Elektroforeza Sekven ovarii Molecular diagnostics for your routine Výsledek PCR Elektroforéza V molekulární biologii se používá k separaci nukleových kyselin a bílkovin Principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli Gelová, polyakrylamidová 150D 1000 ■5 800 Ý o 500 3 400 -5 300 T3 200 1E0 1CD L 1 2 3 4 — pružky Obr. Schéma elektroforetickej separácie (vfavo) a gél pod UV svetlom (vpravo) Elektroforéza Arne Tiselius Švédský chemik Nobelova cena v roce 1948 za objev elektroforézy a adsorpční analýzy Princip elektroforézy • Principem metody je pohyb záporně nabitých molekul DNA v elektrickém poli směrem k anodě. • Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny. • Separace molekul DNA podle jejich velikosti. Nosiče Agaróza Agarosa je získávána z mořských řas Je to lineární polysacharid Polyakrylamid Polyakrylamidový gel vzniká polymerací akrylamidu s příměsí bisakrylamidu, který umožňuje zesíťování lineárních vláken a vytvoření prostorové struktury. Nosiče • Agarózovýgel • Snadná příprava • Velké rozmezí velikostí molekul DNA, které je možné na agaróze dělit • Vysoká cena • Přírodní produkt, jednotlivé šarže i od stejného výrobce se mohou trochu lišit a poskytovat odlišné výsledky. • DNA izolovaná z agarózového gelu může být kontaminovaná látkami (např. sacharidy, ionty kovů), které mohou inhibovat následně prováděné reakce (reštrikční štěpení) • Polyakrylamidovýgel • Pracnější příprava • Třeba dávat větší pozor při manipulaci, protože akrylamid a N,N'-metylenbisakrylamid jsou vysoce toxické a kumulují se v organismu • Vysoká rozlišovací schopnost (0,2%), tj. dokáže rozlišit např. DNA o délce 500bpod DNA 501 bp • Dokážou pojmout mnohem větší množství DNA než agarózové gely bez ztráty rozlišení • DNA izolovaná z polyakrylamidového gelu je vysoce čistá a může být použita i pro velmi náročné molekulárně-biologické techniky (např. mikroinjekce DNA do myších embryí). Elektroforetické pufry • Elektroforetické mobilita DNA je ovlivněna složením a iontovou silou elektroforetického pufru • V nepřítomnosti iontů je elektrická vodivost velmi nízká a DNA putuje velmi pomalu, proužky jsou rozmazané. • TAE, TPE, TBE (tris-borát, kyselina boritá a EDTA) Horizontální gel Vertikální gel Barvení gelu • Ethidiumbromid (2,7-diamino-10-ethyl-9-fenyl-fenanthridiniumbromid) - mutagen • SYBRGreen • Barvení stříbrem - polyakrylamidové gely Nanášecí pufr • Nanášecí pufry plní tři role: 1) Zvyšují hustotu nanášeného vzorku, který ochotněji klesá ke dnu startu. 2) Svou barvou usnadňují nanášecí proces. 3) Během elektroforézy indikují přibližnou polohu jednotlivých fragmentů DNA._ Hmotnostní standard Nanáší se do jedné jamky gelu pro odhad velikosti pozorovaných DNA fragmentů Má definované velikosti jednotlivých fragmentů Příslušenství • K dosažení maximálního rozlišení fragmentů DNA větších než 2 kb, napětí by nemělo přesáhnout hodnotu 5 V/cm. Zviditelnění gelu elektrofaretický gel dlouhé fragmenty krátké fragmenty Sekvenování CGATTAAAGATAGAAATACACGATGCGAGCAATCAAATTTCATAACCTCACCATGAGTTTGATCCGAAGCGATT^ • Cílem je stanovení primární struktury neboli pořadí nukleotidů v molekulách DNA • Znalost sekvence DNA je rutinně používána pro odvození aminokyselinové sekvence • Původně 2 metody: Maxam-Gilbertovo sekvenování a Sangerovo sekvenování • Dnes již více metod-next generation sequencing Maxamovo-Gilbertovo sekvenování • Podstatou je specifické rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizovaná báze určitého typu • Výchozí materiál-jednořetězcová DNA, označená na jednom konci radioaktivní značkou • Podmínky reakce - modifikace pouze jedné báze v řetězci (dimethylsulfát, hydroxid sodný, hydrazin) • Výsledkem modifikace je vytvoření křehkého místa v řetězci DNA, které je citlivé na štěpení • Potom je DNA vystavena piperidinu, což vede k rozštěpení řetězce v zesláblých místech • Odečtení sekvence v denaturujícím polyakrylamidovém gelu • Není rutinně používáno-data nejednoznačná, vysoká úroveň radioaktivity Sangerovo sekvenování • Enzymová metoda • Využívá biologického procesu replikace DNA s radioaktivně značenými 2',3'dideoxyribonukleosidtrifosfáty - inhibitor (terminátor) syntézy DNA • Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu DNA polymeráza při náhodném začlenění dideoxy analogu nemůže dále syntetizovat => vznik fragmentu separace těchto fragmentů na polyakrylamidovém gelu s následnou autoradiografickou detekcí sekvenovaný úsek DNA ddATP , __ ddCTP ddTTP ddGTP i 3'-GAATTCATTCGCCAT-5' ■^M^iiitiiiii............... 