání 0,3 - 1 %.
Vyšší příjem (indikovaný laboratorně i dotazníky) byl spojen
s nižším rizikem výskytu infarktu.
Výběr typu vzorku
odběr tukové tkáně
Odběr podkožního tuku jehlou a stříkačkou
(téměř) bezbolestná metoda (místní znecitlivění sprejem).
Používání tenčích jehel → eliminace anestetik
⇒ použití v epidemiologických studiích
Výběr typu vzorku
Vlasy a nehty
Vhodné pro měření minerálních látek: Se, Cd, Hg, Pb, …
časová integrace: podle délky až roky
Snadný odběr i skladování, zřetel na vnější kontaminaci.
Vzdálenější části často obsahují víc kovů než u hlavy.
Péče o vlasy může zkreslovat výsledky. Ideální stav vlasů u
hlavy (ztráta dlouhodobé informace).
Pro porovnatelné výsledky - třeba standardizovat přípravné
procedury.
Výběr typu vzorku
Vlasy a nehty
oběr vlasů
odběr z týlní oblasti, <5 cm od hlavy,
cca 0,5-1 g vzorku
Mycí procedura (dle WHO):
- aceton,
- 3x deionizovaná voda,
- aceton
(vždy 10 minut)
Rozklad vzorku
Mikrovlnný rozklad do roztoku
Stanovení kovů
atomová absorpční spektrometrie
Ověření: (Certifikované referenční materiály, obr.)
před mytím po mytí
Correlation between the number of sea food meals and the
concentration levels of mercury in human hair (Adapted from
Renzoni et al., 1998).
Výběr typu vzorku
Vlasy a nehty
příklad 1
Zvýšený obsah Cd ve vlasech
dětí. Zdrojem se ukázalo
zahradní hnojivo. Rodina si
nechala navézt na zahradu
několik nákladních aut
čistírenských kalů. Ty běžně
obsahují vysoké množství kovů
včetně Cd.
příklad 2
10letá holčička s podezřením na
otravu Pb. Analýza vlasů
prokázala otravu celé rodiny.
Analýza dlouhých vlasů matky
naznačila roční periodu otravy.
Hypotéza periodického využití
atypického nádobí?
Výběr typu vzorku
Vlasy a nehty
nehty na nohou
- méně exponované vnějšímu prostředí
- jednoduchá logistika
- vhodné pro minerální látky - integrace za ½ - 1 rok
- nehet palce u nohy roste ~0,056 mm/den
- možnost samostatného odběru
- ⅔ kohorty, cca. 68 000 žen poslalo nehty poštou v
rámci dlouhodobé studie Nurses’ health study
delší nehty = delší časová integrace
příklad: Ni ve vlasech a nehtech po týdenní praxi ve výrobě síranu nikelnatého
obsah selenu v nehtech v různých regionech
Výběr typu vzorku
Moč
způsoby odběru:
24hodinová (reprezentativní, sběrné PE nádoby)
celonoční sběr
první ranní vzorek
jednorázový vzorek (nejjednodušší, malá integrace)
+časté doplnění o vzorek krve - komplementární
návratné biomarkery: N, K, Na
koncentrační biomarkery: I, fenolické látky
Mnohé epi-studie prokázaly, že 24h vzorek není tak
obtížné získat: INTERSALT - 10 tisíc lidí ze 32 zemí.
Curhan, Taylor (2008): 3350 vzorků poštou.
Výběr typu vzorku
Moč
zředění - ovlivňuje koncentraci biomarkerů
náhodné vzorky korelují se 24h sběrnými měrou 0.4-0.6 (Ilich, 2009)
možnost normalizace na kreatinin
- produkt degradace svalů
- vylučování kreatininu ~ konstantní
- dá se dopočítat z pohlaví, věku a váhy
- ověření 24h sběru, normalizace jednorázového vzorku
nebo: kontrola návratnosti PABA (4-aminobenzoové kys.)
příklad
Sója zvyšuje hladinu isoflavonů v moči. Porce sóji k
večeři → zvýšení isoflavonů v ranní moči. Ne však,
pokud je součástí snídaně. (Fraser, 2010)
Vitamin D
- většinou v souvislosti s křivicí a osteomalacií
- země třetího světa, nyní na ústupu (fortifikace)
- současný zájem: vliv na osteoporózu, zlomeniny, srdeční choroby
- příjem: dieta + kožní tvorba
Ergokalciferol Cholekalciferol
Vitamin D
(3)
obsah vitaminu D v potravinách živ. původu
Vitamin D
- některé země fortifikují margaríny a
další potraviny (D2
i D3
)
Vitamin D
stanovení biomarkeru
- ideální biomarker: 25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D
- hydroxylace v játrech jen málo regulovaná, koncentrace
metabolitu odpovídá dostupnému vitaminu D
- poločas života v séru ~ 3 týdny (oproti 24 h Vit.D)
- metaanalýzy: suplementace Vit.D koreluje s 25(OH)D v séru,
nevnýhoda - plochá křivka při saturaci
- korelace 25(OH)D s příjmem vitaminu vyšší v zimě
(například ale u hospitalizovaných osob nezáleží)
Vitamin D
stanovení D2
a D3
vedle sebe
metoda : HPLC s UV detekcí
Vitamin D
nedietární vlivy
- expozice slunci (opalování, populace, etnické skupiny)
- starší věk: pojí se s horším metabolismem vitaminu D
(25 % výtěžnost na slunku - slábne kůže a s tím obsah
7-dehydrocholesterolu)
- tuková tkáň rozpouští vitamin D a omezuje jeho cirkulaci
(57% výtěžnost při opalování obézní populace)