Dusíkaté látky nebílkovinné povahy Ing. Martina Podborská, Ph.D. OKB FN Brno Zpracováno s pomocí přednášek RNDr. Petra Breineka Školní rok 2015/2016 qhlavní exkreční orgán qhlavní fce: ütvorba a vylučování moče: §vodorozpustné odpadní a toxické látky §produkty metabolismu ü üregulační fce udržení homeostázy üovlivňují metabolismus vody a iontů, osmolalitu a acidobazickou rovnováhu organismu ümístem tvorby erytropoetinu ütvorba aktivní formy vit. D qk posouzení fce a chorob ledvin mohou sloužit následující biochemické parametry q 2 2 Ledviny Hlavní dusíkaté látky nebílkovinné povahy Analyt Zdroj Klinický význam Močovina (urea) Amoniak •Onemocnění ledvin •Onemocnění jater Kreatinin Kreatin •Onemocnění ledvin Kyselina močová Purinové nukleotidy •Zvýšený rozpad buněk •Poruchy metabolismu purinů Amoniak Aminokyseliny •Onemocnění jater •Onemocnění ledvin •Dědičné poruchy urosyntetického cyklu Aminokyseliny Bílkoviny •Onemocnění jater •Onemocnění ledvin •Dědičné poruchy metabolismu aminokyselin 3 qnejčastěji se jedná o odpadní látky, výjimku tvoří aminokyseliny qjako odpadní látky jsou z organismu vylučovány močí qo jejich účinné exkreci rozhoduje především glomerulární filtrace qchorobné stavy, které vedou k jejímu poklesu působí tzv. retenci těchto dusíkatých látek qjejich hromadění v organismu vzestup jejich koncentrace v plazmě vznik tzv. hyperazotémie qzvláště hodnota močoviny a kreatininu se proto používá k diagnostice a sledování průběhu ledvinových chorob q 4 Hlavní dusíkaté látky nebílkovinné povahy 5 Jaké jsou doporučené metody? Analyt Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál Močovina (urea) ID-GC/MS ID-LC/MS •SRM 909b NIST •NIST/SRM 912a Kreatinin ID-GC/MS ID-LC/MS •SRM-NIST 967 •SRM 909b NIST •NIST/SRM 914a Kyselina močová ID-GC/MS HPLC •SRM 909b NIST •NIST/SRM 913a Cystatin C IFCC/IRMM metoda •ERM DA471/IFCC 6 Močovina (urea) qje konečným produktem metabolismu bílkovin (aminokyselin) – detoxikace NH3: • Proteiny • • • Aminokyseliny a-aminokyselina • • •Močovinový cyklus (játra) a-ketokyselina + NH3 • • •Močovina (krev moč) •(ledviny) oxidativní desaminace Močovina (moč) 7 Močovina (urea) qvzniká v játrech (cca 16g/d= 0,5-0,7 mol/d) v močovinovém cyklu (metabolizováním 2,9 g bílkovin vzniká 1g močoviny) • qvylučuje se glomerulární filtrací močí (na rozdíl od kreatininu je zpětně resorbována), malá část je metabolizována ve střevě • qv proximálním tubulu se zpětně resorbuje 40-50% profiltrované močoviny, v distálním tubulu závisí resorpce na tom, zda je vylučována koncentrovaná nebo zředěná moč (dehydratace organismu se projevuje vzestupem močoviny) qklinické využití: üstanovení v séru - diagnostika ledvinových chorob a sledování jejich průběhu üstanovení v moči – odhad stupně katabolismu bílkovin u kriticky nemocných pacientů, sledování dusíkové bilance ü • 8 Močovina (urea) qkoncentrace v krvi závisí na: üvylučování močoviny ledvinami v moči üjejí tvorbě (zvýšený rozpad proteinů horečka, sepse, hladovění) üobsah proteinů v dietě – qreferenční rozmezí: üS-močovina: Muži: 2,0-8,3 mmol/l • Ženy: 2,0 – 6,7 mmol/l • üdU-močovina: 167- 583 mmol/24h • – 9 Močovina (urea) qzvýšená koncentrace v séru může být také způsobena: üzvýšeným příjmem bílkovin v potravě üzvýšeným katabolismem bílkovin u závažně nemocných pacientů üzahuštěním vnitřního prostředí při dehydrataci üsnížením glomerulární filtrace při hypovolémii (extrarenální urémie) – qsnížená koncentrace v séru může být také způsobena: ünízkým příjmem bílkovin v potravě (proteinová malnutrice) ütěžkou poruchou funkce jater - jaterní selhání (nedostatečná tvorba močoviny) ühyperhydratací; retencí vody (infuzní léčba, gravidita) – • • • – 10 Močovina (urea) – metody stanovení •1. Referenční metody: • •a) ID-GC/MS a ID-LC/MS • üstandardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací GC/LC-MS ü •b) HPLC • üvysokoúčinná kapalinová chromatografie • 11 Močovina (urea) – metody stanovení •2. Doporučená rutinní metoda - enzymová: • ükinetický test s ureázou a glutamátdehydrogenázou (GMD): – • • H2N-CO-NH2 + 2 H2O 2 NH4+ + CO32- • •NH4+ + 2-oxoglutarát + NADH L-glutamát + NAD+ + H2O • ürychlost poklesu koncentrace NADH je přímo úměrná koncentraci močoviny ve vzorku a měří se fotometricky při 340 nm ureáza GLDH 12 Močovina (urea) – metody stanovení •3. Elektrochemické metody (biosenzory): • • ü • • GEM 4000, IL 13 Kreatinin qvzniká ve svalové tkáni jako konečný produkt přeměny svalového kreatinu (dehydratace) qkreatin vzniká v játrech, pankreatu a ledvinách, podílí se na tvorbě energie potřebné ke kontrakci svalů • • kreatin + ATP kreatinfosfát + ADP (CK) • • kreatinfosfát kreatin kreatinin + H2O • 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 14 Kreatinin qklinické využití: üstanovení v séru - diagnostika ledvinových chorob a sledování jejich průběhu üstanovení v moči – hodnota pro výpočet kreatininové clearance ü qkoncentrace v séru závisí na: üna jeho vylučování glomerulární filtrací ledvinami üna jeho syntéze ze svalového kreatinu (svalová hmota) – qreferenční rozmezí: üS-kreatinin: Muži: 60 – 100 mmol/l • Ženy: 50 – 90 mmol/l • üdU-kreatinin: 8,8 – 15,0 mmol/24h – ü • 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 15 Kreatinin – metody stanovení •1. Referenční metody: • •a) ID-GC/MS a ID-LC/MS • üstandardní přidání značeného kreatininu (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení kombinací GC/LC-MS • üCertifikovaný referenční materiál: SRM-NIST 967 • 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 16 Kreatinin – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení: • •2.1 Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu: • –a) kreatinináza/kreatináza/SOX (sarkosinoxidáza)/POD (peroxidáza) –b) kreatinináza/CK (kreatinkináza)/PK (pyruvátkynáza)/LD (laktátdehydrogenáza) – •2.2 Stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu: • ükreatininiminohydroláza/GlDH (glutamátdehydrogenáza) • • 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 17 Kreatinin – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení: 2.1 a) Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu: kreatinin + H2O kreatin (kretinináza) kreatin + H2O sarkosin + močovina (kreatináza) sarkosin + H2O + O2 glycin + formaldehyd + H2O2 (sarkosinoxidáza) H2O2 + 4-aminoantipyrin + fenol chinonmonoiminové barvivo + H2O (peroxidáza) ü absorbance vzniklého barviva je úměrná koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku ü reakční uspořádání musí eliminovat endogenní kreatin přítomný v analyzovaném vzorku ü rušící vliv kyseliny askorbové se odstraňuje přídavkem askorbátoxidázy (AOX) 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 18 Kreatinin – metody stanovení 2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení: 2.1 b) Stanovení kreatinu vzniklého z kreatininu: kreatinin + H2O kreatin (kretinináza) kreatin + ATP kreatinfosfát + ADP (kreatinkináza) ADP + fosfoenolpyruvát pyruvát + ATP (pyruvátkináza) pyruvát + NADH L-laktát + NAD+ (laktátdehydrogenáza) ü pokles absorbance při 340 nm způsobený úbytkem NADH je úměrný koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 19 Kreatinin – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - enzymové stanovení: •2.2 Stanovení amoniaku vzniklého z kreatininu: • kreatinin + H2O 1-methylhydantoin + NH3 (kreatininiminohydroláza) •NH4+ + 2-oxoglutarát + NAD(P)H glutamát + H2O + NAD(P)+ (glutamátdehydrogenáza) – ü sleduje se spektrofotometricky