5' :-ČTTAAGTAAGC pnmer syntetizovaný reaKceve fragment směsi s ddCTP 5ř-TAAGCGGTA-3' \ 3'-ATTCGCCAT-5' Sangerova metoda • místo radioaktivního značení (32P) použita fluorescenční detekce • dnes nejpoužívanější metoda • reakční směs: - fluorescenčně značený primer (4 směsi => 4 značky) - DNA-polymeráza - 2'-deoxyribonukleosidtrifosfáty - jednotlivé směsi obsahují navíc příslušné 2!,3'-dideoxyribonukleosidtrifosfáty (menší množství, asi 1%) Sangerova metoda Strand to be sequenced Primed DMA Prepare tour reaclion mixtures: include in each a different replication-stopping nucleotide x-fläpllcation producta ol *C" reaction Separate products by gel electrophoresis Read sequence as T ' j*i!ÍÍí complement 01 bands a 1 'š^. ^* containing labelad strands q ^^Jt^ Automatická Sangerova metoda • Využívá fluorescenčně značené terminátory fTGCAAATCGGTGTAAA I I I I I ^^^^^TGCAAATC _ MIM ^^^^^TGCAAA | | | | |TGCA ..... M M I Ttgcäaatc M M I M M I | | | | |TGCAAATCG Automatická Sangerova metoda • Separace jednotlivých fragmentů pomocí kapilární elektroforézy Automatická Sangerova metoda • Sekvenace jednotlivých DNA fragmentů. Možnost paralelní sekvenace • max. 96 sekvencí v jednom běhu (96 kapilárové sekvenátory) • Délka získané sekvence cca 650 bp. • Max. sekvenační výtěžek jednoho běhu cca 60 kb Sekvenování nové generace Sekvenování nové generace • PCR se provádí paralelně pro všechny fragmenty DNA nebo není třeba. • Paralelní sekvenování několika miliónů sekvencí. • Délka získaných sekvencí cca 50 - 600 bp. • Sekvenační výtěžek jednoho běhu několik až několik tisíc Gb (o 4 až 6 řádů vyšší než u kapilárního sekvenování). • Cena sekvenace za bázi o řád až dva nižší než u kapilárního sekvenování. • Poprvé v historii není problém data získat, ale smysluplně interpretovat Obecné schéma celogenomového sekvenování 0. Izolace celogenomové DNA - získáme mnoho kopií genomové DNA 1. Příprava tzv. knihovny - fragmentace genomové DNA na fragmenty o délce řádově stovek bp dlouhé (ultrazvukem, proudem dusíku) 2. Zatupení konců a ligace pomocí tzv. adaptérů - krátkých oligonukleotidů, od kterých pak probíhá sekvenování jednotlivých fragmentů (vážou se k nim primery; všechny fragmenty se tedy sekvenují stejným primerem) 3. Namnožení klonů jednotlivých fragmentů 4. Vlastní sekvenování NGS - nejcastejsi platformy • 454 (Roche) • llumina • Ion torrent (Life technologies) • SOLiD (Life technologies) 454 Roche> • Příprava knihovny • Příprava vlastního templátu k sekvenování: emulzní PCR na kuličkách, na každou kuličku se váže jeden fragment původní knihovny • Po PCR na každé kuličce navázáno mnoho kopií příslušného fragmentu • Sekvenace syntézou v mikrojamkách (v každé je jedna kulička) • Detekce chemiluminiscenční - pyrosekvenování Pyrosekvenování - 454 Pokud se začlení nukleotid do vznikajícího řetězce, poznáme to díky luminiscenci vyvolané sérií reakcí čtyř enzymů - DNA-polymeráza, ATP sulfuryláza, luciferáza, apyráza; směs dále obsahuje adenosin fosfosulfát (APS) a luciferin Postup: 1) Přidáme ke kuličce roztok konkrétního nukleotidu 2) Pokud je DNA polymerázou začleněn do vznikajícího řetězce, uvolní se pyrofosfát 3) ATP sulfuryláza provede reakci pyrofosfátu s APS - vzniká ATP 4) luciferáza převede luciferin za přítomnosti ATP na oxyluciferin, uvolní se světelné záření, které je zachyceno detektorem, v počítači převedeno na informaci, který nukleotid byl inkorporován 5) apyráza rozloží