Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. CeneProof Molecular diaanostics for vour routine J Molecular diagnostics for your routine i_ Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 5.5. 2010 Mendelovo muzeum Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo Princip PCR - Zásadní předpoklady správné polymerace - • Přítomnost templátu: polymerace je možná pouze podle známe matrice-templátu • Přítomnost primerů: nelze začít od nuly • Komplementarita: k polymeraci nukleotidů dochází vždy podle komplementární dvojice primer/templát • Směr polymerace: připojování nukleotidů je vždy ve směru 5'-3' Primer Je řetězec nukleové kyseliny, který se skládá ze 18 až 25 nukleotidů (oligonukleotid) Tm (melting teplota) alespoň 50°C Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C i v i / 3' 5' ZOQpOVGCinG Z3 tgacctgaaaagac <-PrilTier SpeCifiCnOSt PC R gatggactgattaccgatgactggacttttctg <—Template 5' 3' obsah G+C od ^ 40% do 75% 3' 5' tgacctgaaaagac gat ggactgattacc gat gac t ggactt tt ctg 5' 3' -Annealing Princip PCR Zásadní předpoklady správné polymerace - D= p-O-CH, o" O H 0 = p-O-CH, 5' o- OH H DNA primer MIM ..... nově syntetizovaný řetězec * 3 — 5 DNA matrice Princip PCR - Cyklické změny teplot reakční směsi - Denaturace Annealing Extenze Princip PCR - komponenty in vitro reakce - ŕ-\ Thermus aquaticus, Thermococcus, Thermophilus, Pyrococcus TAQ DNA primery MIM M M I .............................. ssDNA Denaturace 92-96°C Průběh polymerace -1. PCR cyklus - 1. denaturace (92-96°C) i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i . _.. A 2. annealing (45-72°C) primární produkty 3. extenze (72°C) i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i > Průběh polymerace - 2. PCR cyklus - I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 4........................ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I sekundární produkty .................... 1111111111 11111111111111 ŕ .............................. Průběh polymerace - 3. PCR cyklus - .................... I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ......................... amplikony I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I .................... I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I AypujaiuoaB ejsruzA nuo>j!|dwe jaood iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... iiiiiiiiiiiiiiiiiiii .................... - Á|>|ÁO ]S|BQ - Technické provedení PCR - termocyklery - Mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči, vodou, vzduchem nebo mikrovlnami Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu Systém reakčních kontrol Negativní kontrola (NK) • Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace PCR, master mixu, při přidávání vzorků • Provádí se min.lx na vyšetřovanou sadu vzorků • přidání sterilní vody (zaručeně bez přítomnosti NK) do amplifikační reakce namísto vzorku • Musí být negativní Izolační negativní kontrola (INK) • Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace procesu izolace NK • do procesu izolace NK je namísto vzorku vložena sterilní voda • Musí být negativní Na rozdíl od negativní kontroly indikuje nejen přítomnost kontaminace v samotné amplifikační reakci, ale také případnou kontaminaci při izolaci NK. Systém reakčních kontrol Pozitivní kontrola (PK) * Testuje selhání amplifikace * Provádí se min.l na celou vyšetřovanou sadu vzorků * Musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě * Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek (plasmid,. Kvantitativní standard / sada kalibrátorů * Několik ředění PK - slouží ke generování kalibrační křivky * Umožňuje kvantitativní stanovení NK ve vzorku * Jeho kvalita určuje přesnost kvantifikace Systém reakčních kontrol Interní standard | | | * Kontroluje rizika falešné negativity v důsledku inhibice reakce Je součástí KAŽDÉ jednotlivé reakce / detekce l^^^^^^^^M^^J to < je zpravidla uměle připraven (plasmid / MIMICs) přidán přímo do amplifikační reakce - kontroluje inhibice PCR přidán do vzorku před izolací NK- kontroluje izolaci a inhibici PCR zároveň (metodicky správnější; u některých patogenů povinný postup) MIMICs metoda Interní standardy se připravují nejčastěji jako úseky NK ohraničené sekvencemi primerů používaných pro amplifikaci specifické sekvence NK hledaného patogenu. Při detekci mikroorganizmů s genomem tvořeným DNA se používají interní standardy připravené tzv. MIMICS metodu, kdy je uměle připravený úsek NK ohraničený sekvencemi specifických primerů začleněn do plazmidu a ten je pak používán jako interní standard. House-keeping kontrola V případě detekce RNA virů, zejména hepatitídy C a HIV, je výhodné používat namísto takto uměle připraveného klonovaného interního standardu koamplifikaci tzv. house-keeping genů či transkriptů (gen v eukaryotické buňce, který je exprimován ve všech typech buněk a ve všech vývojových stadiích; produkty kódované provozními geny jsou nezbytné pro základní funkce buňky). Výsledek PCR Elektroforéza V molekulární biologii se používá k separaci nukleových kyselin a bílkovin Principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli Gelová, polyakrylamidová 150D 1000 ■5 800 Ý o 500 3 400 -5 300 T3 200 1E0 1CD L 1 2 3 4 — pružky Obr. Schéma elektroforetickej separácie (vfavo) a gél pod UV svetlom (vpravo) Varianty PCR v praxi • PCR-RFLP • nested PCR • multiplex PCR • RT-PCR - reverse-transcription PCR • LAMP - loop-mediated isothermal amplification • real-time PCR PCR-RFLP • Stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů • Amplifikace pomocí PCR a následné štěpení reštrikční endonukleázou • Analýza elektroforézou • Př. analýza prokaryotických genů pro 16S rRNA PCR-RFLP i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 1 1 1 1 1 i i 1 1 ■ -t-fc-b-fc-h...................... amplifikace i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i reštrikční štěpení I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ............. ......... ......... ......... Nested PCR • Odstupňovaná PCR neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů • Amplifikace ve dvou krocích: 1) Amplifikace jedním párem vnějších primerů 2) Amplifikace vnitřními primery • elektroforéza One tube nested PCR Ta = 652C Ta = 652C Ta = 582C 20 cyklů PCR Ta = 622C 30 cyklů PCR Ta = 522C citlivost specifičnost RT-PCR • Reverzně transkripční PCR • Určená pro amplifikaci molekul RNA • Izolovaná RNA je převedená do cDNA • Retrovirová zpětná transkriptáza Reverzně transkripční PCR 'N ssDNA Virová ssRNA