pokles absorbance NAD(P)H při 340 nm (optický test), který je úměrný koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku üvýsledek musí být korigován na obsah přítomného amoniaku v analyzovaném vzorku • 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 20 Kreatinin – metody stanovení •3. Doporučené rutinní metody – používající Jaffého reakci: • • kreatinin + kyselina pikrová komplex kreatinin-kyselina pikrová – – ü rychlost tvorby barevného komplexu je přímo úměrná koncentraci kreatininu v analyzovaném vzorku ünespecifičnost měření üreagují: proteiny, ketony, bilirubin, některé léky,… alkalický roztok (NaOH); pH>7 (červenooranžový komplex) 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 21 Kreatinin – metody stanovení •3. Doporučené rutinní metody – používající Jaffého reakci: •Minimální požadavek pro používání: ümetrologická návaznost (SRM-NIST 967) ünávaznost na referenční metodu (ID-GC/MS) ümatematická korekce (odečet pseudokreatininových chromogenů) üJaffého metody v pediatrii jsou pro výpočet eGFR nevhodné üpro stanovení kreatinu v moči lze považovat metody enzymatické a Jaffého za rovnocenné – – 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg 22 Kreatinin – metody stanovení 200px-Kreatinin_good.svg.png Kreatin-kreatinin.jpg •4. Jiné metody: a)Elektrochemické metody (biosenzory) b)HPLC c)CE POCT GEM 4000, IL 23 Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin) qu člověka je konečným produktem metabolismu purinů üpuriny jsou součástí nukleových kyselin (DNA), do krve se dostávají z potravy nebo při rozpadu a obnově buněk těla qje málo rozpustná a cirkuluje v krvi v hladinách blízkých hodnotě, při které již není rozpustná (sodná sůl je rozpustnější (uráty)) qu lidí a primátů chybí enzym urikáza, která umožňuje přeměnu kyseliny močové na lépe rozpustný allantoin Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 24 Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin) qje vylučována z 1/3 zažívacím traktem a ze 2/3 ledvinami; není to jen látka odpadní, má význačný antioxidační účinek • qklinické využití: diagnostika hyperurikémie üdna ürizikový faktor u aterosklerózy üléčba cytostatiky (leukémie, lymfomy) ühyperurikémie jako součást retence dusíkatých látek při renální insuficienci Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 25 Kyselina močová (2,6,8-trioxypurin) qkoncentrace v krvi závisí na: üjejí produkci - potrava bohatá na maso üzvýšená produkce např. při zvýšeném rozpadu buněk (leukémie léčená cytostatiky) üvylučování ledvinami močí • qreferenční rozmezí: üS-kyselina močová: Muži: 200 – 420 mmol/l • Ženy: 140 – 340 mmol/l • üdU-kyselina močová: 0,5 – 6,0 mmol/24h Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 26 Kyselina močová – metody stanovení •1. Referenční metody: • •a) ID-GC-MS • üstandardní přidání značené 1,3-15N kyseliny močové (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení GC-MS • üCertifikovaný referenční materiál: SRM 909b NIST, NIST/SRM 913a USA – •b) HPLC • • Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 27 Kyselina močová – metody stanovení •2. Doporučená rutinní metoda – enzymové stanovení: q používající enzymy urikázu a peroxidázu: •kyselina močová + O2 + 2H2O allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza) • • • • • • Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu H2O + chinonmonoiminové barvivo (peroxidáza) übarevný komplex je přímo úměrný koncentraci kyseliny močové a stanovuje se spektrofotometricky v analyzovaném vzorku 28 Kyselina močová – metody stanovení •3. Jiné metody – enzymové stanovení: q používající enzymy urikázu a katalázu: •kyselina močová + 2H2O + O2 allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza) • H2O2 + methanol formaldehyd (kataláza) •formaldehyd + acetylaceton + NH4+ dihydrolutidin + H2O • üvznik žlutého derivátu dihydrolutidinu - Hantschova kondenzační reakce (stanovení absorbance při 405 nm) • Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 29 Kyselina močová – metody stanovení •4. Jiné metody – enzymové stanovení: q používající enzym urikázu /UV metoda: •kyselina močová + 2H2O + O2 allantoin + CO2 + H2O2 (urikáza) • üjedno z absorpčních maxim kyseliny močové je při 293 nm (UV oblast) üallantoin vzniklý oxidací kyseliny močové při této vlnové délce neabsorbuje ükoncentraci kyseliny močové = úbytek absorbance při 293 nm před a po přidání urikázy k analyzovanému vzorku • • Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 30 Kyselina močová – metody stanovení •5. Elektrochemické metody: q přímá potenciometrie: üměření úbytku O2 Clarkovou elektrodou po přidání urikázy k reakční směsi obsahují analyzovaný vzorek q enzymové elektrody (biosenzory) • • • • • Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 31 Kyselina močová – metody stanovení •6. Chemické metody: q založené na redukčních vlastnostech kyseliny močové: üredukce kyseliny fosfowolframové v alkalickém prostředí za vzniku molybdenové modři nebo redukci železitých nebo měďnatých iontů na železnaté a měďné, které se stanovovují specifickými činidly (deriváty fenantrolinu nebo kuproinu) za vzniku barevných komplexů üvšechny tyto metody jsou nespecifické a pro kvantitativní stanovení kyseliny močové se již nepoužívají Kyselina močová.jpg Kyselina mocova.gif 32 Amoniak (NH3) qamonné kationty NH4+ qvzniká při degradaci bílkovin (katabolismu aminokyselin; oxidativní deaminace) ve všech tkáních, především v játrech (také v ledvinách a svalech). ünezanedbatelným zdrojem amoniaku je také rozklad bílkovin bakteriálními enzymy ve střevě qje toxický, v játrech je přeměňován na močovinu a glutamin üv mozku a jiných tkáních, které nemají schopnost tvořit močovinu, se amoniak detoxikuje transaminační reakcí s 2-oxoglutarátem, za vzniku glutamátu amoniak.gif Amoniak 3D.jpg 33 Amoniak (NH3) qDva hlavní zdroje amoniaku v organismu: üdehydrogenační deaminace glutamátu v buňkách většiny tkání übakteriální fermentace proteinů v tlustém střevě amoniak difuzí přechází do portální krve portální krev má relativně vysokou koncentraci NH3 odstraněn játry ü ü ü ü amoniak.gif Amoniak 3D.jpg 34 Amoniak (NH3) qZvýšená koncentrace v plazmě: üzávažná onemocnění jater (př. selhání jater - akutní nebo chronické těžké poškození jater) üsnížení průtoku krve játry üpři vrozených poruchách enzymů v močovinovém cyklu üReyeův syndrom (vzácné poškození krve, jater a mozku, většina případů je vyvolána virovou infekcí) üselhání ledvin amoniak.gif Amoniak 3D.jpg 35 Amoniak (NH3) q Preanalytická fáze: üstanovení z plazmy (nesrážlivá krev) ükrev se musí po odběru ihned zchladit a zpracovat co nejdříve (centrifugovat v chlazené centrifuze, do 20 min oddělit plazmu od krevních elementů), neboť hrozí falešně zvýšené hodnoty • qReferenční rozmezí: üP-amoniak: 18 – 72 mmol/l – Muži: 15 – 55 mmol/l • Ženy: 11 – 48 mmol/l • • qCertifikovaný referenční materiál: není k dispozici • amoniak.gif Amoniak 3D.jpg 36 Amoniak (NH3) – metody stanovení •1. Referenční metoda: není k dispozici • •2. Doporučená rutinní metoda: • 2.1 Enzymové stanovení: q používající enzym GMD (glutamátdehydrogenázu)/UV: •NH4+ + 2-oxoglutarát + NAD(P)H glutamát + H2O + NAD(P)+ (glutamátdehydrogenáza) ü spektrofotometricky se stanoví pokles absorbance, která je úměrná množství přeměněného NADH na NAD+ při 340 nm ü pokles absorbance je přímo úměrný koncentraci amoniaku amoniak.gif Amoniak 3D.jpg 37 Amoniak (NH3) – metody stanovení •2. Doporučená rutinní