neinkorporované nukleotidy a ATP (abychom „vyčistili stůl" pro další reakci) 6) procesy 1-5 postupně opakujeme s dalšími dNTP (např. dCTP, pak dGTP, pakdTTP) https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFeOaA Signal image záznam signálů I polymeráza polymerase I I I I ľ I I I I I I I I I I I I I I I G A, P&CLC GGCATGCTAAAGTCA, Anneal primer APS sekvena/ni primer sulfuryláza Sulfurylase { Luciferase luciferáza světlo y Light + oxy luciferin 454 sekvenovani FLX System • 1 million of reads/run • 400-650 bp/read GS Junior • 0.1 millions of reads/run • 400 bp/read SOLEXA(lllumina) • Vzorek vložen do nebulizéru (vlivem stlačeného vzduchu se DNA rozbije na menší fragmenty) • příprava templátu: hybridizace na sklíčku, tvorba clusterů (shluků) na pevné destičce, tj. ne v kapce (emulzi); každý cluster opět obsahuje klony (kopie) téhož fragmentu • sekvenace syntézou (SBS - sequencing by synthesis) • detekce fluorescence odštěpené značky z reverzního terminátoru (nukleotidu) • Opět paralelní analýza mnoha clusterů současně SOLEXA(lllumina) 2007 mustkova „bridge" PCR 1. PREPARE GENOMIC DNA SAMPLE Randomly fragment genomic DNA and ligate adapters to both ends of the fragments. 2. ATTACH DNA TO SURFACE 3. BRIDGE AMPLIFICATION Bind single-stranded fragments randomly to the inside surface of the flow cell channels. Add unlabeled nucleotides and enzyme to initiate solid-phase bridge amplification. 4. FRAGMENTS BECOME DOUBLE STRANDED V_J The enzyme incorporates nucleotides to build double-stranded bridges on the solid-phase substrate. 5. DENATURE THE DOUBLE-STRANDED MOLECULES V_V Denaturation leaves single-stranded templates anchored to the substrate. 6. COMPLETE AMPLIFICATION r \ v_J Several million dense clusters of double-stranded DNA are generated in each channel of the flow cell. 7. DETERMINE FIRST BASE /- 8. IMAGE FIRST BASE /- First chemistry cycle: to initiate the first sequencing cycle, add all four labeled reversible terminators, primers and DNA polymerase enzyme to the flow cell. After laser excitation, capture the image of emitted fluorescence from each cluster on the flow cell. Record the identity of the first base for each cluster. 9. DETERMINE SECOND BASE /- Second chemistry cycle: to initiate the next sequencing cycle, add all four labeled reversible terminators and enzyme to the flov/ cell. 10. IMAGE SECOND CHEMISTRY CYCLE 11. SEQUENCE READS OVER MULTIPLE CHEMISTRY CYCLES 12. ALIGN DATA r I i GCTGA. . GCTGATGTGCCGCCTCACTCCGGTCG CACTCCTGTGG CTCACTCCTGTGG -»OCTGATGTGCCACCTCA GATGTGCCACCTCACTC GTCCCGCCTCACKCTG CTCCTGTGG ■c. ~i Kaown After laser excitation, collect the image data as before. Record the identity of the second base for each cluster. Repeat cycles of sequencing to determine the sequence of bases in a given fragment a single base at time. Align data, compare to a reference, and identify sequence differences. SOLEXA umina sequencers umina MiSeq 4 millions reads/run 150 bp/read umina GAIIx 300 millions reads/run 150 bp/read umina HighSeq 1500 - 3000 millions reads/run 100 bp/read Next generation sequencing SOLiD sequencers Ion Torrent • SMRT (single-molecule real-time) sequencing (PacBio) minlON (Oxford nanopore technologies) Microarrays • Skleněná nebo silikonová destička s miliony jednořetězcových DNA oligonukleotidů • PCR + Hybridizační reakce na čipu • Affymetrix, Agilent Technologies, Eppendorf či lllumina Princip Microarrays https://www.youtube.com/watch?v=9U-9mlOzoZ8 DNA micro array making Microscope glass slides coated with polylysine + 6116 Yeast ORFs amplified by PCR I 'l % % % Spotting (deposit) Hyl.niilisritH.iii Strain 1 Strain 2 1 RNA extraction 1 mRNA C& reverse I cy* Results delivery Scanning (lecture) \4/ « % « % V. « « Results analysis I Využití čipů v mikrobiologii • 12 virových agens způsobující onemocnění horních cest dýchacích • Čipy na chřipku • HPVčip • Genotypizace HCV • TruArray MRSA (Akonni) Děkuji za pozornost Mass sequencing by Viktor S. Poór