Průtoková cytometrie a stanovení lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně Cluster Designation (Cluster of Differentiation) • buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace • CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno asi 400 znaků. • Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech , trombocytech či jiných buněčných populacích. B lymfocyty CD19 CD20 CD19 Iga Igb (Warnatz K, Schlesier M 2008) T lymfocyty http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tcell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm CD3 na povrchu všech T lymfocytů CD4 na povrchu TH lymfocytů (TH1, TH2) CD8 na povrchu TC lymfocytů Monocyty CD14 HLA DR - součástí nespecifické imunity - schopnost fagocytózy - tkáňová forma = makrofág NK buňky CD16+ CD56+ CD3NKT buňky CD16+ CD56+ CD3+ Pozn. - rozeznávají buňky, které mají na povrchu abnormálně málo MHC I (= nádorové a virově infikované buňky) - používají cytotoxické mechanismy (perforin, granzymy) Pro stanovování lymfocytárních subpopulací odebírat krev do zkumavky s EDTA Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 30min inkubace tma pokoj. teplota protřepat Mnoklonální protilátky • protilátky jsou produktem jediného klonu B lymfocytů (klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily) • jsou naprosto totožné a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu SELEKCE HYBRIDNÍCH BUNĚK V MÉDIU HAT PEG hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium HGPRT= hypoxantin(guanin)-fosforibozyltransferasa;TK=thymidinkinasa Roztok A: na 1,5 l destilované vody – 1,8 ml 99% kyseliny mravenčí Roztok B: na 1,5 l destilované vody 9,0 g bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 Roztok C: na 1,5 l PBS (pH 7-7,4) - 15 g paraformaldehydu LYZOVÁNÍ ERYTROCYTŮ Průtoková cytometrie FLOW CYTOMETRY flow+cyto+metrie - „měření buněk v pohybu“ • možnosti analýzy mnoha vlastností a charakteristik na úrovni jedné buňky během krátkého časového úseku • měření současně více než 20 markerů na jedné buňce • určování fenotypu buněk, monitorování odpovědi na léčbu, výzkum signalizačních drah • klíčovým nástrojem pro výzkum poruch krvetvorby Průtoková cytomerie je technologie umožňující současně měření a analýzu několika fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých částic, které jsou unášeny v proudu kapaliny a prochází paprskem světla. Využití  Klinické využití (imunofenotypizace)  Buněčná biologie (DNA, RNA analýza)  Mikrobiologie (rezistence na antibiotika, kintetika) Co měříme?  Odražené světlo a emitovanou fluorescenci  Částice o velikosti 0,2-150mm  Prokaryotické a eukaryotické buňky  Virové částice, bakterie, houby  Komplexy antigen-proilátky Princip průtokové cytometrie Při průchodu částic laserovým paprskem dochází k rozptylu světla a k fluorescenci navázaných fluorochromů Světelné signály jsou převedeny na elektrické pomocí detektorů (fotonásobiče) Na každé buňce je možné změřit několik parametrů zároveň Naměřená data se ukládají a dále analyzují Tři hlavní systémy průtokového cytometru Fluidní systém transport částic k laserovému paprsku Optický systém laser, zrcadla a optické filtry Elektronický systém převod detekovaných světelných signálů na signály elektronické, které mohou být vyhodnoceny počítačem Fluidika - transport částic v proudu nosné tekutiny k laserovému paprsku Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 HYDRODYNAMICKÁ FOKUSACE – vzorek je vstřikován do proudu nosné tekutiny, která proudí rychleji. Buňky vzorku jsou strhávány jedna za druhou. Proudění nosné tekutiny je laminární – pohyb tekutiny v jednom směru. Vzorek Vzorek Nízký tlak vzorku Úzký proud vzorku Vhodné pro DNA analýzu Vysoký tlak vzorku Široký proud vzorku Nevhodné pro DNA analýzu Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 Velikost vs. granularita Přímý rozptyl – velikost buněk Boční rozptyl – granularita buněk Forward scatter Side scatter Light Scatter: procházející částice vychýlí dopadjící světlo Forward Scatter (velikost) Side Scatter (granularita) FSC vs. SSC Lymfocyty Granulocyty Monocyty RBC, debris, mrtvé buňky FSC SSC granularita velikost Fluorescence Mnoho buněk má stejnou či podobnou morfologii - fluorochromy značené monoklonální protilátky specifické k určitému epitopu Fluorochromy  Jsou excitovány vhodnou vlnovou délkou  Emitují světlo o specifické delší vlnové délce  I neznačené buňky mohou být fluorescentní díky slabé autofluorescenci Fluorochromy: - Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, řada Alexa, řada Pacific and Cascade, AmCyan, Propidium iodide, 7-AAD, CFSE, - Fluorescenční proteiny Phycoerythrins (PE), Allophycocyanin, PerCP, GFP a jiné fluorescenční proteiny Schopné absorbovat fotony budícího záření (např. 488 nm) a následně (10-8 s) emitovat fotony s delší vlnovou délkou (v tomto případě 500 – 800 nm). Fluorescenční světlo má