Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (CHA) CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (CHA) Cílem cytogenetického vyšetření je zjištění přítomnosti / nepřítomnosti chromosomových abnormalit (patologických chromosomových změn) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT TYPY ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT u onkologických pacientů VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT u onkologických pacientů VYŠETŘENÍ KARYOTYPU MALIGNÍCH KLONŮ Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ kostní dřeň solidní nádory periferní krev Obr. 1 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) • vyšetření chromosomů – metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování chromosomů) vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) rozlišovací schopnost nejnižší (5 - 10 Mb – přibližně 1 pruh) • vyšetření chromosomů, interfázních jader i izolované DNA - metodami molekulární cytogenetiky (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) vyšetření celého karyotypu vyšetření konkrétních oblastí rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • vyšetření izolované DNA - metody molekulární genetiky rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy Obr. 3 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 2 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 4 (Rosypal, 1989), upraveno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮVYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp Obr. 5 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY u onkologických pacientů ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY u onkologických pacientů • početní změny • abnormality počtu chromosomových sad (obv. se nejedná o přesný násobek haploidního počtu) - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) • abnormality počtu jednotlivých chromosomů v karyotypu - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než u vrozených chromosomových změn • strukturní změny • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní typy chromosomů – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromosomových změn - amplifikace ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromosomových změn - amplifikace • genová amplifikace – v buňce je přítomno mnoho kopií nějakého segmentu genomu - homogenně se barvící oblasti (HSR) - několik tisíc genových kopií - amplifikace onkogenu n-MYC u neuroblastomu (zelený signál – centromerická sonda, červený signál – lokus specifická sonda) – analýza v interfázním jádře – amplifikovaný materiál z jednoho chromosomu rozložen v jádře, chromosom despiralizován - amplifikace genu MLL u leukemií (lokus specifická sonda) – analýza na metafázních chromosomech – lokalizace HSR na chromosomu v místě lokalizace genu Obr. 6 (Dokumentace IHOK FN Brno) Obr. 7 (Dokumentace IHOK FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromosomových změn - amplifikace ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromosomových změn - amplifikace • genová amplifikace - double minutes (DM) = velmi malé nadbytečné struktury – vznik rozpadem HSR - homogeneously stained regions (nalézáme je v mitóze – chromosomový materiál rozlámaný na malé kousky) amplifikace onkogenu c-myc, vizualizováno FISH – obrázek převzat z prezentace „cytogenetika člověka“ PřF UKDM na chromosomech s G-pruhy Obr. 8 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 9 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS • nádorové buňky tvoří klony • klon - skupina geneticky identických buněk – z pohledu cytogenetiky se stejným karyotypem (v nádorové tkáni pacienta se může vyskytovat více buněčných klonů, každý z nich nese jiné chromosomové změny) (stanovení karyotypu maligních klonů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT u onkologických pacientů VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření přesněji charakterizuje nádor, typ nalezených abnormalit vypovídá o prognóze, fázi onemocnění. Pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění, monitorovat úspěšnost léčby. Cílem je záchrana života pacienta. – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve STANOVENÍ % ABERANTNÍCH BUNĚK Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ periferní krev Obr. 11 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) • vlivem mutagenních faktorů prostředí dochází na chromosomech ke vzniku aberací (zlomy, di-, tricentrické chromosomy, ring chromosomy ad.) aberantní buňka (mitóza s aberací) Obr. 12 (Dokumentace OLG FN Brno) • nacházíme různé změny v různých buňkách • v každé buňce může být jiná chromosomová aberace – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné změny, v jedné mitóze můžeme nalézt 1 změnu nebo i více) • vyšetřujeme mitózy, které jsou barvené konvenční metodou barvení chromosomů • mitózy, ve kterých je nalezena alespoň jedna chromosomová aberace, nazýváme „aberantní buňky“ Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) Výsledek: stanovení % aberantních buněk • CYTOGENETICKÁ ANALÝZA PERIFERNÍCH LYMFOCYTŮ (CAPL) skupinové hodnocení - hraniční patologie při skupinovém hodnocení: zvýšená expozice mutagenním faktorům: 2 – 4 % aberantních buněk z 200 – 300 hodnocených vysoká expozice mutagenním faktorům: více než 4% aberantních buněk z 200 – 300 hodnocených • ANALÝZA ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (ZCA) – individuální hodnocení - hraniční patologie při individuálním hodnocení: opakovaný nález 5% ab. buněk ze 100 hodnocených Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • rychlejší stárnutí organismu • vznik degenerativních onemocnění • možné maligní zvrhnutí Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách • zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem Obr. 13 (Dokumentace OLG FN Brno) aberantní buňka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL) příčiny vzniku ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL) Změny na chromosomech jsou náhodné (v různých buňkách různé), proto identifikujeme pouze typ aberace (např. zlom, ring chromosom aj.) a není třeba aberaci dále analyzovat (například určovat přesně místa zlomů, které chromosomy se spojily v dicentrický chromosom, apod.). Tzn. vyšetřujeme POUZE METODOU KLASICKÉ CYTOGENETIKY – konvenčním barvením chromosomů směsí barviv Giemsa – Romanowski. (netřeba vyšetření molekulárně cytogenetickými metodami) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno POSTUP ZÍSKÁNÍ PREPARÁTUPOSTUP ZÍSKÁNÍ PREPARÁTU • odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR! • kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem doba kultivace 48 hodin (zachycení 1. buněčného dělení), kratší než u stanovení karyotypu • zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze buněk • vykapání na podložní sklíčka • barvení chromosomů konvenční metodou • hodnocení ve světelném mikroskopu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů • konvenční barvení chromosomů (srovnání s postupem při přípravě chromosomů s G – pruhy – mitózy na sklíčcích po zaschnutí obarvíme v barvě Giemsa-Romanowski bez předchozí inkubace v roztoku trypsinu) 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski chromosomy homogenně obarvené po celé délce, bez příčných pruhů Obr. 14 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace • jednochromatidové gapy (mezery) - chtg (chromatid gap)– příčně slabě se barvící část chromatidy (achromatické léze), také úplné přerušení nepřesahující šířku chromatidy Obr. 15 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace • jednochromatidové zlomy - chtb (chromatid break), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Obr. 16 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace • výměny - chte (chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů Obr. 17 (Bočkov, 1971) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace - výměny ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromatidové aberace - výměny Obr. 18 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace • chromosomové gapy - chrg (chromosome gap) -příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy Obr. 19 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace • chromosomové zlomy - chrb (chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Obr. 20 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace • acentrické ringy, kruhové chromosomyuzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru Obr. 21 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schema (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA/CAPL)typ poškození – chromosomové aberace • chromosomy zahrnující více než 1 centromerudicentrické, tricentrické chromosomy… Obr. 22 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Schemata (Klen, 1982) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: 1. stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy - délka kultivace 72 hodin - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – Romanowski - nalezenou aberaci se snažíme co nejpřesněji definovat (i za pomoci metod molekulární cytogenetiky) 2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – později dochází k opravě aberací) - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu - konkrétní aberace neupřesňujeme, podstatné je pouze jestli je/není v dané buňce některá aberace přítomna VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) Obr. 23 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k vyšetření ZCA/CAPL (mutagenní faktory) Klinické indikace k vyšetření ZCA/CAPL (mutagenní faktory) • práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem • po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě • kontrolní vyšetření u podchycených případů aberace vymizí po léčbě (vitamíny)