Laboratorní diagnostika návykových látek Jana Tomanová Upraveno dle prezentace Veroniky Pleškové Za jakým účelem se stanovují návykové látky? -v rámci policejních kontrol - -k odlišení symptomů nebo k ujištění, že pacient není pod jejich vlivem před některými lékařskými zákroky - -sledování dodržování léčby -u těhotných žen, které mají v anamnéze dřívější užívání drog (užitečné pro následnou péči o novorozence) - -někteří zaměstnavatelé vyžadují drogový screening jako součást vstupních nebo preventivních prohlídek ( zejména u osob, které při výkonu svého povolání mohou ohrozit zdraví a životy ostatních lidí – řidiči MHD, zdravotnický personál apod.) Stanovení na několika úrovních: •Orientační (vhodné i pro terénní účely) •Semikvantitativní (drogový screening v klinických laboratořích) •Konfirmační (analýza ve specializovaných toxikologických laboratořích) Orientační testy - -patří do kategorie testů POCT (rychlá analýza v terénu, u lůžka apod.) -materiál: sliny, moč, krev, pot, pevné látky (ubrousky na kokain) - -možná detekce několika druhů drog v rámci jednoho testu -nižší spolehlivost (95 %), možná falešná pozitivita či falešná negativita (v dané skupině nemusí reagovat všechny strukturní deriváty) - -nemohou samy o sobě odlišit nelegální užívané drogy od komponent stejné třídy, které mohou být obsaženy v předepisovaných lécích (FP) V případě pozitivního výsledku orientačního testu je třeba zajistit materiál a zaslat ho k vyšetření ve specializované toxikologické laboratoři, která k takové analýze má oprávnění! Princip stanovení Schéma uspořádání membrán v LFIA testu (nárys a půdorys); a – podložka pro vzorek, b – podložka pro konjugát, c – membrána s testovací a kontrolní linkou v detekční zóně, d – absorpční podložka, e – plastová výztuž membrány Ukázka membránového testu v kazetě; a – uspořádání membrán v kazetě, b – výsledek testu standardního roztoku bez analytu a s vysokou koncentrací analytu (www.chemickelisty.cz) Drogový screening pomocí testovacích kazet Metoda LFIA •Kompetice drogy ve vzorku se značeným konjugátem drogy imobilizovaným na membráně o vazbu na specifickou protilátku imobilizovanou v testovací a kontrolní zóně testu Drogový screening v klinické laboratoři Imunochemická vyšetření -semikvantitativní stanovení (výsledek je pouze orientační, vyžaduje potvrzení a upřesnění více specifickou nezávislou metodou) - -screeningové metody mohou sloužit pro zaměření na další analytické postupy – vstupní náhled na soubor látek - -uvážení možností imunochemických metod a správná interpretace výsledků slouží k rychlému řešení akutních intoxikací - -materiál: jednorázová moč - nevyžadují izolaci a zakoncentrování analytu vysoká citlivost vysoká rychlost jednoduchost, nenáročnost na kvalifikaci vhodné pro automatizaci vhodné pro sériová vyšetření Kinetická interakce mikročástic v roztoku - KIMS •protilátka proti příslušnému analytu v moči je kovalentně vázána na mikročástice a derivát analytu je připojen k makromolekule • •kinetická interakce mikročástic v roztoku je vyvolána vazbou konjugátu analytu na protilátku