Laboratorní diagnostika diabetu mellitu Ondřej Wiewiorka 2019 https://doi.org/10.2337/dc19-SppC01 Diabetes mellitus (DM) •Heterogenní onemocnění, jehož hlavním znakem je nedostačující regulace glykémie 1.Diabetes mellitus I. typu (imunitně podmíněný; idiopatický) 2.Diabetes mellitus II. typu 3.Gestační diabetes mellitus 4.Ostatní specifické typy diabetu American Diabetes Association, 2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes—2019, Diabetes Care. 42 (2019) S13–S28. doi:10.2337/dc19-S002. Created by Isaac Yonemoto created with en:pymol, en:inkscape, and en:gimp from NMR structure 1ai0 in the en:pdb. Ref: Chang, X., Jorgensen, A.M., Bardrum, P., Led, J.J. Inzulín DM1- autoimunitní destrukce b-buněk – totální deficientce inzulínu DM2 – postupná ztráta sekrece b-buněk v důsledku rezistence vůči inzulinu DM gestační – diagnostikován ve druhém nebo třetím trimestru, přičemž diabetes nebyl přítomný před těhotenstvím Ostatní specifické DM – novorozenecký diabetes, maturity-onset diabetes of the young [MODY], diabetes exokrinního pankreatu (cystická fibróza a pankreatitida); lékově indukovaný diabetes (glukokortikoidy, léčba HIV/AIDS, transplantace) Dřívější klasifikace, že DM1 je pouze u mladých a DM2 pouze u starších neplatí... Obě věkové skupiny mohou onemocnět obým druhem DM Diagnóza diabetu •Glukóza •Na lačno (alespoň 8 hodin bez příjmu potravy) •≥ 7,0 mmol/l •Náhodný odběr nebo OGTT (75g glukózy ve vodě, odběr po 2 hodinách) •≥ 11,1 mmol/l •HbA1c •≥ 48 mmol/mol Dle současného doporučení •O diagnóze lze rozhodnout pouze na základě opakovaného odběru! • Dle ADA (2019) •O diagnóze lze rozhodnout z jednoho odběru, pokud je hyperglykémie nezaměnitelná (unequivocal) • Prediabetes •Termín používaný u osob se zvýšenou glykémií, ale ne tolik, aby překročili kritéria pro diagnózu diabetu •-> riziková populace pro diabetes 2. typu (≥ 45 let;BMI ≥ 25 kg/m2) •u obézních adolescentů (BMI ≥ 85 percentilu) • •HbA1c (39-47 mmol/mol) • •-> riziko rozvoje kardiovaskulárních • Dle ADA (2019) O diagnóze lze rozhodnout z jednoho odběru, pokud je hyperglykémie nezaměnitelná (unequivocal) • • Laboratorní diagnostika •Glykémie •HbA1c •Glykovaný albumin • Stanovení glykémie •Referenční metoda: ID-GC/MS (izotopová diluce a stanovení GC s MS) •Certifikovaný referenční materiál: SRM 909 NIST, NIST/SRM 917, NIST/SRM 965 (USA) •Alespoň 2x ročně účast v EHK • • Stanovení glykémie Mezilehlá preciznost CV < 2,5 % Pravdivost (Bias) B < 2,0 % Celková chyba TE < 3,1 % Metrologická návaznost referenční metoda Intraindividuální biologická variabilita 4,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 2,5 Interindividuální biologická variabilita 6,9 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 2,2 Celková biologická variabilita 8,9 Celková chyba odvozená z biologických variabilit 6,9 qDoporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 18.2.2015 q www.westgard.cz Stanovení glykémie •Analyzovaný materiál: •B, S, P, U, CSF, výpotek •Preanalytické požadavky: •pro diagnostiku diabetu mellitu je nevhodný odběr krve bez antiglykolitických přísad; ČSKB a Česká diabetol. společnost (2005) doporučují: •odběr krve nalačno (min. 8h lačnění) •stanovení v plazmě žilní krve (EDTA + NaF); (EDTA + NaF + citrát sodný) •oddělení plazmy od krevních elementů ideálně do 60 min po odběru •při sběru moče uchovávat moč do doby analýzy při 4-8°C, je třeba zabránit bakteriální kontaminaci •Hexokinázová metoda • • •Glukózaoxidázová metoda Stanovení glykémie –plazma/sérum/moč/CSF Glukóza v moči •glykosurie: stanovení ztráty glukózy močí •pro diagnostiku DM není stanovení doporučeno •má jen orientační význam •prakticky byla nahrazena selfmonitoringem glykémií • •Spektrofotometricky nebo orientačně suchou chemií (glukózaoxidázová reakce) Stanovení glykémie •Elektrochemické metody •Clarkova kyslíková elektroda •Biosenzory s membránou s GOx • q automatický stolní analyzátor ke stanovení glukózy a laktátu (Biosen) q lanceta q glukometry Glykémie elektrochemicky •Princip: přímé elektrochemické stanovení glukózaoxidázou • 1. glukóza + O2 glukonolakton + H2O2 (glukózaoxidáza) • 2. elektrochemická redukce H2O2 na H2O • 3. vzniklý elektrický proud nebo náboj je úměrný koncentraci glukózy (amperometrické nebo coulometrické stanovení) • H2O2 2H+ + O2 + 2e- reakce na anodě • • 2e- + 2H+ + ½ O2 H2O reakce na katodě • Glykémie elektrochemicky •Princip: přímé elektrochemické stanovení glukózadehydrogenázou • 1. glukóza + NAD + glukonolakton + e + NADH (glukózadehydrogenáza) • 2. glukóza + e-akceptor glukonolakton + redukovaný e-ac (FAD dependentní GLU dehydrogenáza) • •Jako transducery elektronů slouží např. hexokyanoželezitan •Glukometry nemocniční •AccuChek Inform, Hemocue, Stat Strip •Umožňují přenos dat do LIS, monitoring kontroly kvality, do jisté míry vzdálenou správu http://www.hemocue.com/~/media/hemocue-images/hemocuedotcom-images/front-page-home/27853.jpg?mw=676 &mh=290 •Glukometry: •jsou určeny k selfmonitoringu pacientů s DM, dále pro ambulantní měření koncentrace glukózy •použití glukometrů k dg. DM se nedoporučuje •proti referenční metodě nesmí chyba měření překročit: • ± 0,83 mmol/l pro koncentrace < 5,6 mmol/l • ± 15% pro koncentrace ≥ 5,6 mmol/l •kontroly osobních glukometrů srovnáním s měřením v laboratoři se doporučuje provádět v pravidelných časových intervalech minimálně jednou ročně • Glykovaný hemoglobin •Vazba na N-terminální valin betařetězce hemoglobinu • • •rutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM (diabetu) •HbA1c ukazatel dlouhodobé průměrné koncentrace glukózy v krvi (období cca 6-8 týdnů nazpět) umožňuje posoudit dlouhodobou kompenzaci diabetu •diagnostické kritérium DM •kontrola terapie •včasné odhalení hrozících komplikací •hodnocení vyšetření: • Glykovaný hemoglobin HbA1c vs. glykémie •není třeba konzervovat krev (větší stabilita) •menší intraindividuální variabilita (CV<2%) •HbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií •nemocný nemusí být lačný •využití pro diagnostiku i kontrolu léčby • Jednotky HbA1c •od 1.1. 2012: mmol/mol dle IFCC • •V USA % (NGSP/DCCT) používají se paralelně, přepočet jednotek dle vzorce • • • • •Preanalytické požadavky: •Analyzovaný materiál: B – odběr do EDTA •stabilita: 2d (+20 až +25°C); 1 týden (+4 až +8°C); 1rok (<-20°C lépe při -80°C) •Poznámky: •snížená hodnota doby života erytrocytů •hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti) – ovlivnění koncentrace HbA1c v rutinních metodách • Požadavky na analytickou kvalitu Mezilehlá preciznost CV < 1,0 % Pravdivost (Bias) B < 1,5 % Celková chyba TE < 6,9 % Metrologická návaznost referenční metoda LC-ESI/MS qDoporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 18.2.2015 Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0 Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5 Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit 3,1 q www.westgard.cz HbA1c – metody stanovení •Referenční metody (2001): •1) izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c) •2) enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C) •3) analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) pomocí •a) HPLC/ESI-MS: •Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je ze směsi peptidů separován, detekován, identifikován hmotnostní spektrometrií a kvantifikován na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z analyzovaných vzorků a kalibrátorů se vypočítá hodnota HbA1c. •b) HPLC/CE/UV: •První separace se provede pomocí HPLC, jednotlivé