Imunoanalýza
ELISA
Mgr. Julie Štíchová
Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně
Ústav klinické imunologie a alergologie
Imunoanalytické metody
Rozdělení metod dle typu
značky:
oEIA – značkou je enzym
oRIA - radioizotop
oLIA - luminofor
oFIA - fluorofor
Rozdělení metod dle
uspořádání:
oHomogenní
oHeterogenní
oKompetitivní
oNekompetitivní
Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky
Imunoanalytické metody
Heterogenní kompetitivní:
oAnalyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu
oMěřený signál je nepřímo úměrný množství analytu
Heterogenní nekompetitivní:
oDetekční protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán
oMěřený signál je přímo úměrný množství analytu
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek
oVazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky)
oVizualizace - enzymatická přeměna substrátu na barevný produkt
oKřenová peroxidáza (tetrametylbenzidin → tetrametylbenzimidin → 450 nm)
oAlkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát → nitrofenol → 405 nm)
oVysoká citlivost – pg/ml
ELISA - uspořádání
Nepřímá ELISA
oNa analyt se váže primární neznačená
protilátka
oNa primární protilátku se váže sekundární
značená protilátka
Přímá ELISA
oAnalyt (Ab/Ag) imobilizován
oDetekce pomocí značené protilátky
ELISA - uspořádání
Kompetitivní ELISA
oDetekce analytů s malou Mr
Sendvičová ELISA
oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny)
oVysoká přesnost
http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html
Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita
oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více
molekul enzymu – silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací)
Kautování ELISA desky
oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky
1. Povrchová aktivace desky
◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem
◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy
2. Pasivní adsorpce
◦ Hydrofóbní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky
◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a
usnadňuje adsorpci Ag nebo Ab
o Blokování desky
o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu
volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je
nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA
– bovinní sérový albumin
Systém záchytná + detekční Ab
Proč je každá protilátka od jiného živočišného druhu?
Záchytná protilátka
myší, polyklonální
Detekční protilátka
lidská, monoklonální
Lidská monoklonální protilátka – s vysokou
specifitou váže pouze konkrétní antigen
Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže
všechny varianty daného antigenu
Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity,
která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů
(zdroj falešné pozitivity)!!!
ELISA v rutině
oVýrobce dodává kity „ready to use“
+ Úspora času
+ Úspora práce
+ Standardizace metody
- Drahé
Co obsahuje ELISA kit pro rutinu?
• Kautovaná destička se stripy
• Plastová folie na zakrytí destičky
• Kalibrátory
• Pozit. a negat. kontrola
• Promývací roztok
• Ředící roztok (pufr)
• Detekční protilátka
• Substrát
• Stop činidlo (obvykle 1M H2SO4)
ELISA ve výzkumu
o Prázdné destičky – nutno ručně kautovat
a blokovat
oKalibrátory nutné rozpouštět
oKit neobsahuje všechny reagencie
o ELISA pro výzkum je pracnější a
časově náročná
Co obsahuje ELISA kit pro výzkum?
• Prázdné destičky – nemají
stripové uspořádání
• Kit s reagenciemi:
• Lyofilizované kalibrátory
• Primární protilátka
• Sekundární protilátka
• Substrát
Měření výsledků
oPřístroj ELISA reader
oPrincip – vertikální spektrofotometrie
oZdroj světla – Xe výbojka
oVýběr vlnové délky – interferenční filtry
oOptická dráha – 9 optických vláken
(8 měří vzorky, 9. vlákno kontrola intenzity
záření)
o9 detektorů - fotodiody
Hodnocení výsledků
1. Kvalitativní hodnocení
◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce → ano / ne
(např. srovnání vzorku s blankem)
2. Semi-kvantitativní hodnocení
◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru
3. Kvantitativní hodnocení
◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu
◦ Výsledek (absorbance) se odečítá z kalibrační křivky
◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon)
◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml)
Využití ELISA v imunologii
oAntiinfekční imunita
oStanovení protilátek proti některým infekčním agens
oAutoimunitní onemocnění
oStanovení autoprotilátek
ELISA a antiinfekční imunita
oProtilátky proti tetanickému toxoidu
o sledování odpovědi na vakcinaci (snížení u humorálních imunodeficiencí – CVID,
AIDS)
oProtilátky proti difterickému anatoxinu
okontrola očkování (především u starých osob a pacientů s poruchou imunity)
oProtilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus Influenzae
oSledování úspěšnosti vakcinace, humorální imunodeficience
oProtilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu
polysacharidu (anti-PCP)
oSledování úspěšnosti vakcinace (zejména děti), humorální imunodeficience
Autoimunitní onemocnění
oCelá škála autoprotilátek (orgánově nespecifické, orgánově specifické)
oANA – proti jaderným antigenům (SLE)
oENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B, Jo1 atd. –
Sjogrenův sy.)
oAMA – proti mitochondriím (primární biliární cirhóza)
oASMA, LKM, LC – autoimunitní hepatitidy
oANCA – proti cytoplazmě neutrofilů
oAnti-TTG –tkáňová transglutamináza (celiakie)
oAnti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (tyreoitidy)
oRF – revmatoidní artritida
oEMA –proti endomysiu – celiakie
oASCA – proti Sacharomyces cerevisiae – Crohnova choroba