Glykovaný hemoglobin Ing. Martina Podborská, Ph.D. OKB FN Brno Školní rok 2017/2018 2 Glykovaný hemoglobin (HbA1c) qhttp://old.lf3.cuni.cz/diabetologie/Inz_Glykace.htm ü q qHemoglobin [http://sweet-about-me.webnode.cz] ü q qHbA1c je základní vyšetření pro dlouhodobé sledování diabetu mellitu 3 HbA1c – klinický význam qrutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM (diabetu) qHbA1c ukazatel dlouhodobé průměrné koncentrace glukózy v krvi (období cca 6-8 týdnů nazpět) umožňuje posoudit dlouhodobou kompenzaci diabetu qdiagnostické kritérium DM qkontrola terapie qvčasné odhalení hrozících komplikací qhodnocení vyšetření: q q Hodnota HbA1c Interpretace výsledků < 4,5 % Dobrá kompenzace diabetu 4,5 – 5,3 % Uspokojivá kompenzace diabetu ˃ 5,3 % Neuspokojivá kompenzace diabetu 4 Glykace qGlukóza je aktivní molekula – účastní se glykačních a autooxidačních reakcí vznik reaktivních látek zvyšujících oxidační stres, které zasahují do mechanismů zánětlivé reakce qGlykace bílkovin je založena na chemické vazbě glukózy na N-koncové aminokyseliny bílkovin: üaldehydická skupina glukózy reaguje s volnou aminoskupinou proteinů bez enzymové katalýzy za vzniku glykovaného proteinu q q 5 Glykace qHbA1c („dlouhý cukr“) je látka, která vzniká v organismu neenzymatickou reakcí tzv. glykací mezi hemoglobinem (červené krevní barvivo) a glukózou (krevním cukrem) qGLYKACE: je neenzymové navázání (adice) cukru na proteiny za vzniku fruktosaminu qfaktory ovlivňující neenzymovou glykaci proteinů: ükoncentrace sacharidů a proteinů a jejich kolísání (koncentrace proteinů v krvi je relativně konstantní, rychlost glykace je úměrná koncentraci sacharidů) üdoba expozice übiologický poločas daného proteinu üteplota ü ü q 6 Glykace hemoglobinu qrychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin) qpomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního ketoaminu (ireversibilní) qkoncentrace závisí na koncentraci glukózy a poločasu života erytrocytů q 7 HbA1c – glykace q qZdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka ü q qHbA1c vzniká glykací na N-konci b-řetězce hemoglobinu q 8 Hemoglobin qSložená bílkovina – hemoprotein: übílkovina – globin ühem q qIllustration copyright 2000 by Nucleus Communications, Inc. All rights reserved. http://www.nucleusinc.com ü q qhttps://fmss12ucheme.wordpress.com/2013/05/06/hemoglobin/ ü q qhlavní fce: je to transportní molekula plynů a tvoří 95 % objemu erytrocytů 9 Hemoglobiny q qZdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka ü q 10 Výhody stanovení HbA1c vs. glykémie qnení třeba konzervovat krev (větší stabilita) qmenší intraindividuální variabilita (CV<2%) qHbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií qnemocný nemusí být lačný qvyužití pro diagnostiku i kontrolu léčby q 11 Vyjadřování výsledků HbA1c qnení třeba konzervovat krev (větší stabilita) üod 1.1. 2012: mmol/mol (např.45 mmol HbA1c/mol Hb) ü ü(%) DCCT (převážně v USA) (Diabetes Control and Complication Trial) q2010, konsensus ADA, IFCC, IFD, EASD, ISPAP 12 Rozhodovací meze HbA1c Referenční interval 20 – 42 mmol/mol Rozhodovací meze Kompenzovaný diabetes (dospělí, negravidní) 43 – 60 mmol/mol qPreanalytické požadavky: üAnalyzovaný materiál: B – odběr do EDTA üstabilita: 2d (+20 až +25°C); 1 týden (+4 až +8°C); 1rok (<-20°C lépe při -80°C) qPoznámky: üsnížená hodnota doby života erytrocytů ühemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti) – ovlivnění koncentrace HbA1c v rutinních metodách ü ü ü ü 13 Požadavky na analytickou kvalitu měření Mezilehlá preciznost CV < 1,0 % Pravdivost (Bias) B < 1,5 % Celková chyba TE < 6,9 % Metrologická návaznost referenční metoda LC-ESI/MS Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0 Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5 Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit 3,1 q www.westgard.cz qDoporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 18.2.2015 14 Nejistota výsledků měření qna základě kombinace dílčích nejistot odpovídajících preciznosti, hodnotě bias a hodnotě Cvi lze odhadnout výslednou kombinovanou nejistotu výsledků měření (Uc) 6 až 9% (95% interval spolehlivosti) 15 HbA1c – metody stanovení •1. Referenční metody: üizolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c) üenzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C) üanalytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) a)LC/ESI/MS: •Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je ze směsi peptidů separován, detekován, identifikován hmotnostní spektrometrií a kvantifikován na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z analyzovaných vzorků a kalibrátorů se vypočítá hodnota HbA1c. a)CE/ESI/MS: •První separace se provede pomocí HPLC, jednotlivé frakce se sbírají, následuje další separace této směsi pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na základě různých elektromigračních časů a kvantifikovány spektrofotometrickým detektorem. 16 HbA1c – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - chromatografické: a)Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová): qzaložena na interakci glykovaného hemoglobinu s imobilizovaným boronátovým aniontem qpo eluci neglykovaných frakcí hemoglobinu, dojde k uvolnění vazby a po eluci se stanoví hemoglobinové frakce detektorem, který měří absorbance při 415 nm qkoncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu q Princip boronátové chromatografie 17 HbA1c – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - chromatografické: •b) Kapalinová chromatografie s výměnou iontů (IEC) qseparace hemoglobinů a jeho složek na slabě kyselých ionexech qjednotlivé frakce hemoglobinu jsou rozděleny podle jejich různých fyzikálně-chemických vlastností (velikost náboje) v měnícím se prostředí (změna koncentrace iontů, změna pH) qfrakce se po rozdělení detekují v mobilní fázi detektorem, který měří absorbance při 415 nm qkoncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu podle kalibrační křivky pomocí softwaru chromatografu q •c) HPLC (Vysokoúčinná •kapalinová chromatografie) 18 HbA1c – metody stanovení q HPLC 19 HbA1c – metody stanovení q HPLC 20 HbA1c – metody stanovení q HPLC 21 HbA1c – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické: qzaloženy na vazbě protilátek proti b N-terminálně glykované tetrapeptidové nebo hexapeptidové skupině qImunoturbudimetrie, imunonefelometrie: qnejčastěji se používá stanovení TINIA qk analyzovanému vzorku (lyzovaná krev) se přidá specifická protilátka proti HbA1c; nenavázaná (přebytek) protilátka se stanoví po reakci s polyhaptenovým činidlem za vzniku nerozpustného komplexu qrychlost reakce se stanoví turbidimetricky většinou při 340 nm a je nepřímo úměrná koncentraci HbA1c v analyzovaném vzorku • HbA1c + antiHbA1c komplex HbA1c-antiHbA1c •antiHbA1c (přebytek) + polyhapten komplex anti-polyhapten qCMIA • 22 HbA1c – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické: qCMIA: např. Abbott Architect i2000 SR qhemolýza erytrocytů, uvolnění HbA1c qinkubace s magnetickými mikročásticemi, navázání antigenu (HbA1c) qpromytí, odstranění nenavázaného antigenu qpřidání Anti-HbA1c mab (konjugát) značený akridiniem qvazba konjugátu na mikročástice qpromytí, odstranění nenavázaného konjugátu qchemiluminiscence (po změně pH a přidání peroxidu) 23 HbA1c – metody stanovení •2. Doporučené rutinní metody - elektroforetické: q elektroforéza v agarózovém gelu (ELFO) q kapilární elektroforéza (HPCE) q izoelektrická fokusace (IEF) 24 Co může ovlivnit hodnocení vyšetření HbA1c q doba života erytrocytů (120 ± 10 d) ! q přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu (1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD) q hemolýza, ikterus q těžké krvácení q věk, rasa, terapie,… q Děkuji za pozornost.