Molekulárně biologické metody v mikrobiologii Mgr. Martina Sittová Jaro 2018 Harmonogram • 1. den – Izolace DNA • 2. den – Měření koncentrace DNA spektrofotometricky, real-time PCR • 3. den – Elektroforéza Molekulární biologická diagnostika VZ. Metody molekulární biologické diagnostiky • Přímá diagnostika • Detekce části buněčné struktury – nukleové kyseliny (NK) • Metodika - využívá komplementarity vláken NK a je založena na procesu hybridizace NK • Objev metody PCR - metoda pro zvýšení citlivosti a specificity stanovení • V klinické praxi již přes 20 let Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky - výhody metody Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky - výhody metody • Kultivačně nezávislé - detekce a identifikace nekultivovatelných a obtížně kultivovatelných, usmrcených a poškozených mikroorganismů (M.tbc., chlamydie, borelie, viry) • Vysoká citlivost (HCV, HBV, gonokoky, M.tbc) • Rychlá detekce (M.tbc, meningitidy, sepse,..) • Možnost vyšetřit jakékoliv klinické vzorky i bez ohledu na transportní podmínky • Možnost kvantitativního provedení (HCV, HIV, HBV, CMV) Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky – limity metody • Problém standardizace metod • rozdílné přístupy laboratoří v in-house technikách • Použití standardizovaných komerčních kitů (CE-IVD) • Klinická interpretace • Někteří klinici metodu stále neznají a neumí používat • metody jsou ve stadiu získávání poznatků k interpretaci výsledků • nové vlastnosti metod (citlivost, nezávislost na kultivaci), mění pohled na infekci některými patogeny - borelie, „mrtvé patogeny“,…. • Často není interpretační rámec např. pro vysokou citlivost metody • Cena - při nesprávné indikaci vysoká • Nízká informovanost kliniků – neznalost přínosu metody nebo až přehnaná očekávání „poškozují dobrou pověst“ těchto nových metod Vhodný klinický materiál • Tělní tekutiny – periferní krev, likvor, BAL, slzy, sputum, sérum, plazma, sperma, moč • Tkáně, biopsie kůže, výtěry a stěry, vzorky z katetrů, implantátů • Nesrážlivá krev v roztoku EDTA Odběr vzorku a transport do laboratoře • Zvýšené riziko kontaminace • Správný odběr vzorku • Není třeba zachovat organismy životaschopné • Rozlišovat vzorky pro detekci DNA a detekci RNA • Cílené vyšetřování konkrétních mikroorganismů Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin (NK) Obecný postup izolace ? Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Lyze buněk a tkání Uvolnění vnitřního obsahu buněk Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK • Biologická lyze především využití degradačních enzymů (lysozym, proteináza K, celuláza…) • Chemická lyze využití detergentů (např. laurylsíran sodný), chelatačních činidel (např. EDTA), guanidiových solí • Fyzikální lyze použití varu, mražení, sonikace, drcení Většinou kombinace více přístupů Stav materiálu po lyzi buněk Komplexní směs DNA, RNA, lipidů, proteinů, sacharidů, uhlovodíků a dalších nízkomolekulárních látek Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Další postup: oddělit DNA, případně RNA od ostatních složek směsi Extrakce nukleových kyselin • Extrakce je čistící a dělící operace, při které přechází složka ze směsi látek v kapalné či tuhé fázi do jiné kapalné fáze - rozpouštědla. Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Extrakce směsí fenol-chloroform • Separace proteinů a NK založená na lehké vodné denaturaci proteinů na rozhraní těžší organické fáze • V praxi se už nepoužívá Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK DNA a RNA proteiny fenol Další způsoby extrakce NK • Detergent cetyltrimetylamonium bromid, CTAB • Odstranění kontaminant polysacharidového charakteru (houby, rostliny, některé bakterie) • S nukleovými kyselinami tvoří nerozpustný komplex • Guanidium thiokyanát • Denaturuje vše kromě nukleových kyselin • V jeho přítomnosti se DNA váže na oxid křemičitý – chromatografická kolona Purifikace nukleových kyselin • Srážení (precipitace), jedna ze základních metod izolace a koncentrace biologických makromolekul. • Zhuštění DNA nebo RNA Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Purifikace NK precipitací • Do roztoku, obsahujícího požadovanou makromolekulu, se přidá určité množství precipitačního činidla (síran amonný, ethanol, aceton apod.) • makromolekulární sloučenina se vysráží, aniž obvykle dojde k denaturaci. • Může se proto následně znovu rozpustit a použít ve své nativní, biologicky aktivní podobě. Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Izolace NK v diagnostické laboratoři Izolace DNA vazbou na křemíkovou membránu Izolace pomocí magnetických kuliček Izolace NK vazbou na křemíkovou membránu (silikát) • Komerční izolační soupravy • NK se zachytává na kolonkách na vrstvě SiO2, je proplachována a čistá NK je pak uvolněna elucí do roztoku o nízké iontové síle. Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Izolace NK vazbou na silikát Izolace pomocí magnetických kuliček • vazba NK na magnetické kuličky pokryté specifickými anti-NK protilátkami nebo jinými materiály vázajícími NK • Kuličky jsou propláchnuty v proplachovacích roztocích s využitím magnetu a NK je eluována specifickými roztoky. Eluovaná DNA/RNA Gratuluji, právě jste zvládli jeden z nejdůležitějších kroků v molekulární biologii Izolaci nukleových kyselin Charakterizace izolátu nukleových kyselin (NK) • Důležitou charakteristikou izolované NK je: Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK čistota koncentrace Charakterizace NK spektrofotometrií • Spektrofotometrie je stanovování vlastností vzorku, např. Koncentrace určité látky v roztoku, na základě pohlcování světla v různých vlnových spektrech. • NK absorbují UV záření s maximem v oblasti 260 nm • Proteiny mají maximum absorbance při 280 nm Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Koncentrace NK • roztok dvouřetězcové DNA o koncentraci 50 μg/ml má absorbanci • A260 = 1,0 • dsDNA ~ 50 μg/ml • ssDNA ~ 33 μg/ml • ssRNA ~ 40 μg/ml • Závislost absorbance na koncentraci je lineární při A260 = 0,1 až 0,3 Lyze buněk a tkání Extrakce NK Purifikace NK Charakterizace získané NK Čistota NK • Stupeň čistoty NK stanovujeme z poměru absorbance při 260 a 280 nm. • A260/280= od 1,8 do 2,0 (blíž 1,8) = OK! • < 1,8 = kontaminace proteiny • > 1,8 = kontaminace RNA • A260/230 > 2,0 • < 2,0 = kontaminace látkami, které jsou součástí izolačních souprav (absorbance při 230 nm) Charakterizace NK fluorimetrií • K měření nižších koncentrací NK než lze spektrofotometricky • Obarvení fluorescenčním barvivem (Hoechst nebo ethidium bromid) • Měření intenzity fluorescence barviva spektrofluorometrem Výsledek izolace • Čistá DNA nebo RNA o požadované koncenraci