na mikročástici a je měřena jako změna průchodu světla. •mezi konjugátem a nekonjugovaným analytem ve vzorku probíhá kompetitivní reakce o vazebná místa protilátky proti analytu navázané na mikročástice • •přítomnost analytu ve vzorku úměrně snižuje nárůst absorbance vůči koncentraci drogy ve vzorku Metoda Měřící rozsah (ng/ml) Cut off (ng/ml) Negativní (ng/ml) Pozitivní (ng/ml) číselná hodnota Pozitivní (ng/ml) Amfetamin/ metamfetamin 300 – 5000 1000 < 1000 1000 – 5000 > 5000 Barbituráty 100 – 400 200 < 200 200 – 400 > 400 Benzodiazepiny 150 – 3000 300 < 300 300 – 3000 > 3000 Marihuana 20 – 300 50 < 50 50 – 3000 > 300 Opiáty 600 – 8000 2000 < 2000 2000 – 8000 > 8000 Kokain 150 – 3000 300 < 300 300 – 3000 > 3000 Metadon 150 – 2000 300 < 300 300 – 2000 > 2000 Fencyklidin 12,5 - 50 50 < 50 - > 50 www.drugdetection.net Plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) -velká specifita hmotnostních spekter - jsou standardem pro identifikaci neznámých látek v toxikologii - -reprodukovatelné retenční parametry, mezilaboratorní přenos retenčních dat, databáze retenčních indexů - -velká separační účinnost GC kapilár - -použití: chemická identifikace širokého spektra neznámých látek potvrzovací analýzy užší skupiny látek kvantifikace – stanovení známé látky GC-MS: potvrzení přítomnosti heroinu http://soudni.lf1.cuni.cz/ GC-MS: intoxikace kokainem a extází http://soudni.lf1.cuni.cz/ Tenkovrstevná chromatografie (TLC) - -využívá princip dělení směsi látek mezi stacionární a mobilní fázi - využívá adsorpční a rozdělovací chromatografii - -využívá princip extrakčního chování nox – dělení na látky bazické, kyselé a neutrální - -denzitometrická kvantifikace (UV, VIS) - -jednoduché a rychlé provedení - -při dobré volbě extrakce a detekčních činidel poskytuje velmi dobré kvalitativní rozlišení neznámé látky - - Tenkovrstevná chromatografie (TLC) - -způsob provedení: Stacionární fáze – silikagel (kyselina křemičitá), oxid hlinitý, komerční přípravky: silufol, kieselgel G Mobilní fáze – směs organických rozpouštědel - -RF faktor – podíl vzdálenosti skvrny látky od startu a vzdálenosti čela rozpouštědla - -RF faktor ovlivňuje: chemická struktura látky složení mobilní fáze pH teplota, vlhkost materiál nosiče - Tenkovrstevná chromatografie (TLC) Mateia Pharmaceutika 5, 1986 ExK – extrakt moče z kyselého prostředí AtKFAD – standard (atropin, kodein, phenmetrazin, aminophenazon, diazepam) HgSO4 / DFK - HgSO4 s difenylkarbazonem Drag. / H2SO4 – Dragendorffovo činidlo s H2SO4 PF – původní forma Mx – analyticky významné metabolity „Osvědčená detekce barbiturátů a jejich metabolitů je způsob, který využívá vytváření málo rozpustných komplexů s rtuťnatými ionty. Následnou aplikací difenylkarbazolu se citlivost detekce zvyšuje, zcitlivění takto provedení detekce má především význam pro ty barbituráty, u nichž je komplexotvornost s rtuťnatými ionty snížena (allobarbital).