Lipidy Lipoproteiny Apolipoproteiny 1 2 Desetileté přežití 3 Lipidy • Lipos = tuk •Význam lipidů v organismu • 1) Zdroj zásobní energie alternativní ke glukóze (triacylglyceroly) • 2) Součást buněčných membrán (cholesterol, fosfolipidy) • 3) Biokatalyzátory, hormony • 4) izolační vrstva, ochrana orgánů •Stanovení koncentrace lipidů v krvi nyní bez významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l) • 4 Trávení lipidů • Z webu orion.chemi.muni.cz 5 Transport lipidů • I. Krev a lymfatický systém •Vazba na specifické proteiny • (mastné kyseliny na albumin) •Tvorba makromolekulárních komplexů • •lipidy + apolipoproteiny = lipoproteiny * • II. Zásobní lipidy a v buněčných membránách 6 LPlvelikost Rozdělení lipoproteinů LPchylovrstva Lp(a) Lipoprotein (a) je lipoprotein, jehož koncentrace v krvi je dána geneticky. Podobá se částicím LDL, ale na rozdíl od nich je k apoproteinu B100 disulfidovou vazbou připojen ještě zvláštní apoprotein (a), který je částečně homologní s plazminogenem. Zpomaluje a brání aktivaci plasminogenu na plasmin a tím blokuje odbourávání fibrinu. Proto má zvýšené koncentrace Lp(a) proaterogenní účinek a koncentrace nad 0,3 g/l jsou pokládány za nezávislý faktor zvyšující riziko aterosklerózy. 7 Rozdělení lipoproteinů Zdroj: https://www.lf2.cuni.cz/Ustavy/biochemie/vyuka/cholesterol.ppt 8 Chylomikrony (CM) • vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice • nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou • obsahují apo-B48, stopy apoA (jiné neumí střevní buňka syntetizovat) • syntéza apo-B 48 limituje tvorbu CM • pronikají do lymfy • prostřednictví lymfatických cév jsou transportovány do krve 9 Jaký je osud chylomikronů v krvi ? • do krve vstupují 1-2 h po jídle • z HDL jsou na CM přenášeny Apo E a Apo CII • v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová lipáza 10 VLDL • vznikají v hepatocytech • nesou cholesterol převážně přijatý potravou a triacylglyceroly syntetizované v játrech • obsahují ApoB100, malá množství ApoA a ApoC-I a ApoE 11 • V krevních kapilárách působí na VLDL lipoproteinová lipasa • Triacylglyceroly jsou štěpeny na mastné kyseliny a glycerol • Z HDL jsou na VLDL přenášeny Apo E a Apo CII • VLDL se mění na IDL • IDL jsou vychytány játry nebo přeměněny na LDL Jaké jsou další změny VLDL? 12 • vznikají z VLDL a IDL LDL • oxidované LDL dlouhý poločas LDL částic způsobuje, že: LDL mohou pronikat cévní stěnou ® ukládají se v intimě ® dochází k jejich oxidaci ® oxidované LDL jsou silně aterogenní •„small dense LDL particles“ (malé denzní LDL částice) LDL-III, 1,04-1,06 g/l, <25 nm - silně aterogenní, snadněji pronikají arteriální intimou - špatné rozpoznávání a vychytávání LDL receptory, - snadno se oxidují 13 • IDL i LDL částice mohou být obohacovány estery cholesterolu z HDL • IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-E receptoru • LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi a játry receptorově zprostředkovanou endocytozou (Apo-B 100) Jaký je osud IDL a LDL? 14 HDL • vznikají v hepatocytech (částečně i v enterocytech) • HDL přijímají cholesterol z periferních tkání a zprostředkují jeho transport do jater • pro jejich funkci je důležitý enzym LCAT lecitincholesterolacyltransferáza – esterifikace cholesterolu • existuje několik typů HDL (HDL1 – HDL3), které se liší velikostí a obsahem lipidů 15 • LCAT přenáší mastnou kyselinu na OH skupinu cholesterolu • Cholesterol se esterifikuje, esterifikovaný cholesterol je méně polární a zanořuje se do nitra HDL Funkce LCAT - 16 Lp(a) • Lipoprotein o nízké hustotě • Kromě Apo B100 má navíc Apo(a) • Apo(a) je podobný plasminogenu • Polymorfismus (hustotní a délkový) • Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky Lp(a)2 18 MEZI LIPOPROTEINY PROBÍHÁ VÝMĚNA LIPIDŮ I PROTEINŮ 19 20 •Jaký je stav standardizace metod? • • Jaké jsou doporučené metody? 