Cvičení č. 1 Úvod Protilátky Mgr. Julie Štíchová ÚKIA Alergologie Alergická onemocnění Imunologie Autoimunity, imunodeficience Laboratoř Buněčná část Serologická část Laboratorní vyšetření • Fáze preanalytická • Odběr biologického materiálu, transport • Fáze analytická • Vlastní laboratorní vyšetření • Fáze postanalytická • Skladování, likvidace Biologický materiál • Žilní krev • Méně často BAL (bronchoalveolární laváž) • Svoz: • V rámci nemocnice – ruční donáška • Externí materiál – svoz autem • Odběry krve – uzavřené odběrové systémy Biologický materiál Plazma • Z nesrážlivé krve • EDTA – vyvazuje Ca2+ • Heparin – anti IIa/Xa aktivita Sérum • Ze srážlivé krve • Zkumavky s gelem – akcelerace koagulace • Sérum neobsahuje koagulační faktory a fibrinogen Biologický materiál EDTA HEPARIN SERUM-GEL Vyšetření lymfocytárních subpopulací Funkční testy leukocytů IgE, komplement, autoprotilátky, atd. Rozdělení imunologických laboratorních metod Buněčná laboratoř Soustředí se na leukocyty ➢Absolutní a relativní počty ➢Funkční vlastnosti Serologická laboratoř Stanovení proteinů v séru ➢Autoprotilátky ➢Imunoglobuliny ➢Proteiny akutní fáze ➢Komplement ➢Specifické IgE a další … Separace • Centrifugy • 2000 otáček/min, 10 min Protilátky Chemické složení: glykoproteiny Význam pro obratlovce: • Humorální složka adaptivní imunity • Ochrana před extracelulárními patogeny Význam pro medicínu: • Reakce protilátky s antigenem je základem mnohých laboratorních testů • Biologická léčba Struktura protilátky • 2 těžké (H) + 2 lehké řetězce (L) • Spojení – kovalentní disulfidické můstky • Pantová oblast - flexibilita • L řetězec – 1 variabilní + 1 konstantní oblast • H řetězec – 1 variabilní + 3-4 konstantní oblasti • Fab fragment – variabilní oblasti – vazba antigenu • Fc fragment – efektorová funkce Třídy protilátek • 5 tříd – podle typu těžkého řetězce Principy reakce antigen-protilátka • Antigen • Látka schopná vyvolat tvorbu protilátek • Konkrétní místo na jeho povrchu, kam se váže protilátka – EPITOP • Protilátka • Specifický produkt terminálních vývojových stádií B lymfocytů • Místo, které reaguje s epitopem antigenu – PARATOP • Vazba Ag-Ab je reverzibilní – slabé nevazebné interakce Afinita vs avidita protilátek • Afinita • síla interakce mezi 1 epitopem Ab a 1 paratopem Ag • Avidita • je dána vícenásobnou interakcí mezi multivalentním antigenem a protilátkou • IgG – 2 vazebná místa • Sekreční IgA – 4 vazebná místa • Pentamer IgM – až 10 míst Protilátky mohou být • Monoklonální • Produkty jediného klonu B lymfocytů • namířeny proti 1 epitopu jediného antigenu • Velmi vysoká specifita • Polyklonální • Namířeny proti více epitopům jednoho či více antigenů • Pokud byl při imunizaci použit 1 antigen – vzniká monospecifické antisérum • Pokud bylo při imunizaci použito antigenů více – polyspecifické antisérum Výroba polyklonálních protilátek Výroba polyklonálních protilátek 1. Výběr vhodného antigenu • Nutná vysoká čistota – přečištění chromatografie, ELFO 2. Zvýšení afinity antigenu k buňkám imunitního systému • Problém – solubilní antigeny špatně aktivují imunitní systém • ADJUVANCIA – zvyšují imunogennost a udržují antigen déle v těle • soli Al2O3 • Freudovo adjuvans – adsorpce antigenu na kapičky minerálního oleje (s/bez přídavku usmrcených mykobakterií) Výroba polyklonálních protilátek 3. Výběr vhodného zvířete • Fylogeneticky co nejvzdálenější druh vzhledem k povaze antigenu 4. Způsob aplikace – nejčastěji intradermálně, subkutánně • Antigen je vychytán ve spádových lymfatických uzlinách – maximální odpověď Výroba polyklonálních protilátek Výroba polyklonálních protilátek 5. Sběr krve • Opakované odběry nižšího množství krve • Kompletní vykrvení zvířete - usmrcení 6. Zisk séra s obsahem protilátek 7. Přečištění protilátek a jejich kvantifikace • Nespecifické metody – izolace protilátek určité třídy • Precipitace síranem amonným, elektroforéza, ionexová nebo gelová chromatografie • Specifické metody – izolace protilátek vůči konkrétnímu antigenu • Afinitní chromatografie, imunoadsorpce Polyklonální protilátky - využití Nefelometrie • Reakce Ag-Ab → precipitace • Třídy a podtřídy Ig, C3, C4, CRP Léčba • Antiséra proti hadím jedům ELISA • Záchytné protilátky • Záchyt různých variant antigenu • Vyšší senzitivita než monoklonální Ab • Nižší specifita Výroba monoklonálních protilátek Výroba monoklonálních protilátek 1. Aplikace antigenu intravenózně 2. Antigeny jsou krví zaneseny do sleziny – zde je imunitní odpověď na antigen maximální 3. Ve slezině diferencují antigen specifické B lymfocyty do plazmatických buněk, které produkují protilátky Výroba monoklonálních protilátek 5. Izolace plazmatických buněk ze sleziny 4. Po několika týdnech je z imunizované myši vyjmuta slezina Výroba monoklonálních protilátek • 1975 – Kohler a Milstein – fúze s myšími myelomovými buňkami • Produkuje Ag specifické protilátky • Velmi krátká životnost • Neprodukuje protilátky • Je nesmrtelná Slezinná plazmatická buňka Myelomová buňka 6.Fůze buněk polyethylenglykolem (PEG) Výroba monoklonálních protilátek Nezfúzované B lymfocyty a myelomové buňky Zfúzované B lymfocyty Zfúzované myelomové buňky HYBRIDOM HAT médium 7. Buněčná směs je kultivována v selekčním HAT médiu (Hypoxantin, Adenosin, Thymidin) Selekce – enzymatický blok HGPRT = Hypoxantin Guanin FosfoRibosyl Transferáza Selekce – enzymatický blok Výroba monoklonálních protilátek 8. Hybridomy jsou rozděleny do jednotlivých jamek 9. Dále se udržují pouze ty buňky, které produkují Ab proti požadovanému epitopu 10. Přečištění, kvantifikace, validace Využití monoklonálních protilátek • Konjugace monoklonálních protilátek s fluorochromy • Základní reagencie pro imunofenotypizaci IMUNOFENOTYPIZACE „stanovení fenotypu buněk na základě imunologické detekce jejich povrchových znaků (markerů) pomocí průtokové cytometrie“ • CD nomenklatura → CD znaky na buňkách • Některé jsou pro určité typy buněk vysoce specifické • Detekce pomocí fluorescenčně značených protilátek Využití monoklonálních protilátek Příklady využití konjugátů protilátka-fluorochrom jako diagnostik v laboratoři: • Rozlišení T a B lymfocytárních subpopulací • Rozlišení klidových a aktivovaných forem leukocytů • Rozlišení časné/pozdní aktivace buněk • Rozlišení vývojových stádií buněk • Proliferace • Apoptóza • Imunofenotypizace malignit Využití monoklonálních protilátek Monoklonální protilátky neznačené jako stimulancia buněk: Příklad: • Anti CD3 – váže se na CD3 ko-receptor T lymfocytů a aktivuje je → • Produkce cytokinů – INF-γ, IL-2 • Proliferace Využití monoklonálních protilátek • Monoklonální protilátky jako léčiva: BIOLOGICKÁ LÉČBA • Různé druhy protilátek: • Myší (omab) • Chimérické (ximab) • Humanizované (zumab) • Lidské (umab) Využití monoklonálních protilátek • Imunosuprese • Anti CD20 (Rituximab): B lymfocytární malignity • Blokáda prozánětlivých cytokinů • Anti TNF-α (Infliximab): léčba Crohnovy choroby, revmatoidní artritidy • Blokáda adhezivních molekul • Anti CD11a (Efalizumab): léčba lupénky • Protialergická léčba • Anti-IgE (Omalizumab): léčba těžkých forem astmatu Využití monoklonálních protilátek • Nová generace monoklonálních protilátek určených k biologické léčbě: konjugace s cytostatiky • Zesílení cytotoxického účinku na maligní buňky Shrnutí Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky Snadnější výroba Náročná výroba Relativně levné Drahé Vyšší senzitivita Nižší senzitivita Nižší specifita Vysoká specifita Vyšší pravděpodobnost zkřížené reaktivity Nízká pravděpodobnost zkřížené reaktivity Praktické cvičení č. 1 Úkol č. 1 Ředění geometrickou řadou Úkol č. 2 Přesnost pipetování Úkol č. 1 Ředění geometrickou řadou 100 ul/jamka Úkol č. 2 Pipetování • 8 kanálová pipeta • Stepper • 1 kanálová pipeta 100 ul/jamkaRoztok: ředění 1:2 Protokol • Hlavička: • Jméno • Datum • Úloha č. … • Název úlohy • Protokol: • Princip • Pomůcky • Postup • Výsledky • Závěr • Zpracování na PC nebo ručně • Tisk → odevzdání při dalším cvičení Cvičení č. 1 Ředění, pipetování Úloha č. 1 Způsoby ředění, k čemu je to dobré Graf – závislost absorbance na ředění (1:1, 1:2, 1:4 …) Závěr: Jak se absorbance mění, čím je to způsobeno Úloha č. 2 Druhy pipet, proč je důležitá přesnost pipetování Pro každou pipetu spočítat průměr, směrodatnou odchylku, variační koeficient Závěr: Která pipeta byla nejpřesnější