“ Dragendorffovo činidlo (vodný roztok jodidu draselno-bismutitého) je barevné činidlo používané k důkazu přítomnosti alkaloidů ve zkoumaném vzorku. Pokud jsou ve vzorku obsaženy alkaloidy, reagují s Dragendorffovým činidlem za vzniku oranžové až oranžovočervené sraženiny. Z přednášky Doc. Ing. Drahomíry SPRINGER, Ph.D. EMIT (Enzyme-multiplied immunoassay technique) -Homogenní kompetitivní imunoanalýza - -kompetice mezi látkou ve vzorku a látkou značenou enzymem o vazebná místa na protilátce. - -Enzym = glukoso-6-fosfát dehydrogenáza (G6PDH) -aktivní enzym mění NAD na NADH → změna absorbance - -aktivita enzymu klesá při vazbě protilátky, proto lze koncentraci látky ve vzorku měřit podle změny aktivity enzymu. - - Př. Kotinin v moči (DRI Cotinine Assay, ThermoScientific/ cobas c8000, Roche) - Referenční meze kotininu v moči <30 (nekuřáci) 50-500 (vystavení nikotinu – lehký/pasivní kuřák) >500 (abúzus tabákových výrobků) Vzorek č. Udaná expozice Výsledky [ng/ml] 1 do 5 cigaret denně 389 2 10-15 denně 2009 3 10-15 denně 971 4 15-20 denně 1304 5 20-25 denně 1848 6 25-30 denně 1517 7 15-20 denně 2142 8 10-15 denně 615 9 10-15 denně 589 10 10 denně 1746 11 nekuřák 0 12 příležitostně 0 13 nekuřák 0 15 nekuřák 3 16 nekuřák 0 Konfirmační analýza návykových látek - -základní princip toxikologie: potvrzování výsledků navzájem nezávislými metodami - -klinický a forenzně toxikologický standard současnosti: metody hmotnostní spektrometrie v tandemu s plynovou nebo kapalinovou chromatografií GC-MS, LC-MS - bezpečná identifikaci neznámé látky a přesné stanovení její koncentrace - -výsledky takového konfirmačního vyšetřování je jako jediné možné použít i pro soudně-lékařské účely (tedy pouze laboratoře forenzní toxikologie, soudní toxikologie) http://www.soudnilekarstvi.cz/wp-content/uploads/2014/10/Seznam-laboratoří-kvalifikovaných-pro-vyše třování-specifikovaných-návykových-látek.pdf - -materiál: moč, krev, sliny, pot, vlasy, žaludeční obsah, tkáně, podezřelé látky Další toxikologická vyšetření v klinické laboratoři • •Deriváty Hb (COHb, MetHb, SulfHb, CNHb) - přímá spektrofotometrie - analyzátory ABR s fotometrickým systémem, paralelní stanovení Hb, oxyHb • •Ethanol, Methanol, Ethylenglykol – osmolární okno • •TDM (Therapeutic Drug Monitoring) – imunoanalýza, HPLC, LC-MS • •Li, Pb - AAS • •žena, 71 let, lečí se s hypertenzí a štítnou žlázou, přijata na JIP pro dušnost, slabost, pocit na omdlení, bolest hlavy, opakovaně přítomny stavy “zahledění“ trvající pár sekund. Při příjmu je při vědomí, ale nekontaktní. •vyšetřena na neurologii, CT negativní • •Laboratorní nález: pozitivní marihuana - výsledek konfirmován v Ústavu soudního lékařství (zkřížená reakce vyloučena) • •Pacientka požívání marihuany neguje, včera večeřela bramborák, který jí donesl vnuk…. • •4. den hospitalizace stabilní předána na stand. odd., po kompenzaci TK propuštěna do domácí péče Kazuistika Etanol • akutní: excitační a narkotický účinek na CNS, metabolická acidóza, hypoglykémie, hyperurikémie, ↑ ALT, ↑ osmolalita • •chronický účinek: steatóza až cirhóza jater, ↑GMT, ↑%CDT • •> 3‰ : kóma, křeče, hypotermie (podchlazení), hrozí smrt vyvolána útlumem dechového centra a oběhovým selháním • •u alkoholika nebo osoby dlouhodobě nadužívající