21 Analyt Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál Cholesterol ID-GC/MS ID-LC/MS SRM 909b NIST; SRM 911b; NIST/SRM 1952a; SRM 1951b NIST Triacylglyceroly ID-GC/MS SRM 909b NIST; NIST/SRM 1951a Cholesterol HDL UC a kvantifikace CDC SRM 911a NIST; NIST/SRM 1951a Cholesterol LDL UC a kvantifikace CDC SRM 911a NIST; NIST/SRM 1951a Apo AI Neexistuje SP1-01 WHO Apo B Neexistuje SP3-07 WHO Lp(a) Neexistuje SRM 2B IFCC 22 Odběr krve • •pacient lačný 12-14h •2-3 dny má být vynechán alkohol, •krev odebrána bez dlouhé venostázy, •pacient má dodržovat alespoň 2 týdny stávající životní styl • • Diagnostické rozhodnutí o přítomnosti zvýšeného rizika je možné pouze na podkladě průměru dvou následných měření z dvou odběrů u jednoho pacienta, provedených v intervalu 1-8 týdnů, nejlépe v téže sérii měření. • Odběr žilní krve na stanovení krevních lipidů má být proveden po lačnění trvajícím 9–12 hodin. Pacient však nemá žíznit, povoleny jsou neslazené a nealkoholické nápoje. Lačnění není nutné, pokud je měřen pouze T-Ch a HDL-Ch; 2–3 dny před odběrem krve se má pacient vyvarovat konzumace alkoholu, který způsobuje sekundární hyperlipidemii. (doporučení české společnosti pro aterosklerosu, Cor Vasa 2007;49(3):Kardio). 23 Odběr krve • • Zdroj: Společné stanovisko českých odborných společností ke konsensu European Atherosclerosis Society a European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine k vyšetřování krevních lipidů a k interpretaci jejich hodnot. Klin. Biochem. Metab., 24 (46), 2017, No. 1, p. 36 Odběr žilní krve na stanovení krevních lipidů má být proveden po lačnění trvajícím 9–12 hodin. Pacient však nemá žíznit, povoleny jsou neslazené a nealkoholické nápoje. Lačnění není nutné, pokud je měřen pouze T-Ch a HDL-Ch; 2–3 dny před odběrem krve se má pacient vyvarovat konzumace alkoholu, který způsobuje sekundární hyperlipidemii. (doporučení české společnosti pro aterosklerosu, Cor Vasa 2007;49(3):Kardio). 24 Stanovení lipoproteinů 1) ULTRACENTRIFUGACE LPultracentrifugace 25 2) ELEKTROFORÉZA 26 3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE LP rutinni 27 Apolipoproteiny • PROTEINOVÁ SLOŽKA LIPOPROTEINŮ • FUNKCE: AKTIVÁTORY A INHIBITORY ENZYMŮ interakce s RECEPTORY tvorba buněčných STRUKTUR účast na přenosu nebo výměně lipidových částic 28 ApoAI apolipoprotein v HDL ApoB-100 apolipoprotein v LDL a VLDL ApoB-48 apolipoprotein v chylomikronech Apo(a) apolipoprotein v Lp(a) • 29 Význam stanovení ApoB-100 §Informace o počtu LDL částic Ø1 částice LDL obsahuje 1 částici Apo-B100 a různé množství cholesterolu a triacylglycerolů ØPři stejné hodnotě LDL cholesterolu vyšší hodnota Apo-B100 svědčí o větším počtu LDL částic (převaha malých hustších částic) ØPosouzení rizika kardiovaskulárních následků aterosklerózy 30 Stanovení ApoAI a ApoB 1) IMUNOTURBIDIMETRIE 2) IMUNONEFELOMETRIE • Referenční metody nejsou definovány • CRM: SP1-01 a SP3-07 31 Cholesterol • • • • chol bílá krystalická látka Cca ¾ cholesterolu je nově syntetizováno, ¼ pochází ze stravy 32 Cholesterol celkový = Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný 33 Stanovení cholesterolu •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • • kalibrátor NIST-SRM 911b • vnitřní standard (3,4-13C2) cholesterol • derivatizace TMS(trimethylsilylether) • m/z analyt 458 • m/z vnitřní standard 460 • CV(průměr) 0,8% • bias -0,5% (-1,4 až + 