metoda: • 2.2 Elektrochemické metody (biosenzory): q přímá potenciometrie q konduktometrie üměří se změna potenciálu nebo vodivosti reakční směsi, která je závislá na množství uvolněných amonných iontů v reakci •3. Jiné metody: • 3.1 Chemické metody: üamoniak reaguje s Nesslerovým činidlem (alkalický roztok jodidortuťnatanu) za tvorby oranžového zabarvení üamoniak reaguje s fenolem a chlornanem za vzniku modře zbarveného indofenolu (Berthelotova reakce) ü metody se již v klinické biochemii nepoužívají •3.2 Mikro-difúzní metoda amoniak.gif Amoniak 3D.jpg Aminokyselina 3D.jpg 38 Aminokyseliny qVýznam stanovení: üdiagnostika dědičných poruch metabolismu AK (screening) ümonitorování výživy u nemocných v těžkém stavu fih.png Aminokyseliny-metabolismus.jpg schema AK cesty.jpg Aminokyselina 3D.jpg 39 Aminokyseliny – metody stanovení •1. Referenční metoda: neuvádí se •2. Chromatografické metody: üIonexová chromatografie üHPLC üGC po převedení aminokyselin na těkavé deriváty üTLC používaná jako semikvantitativní metoda qpro analýzu většího spektra aminokyselin se používají automatické analyzátory aminokyselin •3. Elektroforetické metody •4. Jednoduché chemické reakce •5. Imunoanalytické metody (viz. stanovení homocysteinu) •6. Techniky DNA fih.png 40 Homocystein qneesenciální sirná aminokyselina qnení součástí tělesných bílkovin qvzniká v organismu při přeměně methioninu (Met) na cystein(Cys) - jako degradační produkt S-adenosylmethioninu (donor merhylenové skupiny) Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png Homocistein-CARDIOvitamin-transENl.jpg Převzato z: http://www.cardiovitamin.com/en/physicians/ qnezávislý rizikový faktor: ükardiovaskulární onemocnění üperiferní vaskulární onemocnění (arteriální i žilní trombóza) ücerebrovaskulární onemocnění üopakované ztráty plodu Rizikový faktor je přibližně stejný jako u hyperlipidémie a kouření. 41 Homocystein qReferenční rozmezí: üP-homocystein: 5 – 15 mmol/l – qCertifikovaný referenční materiál: NIST SRM 1955 qMetody stanovení: –1. HPLC –2. Imunochemické metody –3. Enzymové metody –4. GC-MS – ü Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png 42 Homocystein – metody stanovení Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png •1. HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) üdeproteinace üredukce üderivatizace üanalýza üdetekce (fluorometrická) 43 Homocystein – metody stanovení Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png •2. Imunochemické metody üredukce oxidovaných forem (např.1,4-dithio-D,L-threitol) üenzymatická přeměna homocysteinu na S-adenosylhomocystein ükompetitivní imunochemická reakce se specifickou monoklonální protilátkou üdetekce – qDalší metody: ELISA,imunoturbidimetrie, chemiluminiscence,… 44 Homocystein – metody stanovení Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png •3.1 Enzymová metoda („cyklická“): •Hcy + L-serin cystathionin (CBS - cystathion β-syntáza) •cystathionin pyruvát + amoniak + Hcy (BBL - cystathion β- syntáza ) •pyruvát + NADH L-laktát + NAD+ (LD - laktátdehydrogenáza) – ü spektrofotometrické stanovení - pokles absorbance při 340 nm 45 Homocystein – metody stanovení Homocystein.png L-Homocysteine-3D-balls.png •3.2 Enzymová metoda („cyklická“) – Roche: qnejdříve je oxidovaná forma Hcy redukována na volný Hcy • Hcy + SAM SAH + Met • HMTasa (homocystein-S-methyltransferáza) • SAH Hcy + Adenosin • SAHasa (SAH hydroláza) • Adenosin Inosin + NH3 • ADA (adenosindeamináza) •NH3 + NADH + 2-oxoglutarát glutamát + NAD+ + H2O • GIDH ü spektrofotometrické stanovení - pokles absorbance při 340 nm •SAM (S-adenosylmethionin), SAH (S-adenosyl-homocystein), Hcy (Homocystein), Met (Methionin), GlDH (Glutamátdehydrogenáza) Děkuji za pozornost.