Výsledek obrázku pro med muni Cardiac action potential and underlying ionic currents Methods, physiology and selected pathologies Assoc. Prof. MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D. Department of Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University The presentation was created with the support of the FRMU project „Modernization of teaching of cardiac cellular electrophysiology“, MUNI/FR/1490/2018. 1:Ganong´s Review of Medical Physiology, 23rd edition 1 Jak je obecně známo, podkladem fyziologicky probíhající mechanické aktivity srdce je adekvátně utvářená aktivita elektrická. Srdeční svalové buňky jsou jedním z typů vzrušivých tkání. Jsou tedy schopné na stimulaci reagovat vznikem akčního napětí, které se šíří srdeční svalovinou a umožní její následnou kontrakci vedoucí k vypuzení krve ze srdce do krevního oběhu. Elektrická aktivita srdce vzniká a na pracovní myokard se šíří prostřednictvím srdečního převodního systému. Obrazem elektrické aktivity na úrovni jednotlivé srdeční buňky je akční napětí. Jeho konfigurace se zásadním způsobem liší v buňkách převodního systému a v buňkách pracovní svaloviny srdce a rovněž pak v rámci samotné pracovní svaloviny náležící k různým srdečním oddílům a vrstvám. Odlišná konfigurace akčního napětí je podmíněna odlišným zastoupením a aktivitou jednotlivých iontových membránových proudů. Pro správné utváření akčního napětí je klíčová dokonalá souhra těchto proudů. Narušení funkce prakticky kteréhokoliv z iontových kanálů a tedy změna kteréhokoliv z iontových proudů pak může vést ke vzniku proarytmogenního stavu. 1: http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_heart_cardiac_electrophysiology 1 1 Fáze AN. Iontový podklad AN. Význam souhry jednotlivých proudů pro správné utváření AN. Tyto iontové proudy, tedy proudy nesené ionty, které jsou hydrofilními a tedy lipofobními částicemi, tečou přes buněčnou membránu přes speciální proteiny přemosťující buněčnou membránu, tzv. iontové kanály. Ionic Channels Výsledek obrázku pro med muni 1 1:Despopoulos, Color Atlas of Physiology, 2003 1 Iontové kanály – typ pasivního transportu, po elektrochemickém gradientu. Různé typy iontových kanálů. Vrátkování. Impact of Knowledge on Electrical Properties of Cardiac Cells for Clinical Medicine Výsledek obrázku pro med muni 1 →Inherited Arrhythmogenic Syndromes →Acquired Arrhythmogenic Syndromes -On a base of other primary cardiac diseases -Side effects of drugs -Effects of other substances including addictive drugs →Sudden Cardiac Death →Mechanisms of Action of Antiarrhythmic Drugs Electrophysiological Methods in Cardiology 1.On the level of whole organism Example: ECG 2.On the level of the heart Example: Intracardiac ECG 3.On the isolated heart Example: Langendorff heart perfusion 4.On the multicellular cardiac samples 5.On the isolated cardiomyocytes Example: Whole cell patch clamp 6.On the single membrane channels Example: Single channel patch clamp 6. Výsledek obrázku pro med muni Measurements could be performed: 1 Zipes D. and Jalife J. ; Cardiac Electrophysiology: From Cell To Bedside, 2003 1.On the level of whole organism Example: ECG 2.On the level of the heart Example: Intracardiac ECG 3.On the isolated heart Example: Langendorff heart perfusion 4. 1 Basic principle of methods: →We measure the potential difference between two points of a volume conductor →Measured quantity voltage. →Recorded signals represent a sum of contributions of electrical activities of individual cells of the organ during propagation of excitation. Výsledek obrázku pro med muni Electrophysiological Methods in Cardiology Measurements could be performed: Výsledek obrázku pro med muni 1 4.On the multicellular cardiac samples 5.On the isolated cardiomyocytes Example: Whole cell patch clamp 6.On the single membrane channels Example: Single channel patch clamp) 6. Basic principle of methods: →We measure membrane voltage, which is the difference between the extracellular and intracellular medium, or membrane current. Electrophysiological Methods in Cardiology Measurements could be performed: Basic principle of measurements on various levels of organism Výsledek obrázku pro med muni Electrocardiography Výsledek obrázku pro med muni 1 Výsledek obrázku pro outline of figure We record voltage and its changes over the time. EKG t [s] 1:http://www.cndajin.com/group/human-figure-outline/#photo_2 1 Výsledek obrázku pro med muni 1 Adopted from Malmivuo, J., Plonsey, R., 1995. Bioelectromagnetism: principles and applications of bioelectric and biomagnetic fields. Oxford University Press, New York Mechanism of impulse creation: Electrocardiography C:\Users\Roman Kula\Desktop\ezgif.com-gif-maker.gif Výsledek obrázku pro med muni 1 Adopted from Malmivuo, J., Plonsey, R., 1995. Bioelectromagnetism: principles and applications of bioelectric and biomagnetic fields. Oxford University Press, New York Mechanism of impulse creation: Electrocardiography Intracardiac electrocardiography Výsledek obrázku pro med muni 1 1: http://www.medicalexpo.com/prod/osypka/product-111576-879783.html; 2: http://www.drjohnm.dreamhosters.com/wp-content/uploads/2010/12/EPS-Teal_3.jpg →An invasive method, routinely used in clinical practice →Basic principle: A multipolar catheter is inserted into the heart. It is positioned in close proximity along the conduction system. The signal is registered from the tip of the catheter. 