tedy jinou barvu Fluorescence Intenzita fluorescence Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech (tzv. přesvit, překryv spekter) Překryv spekter Vlnová délka Intenzitafluorescence Překryv spekter Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu Kompenzace http://www.cytometry.org Optika  Excitační optika laser a systém čoček, které zaostřují a směřují laserový paprsek  Sběrná optika soustava čoček, zrcadel a filtrů, které vedou a rozdělují světlo různých vlnových délek na příslušné detektory excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm) PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm) ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm) PerCP - perridin chlorophyl (678 nm) PerCPCy5.5 - (696 nm) PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm) PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm) excitace He-Ne laserem/red diode (červený) - 633 nm APC - allophycocyanin (670 nm) APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm) excitace UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm Pacific Blue (452nm), BV421 (421 nm) BV510 (510nm) Optické filtry Long Pass filtry (LP) propouští všechny délky vyšší než specifikovaná vlnová délky Short Pass filtry (SP) propouští všechny dělky kratší než specifikovaná vlnová délka Band Pass filtry (BP) propouší specifické rozmezí vlnových délek 500LP 500SP 500/50 500±25 Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 Dichroické filtry – umístěny pod úhlem 45° část světla odráží pod úhlem 90°, část propouští Elektronika  Světelné signály jsou převáděny na elektrické  Detektory: diody a fotonásobiče (PMT, photomultiplier tube) (FSC) (SSC a fluorescnce) Vznik napěťového pulzu Výška: maximální hodnota fluorescence či scatteru Plocha: Integral pulzu Šířka: Čas trvání pulzu Treshold (práh) • Detektory jsou extrémě citlivé a detekují signály z různých zdrojů – prach, malé částice, debris • K jejich eliminaci je třeba nastavit treshold • Nastavuje se na jednom parametru • Při imunofenotypizaci většinou FSC Amplifikace a digitalizace signálnu (Analogue to digital convertor, ADC převodník) Analýza - pro každou buňku hodnoty všech parametrů Analýza naměřených dat Data v LIST MODE FILE Analyzační software Kaluza Infinicyt DiVa FlowJo Summit Vytvoření statistik Výhody a nevýhody průtokové cytometrie výhody • Velké množství analyzovaného materiálu – velké množství dat • Analýza trvá pouze několik minut a poskytuje velké množství informací. • Lze provádět jak kvalitativní, tak kvantitativní analýzu. • Jsou zde možné manipulační operace – např. třídit buňky s vybranými vlastnostmi (cell sorting) nevýhody • Vysoká finanční náročnost • Sestavení experimentu, analýza a vyhodnocování dat závisí na zkušenostech obsluhy • Analýza vzorků co nejdříve po odběru • Nevidíme, kde v/na buňce je signál lokalizován CD3 CD4 CD3+CD4+ CD3-CD4- CD3-CD4+ CD3+CD4CD3 PC5 CD4PE Krevní diferenciál Monocyty Granulocyty Lymfocyty Zkumavka A Zkumavka B Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 58-85 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 30-60 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění  CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)  CD19+ u některých pacientů s CVID  CD19+ B – buněčná leukémie  CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi  CD3+ T – buněčná leukémie  CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV)  CD4+ autoimunity, alergie  CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systematický lupus erythematodes-SLE)  CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV) Příklady využití průtokové cytometrie v praxi Bronchoalveolární laváž (BAL) - imunofenotypizace při převráceném poměru CD4+/CD8+ - podezření na sarkoidózu Pacientka: Ž, *1957 • pacientka z revmatologie - léčba např. rituximabem způsobuje depleci B-lymfocytů (po 4-6 měsících návrat k normálním hladinám) Pacient: muž, * 1966 Leukémie -dovyšetřit CD5+CD19+ buňky CD5+CD19+ CD5+CD19+ : 94.8% Pacient: M, *1999 převrácený poměr CD4/CD8! CD4+ 13,2% CD8+ 50,9% virová infekce??? CD8+CD38+ 83,2% CD8++CD38++ 92,2% HLA-B27 asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc). negativní pozitivní Co určitě vědět • CD znaky charakterizující jednotlivé základní lymfocytární subpopulace • příprava vzorku k imunofenotypizaci • monoklonální protilátky a jejich příprava • průtoková cytometrie – princip metody, příklad fluorochromů • průtokový cytometr – 3 části a jejich funkce • histogram, dot plot, krevní diferenciál • HLA-B27 !!!K protokolu ze cvičení!!! • vedle procentuálního zastoupení jednotlivých lymfocytárních subpopulací (najdete v protokolu z cytometru), uveďte také jejich absolutní počty (vypočítejte) abs. počet leukocytů je 5,7 x 109/l leukocyty jsou tvořeny – lymfocyty, monocyty a granulocyty lymfocyty jsou tvořeny – CD4+ a CD8+ T lymfocyty, B lymfocyty a NK buňkami