alkohol vzniká jakási "rezistence" ( odolnost) a tyto stavy mohou nastoupit až ve vyšším stupni opilosti ) • Otrava alkoholy Metanol •Nejdříve příznaky podobné ethanolu (lehká opilost, horší artikulace) poté 12 – 24 hod. bez příznaků (s kombinaci s alkoholem až 36 hod.) , následuje bolet hlavy, dušnost, bolest břicha , křeče, snížená ostrost vidění, rozvrat met. Procesů • • toxické účinky met. produktů – formaldehydu (na zrakový nerv), kys. mravenčí (met. acidóza) • •tox. dávka – 0,1 ml/ kg, smrtelná dávka – 1 ml/kg • •Léčba: podání antidota (etanol, fomepizol) min. tvorbu tox. produktů (kompetitivní inhibice alkoholdehydrogenázy); HD – odstraňuje metanol i jeho metabolity, koriguje metalické poruchy • Otrava alkoholy Ethylenglykol •metabolizován v játrech působením alkohol - a aldehyd-dehydrogenázy na silné kyseliny (glyoxalovou, šťavelovou, oxalovou), • •vzniká těžká metabolická acidóza, která se prudce zhoršuje a ohrožuje život otráveného • •kys. oxalová se váže s Ca, depozita krystalů šťavelanu vápenatého vedou k poškození buněk (mozek, ledviny, myokard, plíce), také výrazné ↑↑ osmolality • •tox. dávka 200 mg/l, smrtelná dávka: 850- 2000 mg/l (nejednotné údaje) Otrava alkoholy Ethylenglykol •Příznaky otravy: opilost bez zápachu alkoholu • •Neurologické stádium (30 min. – 12 h. po požití) opilost, euforie, smazaná řeč, ospalost, zvracení. Během 4-12 h. rozvoj met. acidózy • •Kardiopulmonální stádium (12-24 h.) – tachykardie, hypo nebo hypertenze, težká m. acidóza a s hyperventylací a selháváním orgánů • •Renální stádium –(24 -72 h.) – hematurie, albuminurie, selhání ledvin, ne vždy úprave fce ledvin • •Léčba: podání etanolu (100x vyšší afinita k ADH); HD – odstraní ET i metabolity, upraví acidózu Otrava alkoholy •žena, 62 let, s hepatální cirhózou, t.č. 2 roky abstinuje od alkoholu • •nalezena doma zmatená se sklenicí modré tekutiny na dně, prázdné blistry od léků (benzodiazepiny), volána RZS • •při příjmu porucha vědomí, těžká metabolická acidóza •vstupní laboratorní nález: ph 6,96 [7,35-7,43]; osmolalita 358 mmol/kg ; Na 141 mmol/l; urea 1,8 mmol/l, glu 8,1 mmol/l, ethanol – 0 mmol/l, tox. screening - neg. •osmolal gap = 66 mmol/kg Kazuistika 10.9.2015 8,50 hod. 10.9.2015 10,20 hod. 10.9.2015 16,30 hod. 10.9.2015 20 hod. 10.9.2015 24 hod. 11.9.2015 1,30 hod Glukóza (mmol/l);[3,9-5,6] 8,1 6,2 8,7 13,0 11,6 Urea (mmol/l);[1,7-8,3] 1,8 2,1 Na (mmol/l);[136-145] 141 145 144 142 140 141 Osmolalita (mmol/l);[275 - 295] 358 351 312 312 327 330 Ethanol (mmol/l) 0 33,7 (1,5 ‰) 13,2 (0,6 ‰) 19,6 (0,9 ‰) 44,3 (2,0 ‰) 47,4 (2,1 ‰) Vypočítaná osmolalita 292 310 312 337 341 Osmolální okno 66 2 0 10 11 Ethylenglykol (g/l) ? 3,69 Závěr: otrava ethylenglykolem Terapie: opakovaná dialýza, terapie alkoholem 1- 1,5 ‰ 11.9.2015 6 hod. 11.9.2015 19 hod. 12.9.2015 5 hod. Glukóza (mmol/l);[3,9-5,6] 8,3 6,1 5,7 Urea (mmol/l);[1,7-8,3] 0,8 2,0 Na (mmol/l);[136-145] 142 140 139 Osmolalita (mmol/l);[275 - 295] 330 285 Ethanol (mmol/l) 44,6 (2,0 ‰) 11,1 (0,5 ‰) 0 Vypočítaná osmolalita 338 285,7 Osmolální okno 8 0,7 Ethylenglykol (g/l) negativní