0,5%) • •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 Ještě poměrně nedávno CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) upravená Abell-Kendallova metoda. Abell-Kendall: A method for estimating total serum cholesterol levels that involves saponification of cholesterol ester by hydroxide, extraction with petroleum ether, and colour development with acetic anhydride–sulphuric acid. Other methods are assessed against this reference standard method. Abell-Kendallova metoda je součástí ref. metody pro stanovení HDL-cholesterolu. Abell-Kendall vychází z původní metody dle Lieberman-Burchardta – rce s kys. sírovou v bezvodém prostředí kys. octové a anhydridu kys. octové – zelené nenasycené sloučeniny, stanovované fotometricky. NESPECIFICKÉ, NEDOPORUČOVANÉ!!! 34 Cholesterol • • 2. Enzymové stanovení • •Hydrolýza esterů cholesterolu • (CHE, cholesterolesterasa) •Oxidace cholesterolu • (CHOD, cholesteroloxidasa) •Barevná reakce (oxidační kopulace) • (POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce) • 35 • • • •estery cholesterolu + H2O « cholesterol + mastné kyseliny (CHE) • cholesterol + O2 « Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD) • • • H2 O2 + chromogen « H2 O2 + barvivo (POD) • • • •H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • • • • • 36 Stanovení HDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL ze séra ultracentrifugací • 2) odstranění IDL,LDL, a Lp(a) precipitací činidlem MnCl2+heparin a centrifugací • 3) stanovení cholesterolu v supernatantu • referenční metodou Abell-Kendall (CDC metoda) • • • Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 Abel-Kendall: A method for estimating total serum cholesterol levels that involves saponification of cholesterol ester by hydroxide, extraction with petroleum ether, and colour development with acetic anhydride–sulphuric acid. Other methods are assessed against this reference standard method. Chemická hydrolýza (alkalický hydroxid a zvýšená teplota) esterů cholesterolu. Interferující látky se odstraňují extrakcí cholesterolu do organické fáze. Cholesterol se stanovuje modifikovaným Liebermann-Buchardovým činidlem. (Klinická biochemie – bakalářský obor Zdravotní laborant, 2015). 37 HDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ (přímé) metody • a)Imunoseparace (Wako) • (protilátky proti lidským ß-lipoproteinům) b)Maskování (Daiichi) • (polyanionové polymery) c)Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) • (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) Stanovení po maskování částic podobné jako u stanovení cholesterolu, trinderova reakce, může být jiné barvivo 38 HDL cholesterol c)Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) • (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) • • •Estery HDL-cholesterolu + H2O HDL-cholesterol + RCOOH (VMK) • •HDL-cholesterol + O2 ∆4- cholestenon + H2O2 • •2 H2O2 + 4-amino-antipyrin + HSDA + H+ + H2O nachově modré barvivo + 5 H2O • • •* HSDA = derivát anilinu [sodium N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin] • PEG-cholesterolesteráza PEG-cholesteroloxidáza peroxidáza Stanovení po maskování částic podobné jako u stanovení cholesterolu, trinderova reakce, může být jiné barvivo 39 Stanovení LDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL a chylomikronů ze séra ultracentrifugací (v supernatntu zůstane směs LDL+HDL o hustotě nad 1,006 kg/l) • 2) stanovení cholesterolu v supernatantu (LDL+HDL) Abell-Kendallovou metodou (CDC) • 3) odstranění LDL precipitací činidlem MnCl2-heparin • v druhé části supernatantu • 4) stanovení cholesterolu po centrifugaci v supernatantu (HDL) Abell-Kendallovou