frakce se sbírají, následuje další separace této směsi pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na základě různých elektromigračních časů a kvantifikovány UV detektorem. HbA1c – rutinní metody stanovení •Kapalinová chromatografie s výměnou iontů (IEC) •separace hemoglobinů a jeho složek na slabě kyselých ionexech •jednotlivé frakce hemoglobinu jsou rozděleny podle jejich různých fyzikálně-chemických vlastností (velikost náboje) v měnícím se prostředí (změna koncentrace iontů, změna pH) •frakce se po rozdělení detekují v mobilní fázi detektorem, který měří absorbance při 415 nm •koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu podle kalibrační křivky pomocí softwaru chromatografu • •HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) • HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC 30 HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC Biorad - Variant Biorad – D10 HbA1c – rutinní metody stanovení HA-8180V ADAMS™ A1c •2. Doporučené rutinní metody - elektroforetické: • elektroforéza v agarózovém gelu (ELFO) • kapilární elektroforéza (HPCE) • izoelektrická fokusace (IEF) • HbA1c – rutinní metody stanovení q CE Sebia - Capillarys HbA1c – rutinní metody stanovení HbA1c – rutinní metody stanovení •Chromatografické: •Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová): •založena na interakci glykovaného hemoglobinu s imobilizovaným boronátovým aniontem •po eluci neglykovaných frakcí hemoglobinu, dojde k uvolnění vazby a po eluci se stanoví hemoglobinové frakce detektorem, který měří absorbance při 415 nm •koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu • HbA1c HbA1c – rutinní metody stanovení (fructosylvalineoxidase) Direct enzymatic HbA1c method HbA1c HbA1c – rutinní metody stanovení HbA1c – POCT q Boronátová afinitní chromatografie/ fotometrie Infopia Clover U nás v současnosti nejčetnější HbA1c – POCT q Boronátová afinitní chromatografie/ fotometrie Alere (Abbott) - Afinion FDA schválila používání pro diagnózu diabetu mellitu 2. typu HbA1c – POCT q Imunochemický (aglutinace) Siemens - DCA Vantage Pozitivní hodnocení v rámci NGSP Latex enhanced immunoassay method HbA1c - nevýhody • doba života erytrocytů (120 ± 10 d) ! • přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu (1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD) • hemolýza, ikterus • těžké krvácení • věk, rasa, terapie,… • C-peptid a inzulin Stanovení C-peptidu a inzulinu není zakotveno v žádném doporučení pro diagnostiku diabetu a nemá význam při rutinním sledování pacientů s DM. Stanovení C-peptidu se provádí při rozhodování o vhodnosti volby terapie inzulinem u diabetu 2. typu, tj. při podezření na selhání sekrece inzulinu. Vyšetření inzulinu má význam při podezření na inzulinovou rezistenci u syndromu polycystických ovárií a při diagnostice inzulinomu. C-peptid a inzulin • Standardizace probíhá •Používají se imunoanalytické metody •C-peptid – standard WHO IRR 84/510 • • • • Autoprotilátky •Nejsou doporučovány k diagnóze diabetu •Jsou vhodné při podezření na kontrolu původu DM (LADA) • •Kombinované vyšetření 3 autoprotilátek – anti IAA, anti-GAD a anti IA-2 Glykovaný albumin •V doporučeních není zmiňován •Lze použít při snížení životnosti erytrocytů (nedostatek Fe, B12; hemolytická anémie, gestační diabetes...) •Glykace na ε-aminoskupinách lyzinu (12 vazebných míst) •Enzymatická metoda zakončená Trinderovou reakcí + stanovení celkového albuminu bromkresolovým purpurem •-> přepočet na % podíl •Lucica GA-L (Asahi Kasei Pharma) ;quantlLab IL (Werfen); Ref. Metoda: ID-LC-MS/MS Refereční materiál: JCC RM611 Albumin v moči •Včasná detekce predikuje diabetickou nefropatii •Mikroalbuminurie •Doporučené vyšetření 1x ročně u diabetiků • • Děkuji za pozornost •