1. Multipolar catheter http://www.drjohnm.dreamhosters.com/wp-content/uploads/2010/12/EPS-Teal_3.jpg 2. Intracardial position of the catheter with the example of recorded signal Výsledek obrázku pro med muni 1 We can measure: →Function of sinus node →Conduction thorugh the atrial wall →Conduction in atrioventricular node →Conduction through Hiss bundle →Conduction through Purkinje fibers Hiss bundle electrogram obr4c SA AV EKG EHS PQ QRS A H V PQ segment A V P The interpretation of recorded signal Intracardiac electrocardiography PA HV AH 1 →An experimental methos →The heart is placed in the Langendorff perfusion set: obr8 ccc LW RV aorta → Výsledek obrázku pro langendorff perfusion Principle of the retrogarde perfusion direction of flow of the solution close aortic valve empty ventricles perfusion through the coronary artery 1: https://www.adinstruments.com/research/animal/cardiovascular/isolated-heart-systems/langendorff Výsledek obrázku pro med muni 1 Measuremt on the isolated heart Výsledek obrázku pro med muni Measurement is performed by: 1.electrodes embedded in walls of the bath obr8c reference electrode 2.Epicardial suction electrode Electrogram Monophasic action potential [mV] Measuremt on the isolated heart Výsledek obrázku pro med muni Glass microelectrode Ag/AgCl electrode Reference Ag/AgCl electrode Glass microelectrode Set-up Measurement on multicullular cardiac samples Výsledek obrázku pro med muni →A stimulation of the sample is needed for the measurement →It could be performed in two modes: Im Um Ic Ic Im Um ICa-L INa Ito IK, IK1 current clamp mode voltage clamp mode Measurement on multicullular cardiac samples Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp →Both whole cell patch-clamp and single channel patch-clamp require an isolated cardiac cells. →By the successful dissociation, we obtain a sufficient fraction of viable, funtionally undamaged cells responding to electrical stimulation by: •Contraction •Characteristic electrical activity (action potential and membrane currents) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp Enzymatic isolation of cardiac cells: Possibilities of using patch-clamp 1.Isolated cardiac cells Výsledek obrázku pro med muni 2.Cell lines transiently expressing human ionic channels Measurements could be performed on: 3.Induced pluripotent stem cell-derived cardiac cells (iPSC-CM) Výsledek obrázku pro med muni Patch-clamp 1.Establish a contact with a cell Whole cell patch-clamp Výsledek obrázku pro med muni 2.Measurement on a single cell Two mode of measurement: •Voltage clamp •Current clamp Patch-clamp Whole cell patch-clamp Výsledek obrázku pro med muni Glass microelectrode [pA] Membrane patch with single channel Current flowing through single channel in response to imposed voltage pulse Patch-clamp Single channel patch-clamp Výsledek obrázku pro med muni 5 µM ACh 50 μM ACh Single channel current at -110 mV induced by acetylcholine at rat neuromuscular junction (nicotinic receptors; Mulrine and Ogden) Glass microelectrode Membrane patch with single channel Patch-clamp Single channel patch-clamp Výsledek obrázku pro med muni We can analyse: 1 Possibilities of using patch-clamp Výsledek obrázku pro med muni CONTROL AJMALINE WASH-OUT Výsledek obrázku pro med muni Control After DNP aplication 240 mV 3 nA 50 ms IK(ATP) Měření IK(ATP) Voltage clamp impulse Výsledek obrázku pro med muni Changes after ajmaline aplication 240 mV Measurement of IK(ATP) IK(ATP) in control IK(ATP) after ajmaline aplication Voltage clamp impulse Kontrola Výsledek obrázku pro med muni 1:Bébarová et al. (Naunyn Schmied Arch Pharmacol 2009; 380:125-133); 2: http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_heart_cardiac_electrophysiology 1 2 INa Ito Výsledek obrázku pro med muni 1.Measurement was performed on Induced pluripotent stem cell-derived cardiac cells 2.Inhibition of IKr by nefazodone Work about nefazodonueis from Lee et al., Toxicol Appl Pharmacol 2016; 296: 42-53; 1: Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 1 Odkaz na TZKM Možnost modelovat dědičné arytmie Inhibice Ikr antidepresivem druhé generace nefazodonem (množící se zprávy o jeho proarytmogenní aktivitě) Výsledek obrázku pro med muni Adopted from Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Smeets_without layers_yellow_cut_provoc clinical symptoms: syncope ECG: ST elevation P wave = 80 ms (120 ms) QRS complex = 135 ms (100 ms) QTc interval = 382 ms (440 ms) AH = 109 ms (160 ms) HV interval = 56 ms (50 ms) Pokus_Smeets_smaller_flatten_def_def COOH NH2 Missence mutation in C-terminus INa channel F2004L Výsledek obrázku pro med muni 1.Measurement was performed on cell line transiently expressing human wild-type and mutated (F2004L) INa channel 2.Inhibition of INa in mutated channel F2004L Fig1_functional Adopted from Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni 1.Kinetic scheme of INa channel 2.d Development of slow inactivation Development of closed state inactivation Adopted from Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni Schematic model Adopted from Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Výsledek obrázku pro med muni Adopted from Bébarová et al. , Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 295:H48-H58 Schematic model Výsledek obrázku pro med muni The presentation was created with the support of the FRMU project „Modernization of teaching of cardiac cellular electrophysiology“, MUNI/FR/1490/2018.