metodou (CDC) • 5) výpočet LDL cholesterolu podle vztahu: • LDLChol=(LDL+HDL)Chol - HDLChol •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 40 LDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ(přímé) metody • •a) metody s maskováním non-LDL částic • •Selektivní rozpuštění LDL-cholesterolu v micelách neionogenním detergentem •Interakce cukerné složky s lipoproteiny (VLDL a chylomikrony) - maskování •oddělení HDL od LDL selektivním detergentem •stanovení cholesterolu v LDL, (reakce enzymů na lipoproteiny jiné než LDL jsou inhibovány surfaktanty a cukernou složkou) •detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení • • •Estery LDL-cholesterolu + H2O cholesterol + VMK (selektivně rozpuštěné v micelách) • •LDL-cholesterol + O2 ∆4- cholestenon + H2O2 • •2 H2O2 + 4-amino-antipyrin + EMSE + H+ + H2O rudo-fialové barvivo + 5 H2O • •* EMSE = derivát diaminu [N-etyl-N-(3-metylfenyl)-N-succinyletylenediamin] • • detergent, cholesterolesteráza cholesterol oxidáza peroxidáza 41 •b) metody s odstraněním non-LDL částic • •Rozložení non-LDL částic za přítomnosti detergentu a polyaniontu, za přítomnosti CHE a CHOD proběhne stanovení cholesterolu na peroxid vodíku, který je rozložen katalasou bez tvorby zbarvení • •po přidání 2.reagencie obsahující detergent dojde k solubilizaci LDL a enzymovému stanovení cholesterolu z LDL částic (detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení) • 42 •3. Výpočet koncentrace LDL cholesterolu(Friedewald) • •LDLChol(mmol/l) = Celkový Cholesterol - HDLChol - 0,45.TG • •nutné stanovit HDLcholesterol, celkový cholesterol a TG •neplatí při hyperTG (různé zdroje, TG do 2 mmol/l resp. 4,5 mmol/l) •požadavek 12-14h lačnění • • • • • 43 Triacylglyceroly • • • Triacylglyceroly = estery glycerolu Problémy při stanovení: volný glycerol diacylglyceroly monoacylglyceroly Odběr krve musí být nalačno (12 až 14h) 44 Stanovení triacylglycerolů •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • kalibrátor NIST-SRM 1595 tripalmitin • vnitřní standard (13C3) tripalmitin • derivatizace N-ethyl-N-trimethylsilylfluoroacetamid) • m/z analyt 215 hlavní měření • 185,231(konfirmační měření) • m/z vnitřní standard 218-187,234(konfirmační měření) • CV(průměr) 0,57% nativní sérum-0,72% lyof. sérum • bias(diference od SRM 909) 0,10-0,25% lyofilizované sérum • 0,14-0,45% nativní sérum •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 45 Triacylglyceroly •2. Enzymové stanovení •Hydrolýza (vznik glycerolu) •Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu) • a)Oxidace glycerol-3-fosfátu • barevná reakce b)Stanovení ADP • stanovení pyruvátu (optický test) • – 46 • • a+b) triacylglyceroly + 3H2O « glycerol + 3 mastné kyseliny • • glycerol + ATP « glycerol-3-fosfát + ADP • • a) • glycerol-3-fosfát + O2 « dihydroxyacetonfosfát +H2O2 • • 2 H2O2 + 4-aminoantipyrin +derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • • • b) • ADP + fosfoenolpyruvát « ATP + pyruvát • • pyruvát + NADH +H+ « laktát + NAD + • • lipáza glycerolkináza (GK) glycerolfosfátoxidáza (GPO) peroxidáza (POD) pyruvátkináza (PK) laktátdehydrogenáza (LD) Triglyceridy-Roche: ad a) H2O2 + 4-aminofenazon + 4-chlorofenol -> 4-(p-benzochinon-monoimino)-fenazon + 2H2O + HCl 47 Doporučené hodnotící meze Analyt Muži Ženy Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00 HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70 Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90 Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00 Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46 Děkuji Vám za pozornost 48 Výsledek obrázku pro cholesterol vtip