Cvičení z klinické imunologie Jarní semestr 2020 Mgr. Peter Slanina Mgr. Julie Štíchová Cvičení z klinické imunologie  13 cvičení, 100% účast povinná  Výstup ze cvičení:  Protokoly (pc, ručně) – odevzdat následující cvičení  Každý protokol si student musí zpracovat sám  Na konci semestru:  Zápočtový test – látka pouze ze cvičení Protokol  Hlavička:  Jméno  Datum  Úloha č. …  Název úlohy  Protokol:  Princip prováděného testu - stručně  Pomůcky  Postup  Výsledky  Závěr Klasické serologické metody aglutinace / precipitace, RID, nefelometrie / turbidimetrie Protilátky Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny Biologický materiál  Žilní krev  (Méně často bronchoalveolární laváž –BAL)  Doručení materiálu:  V rámci nemocnice – ruční donáška  Externí materiál – svoz autem  Odběry krve – uzavřené odběrové systémy Biologický materiál Plazma  Z nesrážlivé krve  EDTA – vyvazuje Ca2+  Heparin – anti IIa/Xa aktivita Sérum  Ze srážlivé krve  Zkumavky s gelem – akcelerace koagulace  Sérum neobsahuje fibrinogen Biologický materiál EDTA HEPARIN SERUM-GEL Vyšetření lymfocytárních subpopulací Funkční testy leukocytů Serologie Laboratórne vyšetrenie IN VITRO  Preanalytická fáza - odber, príprava, spracovanie vzorky pred zahájením laboratórneho vyšetrenia - skladovanie, transport  Analytická fáza - kalibrácia a justovanie zariadení (analýza kontrol- IKK, EHK) - Prevedenie kontrol + lab. vyšetrenia - spracovanie výsledkov, LIS  Postanalytická fáza - skladovanie, likvidácia materiálu - preskúmanie výsledkov, uvoľnenie, uchovávanie LIS - NIS Rozdelenie imunologických laboratórnych metód serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok, Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens bunečné - počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov Serologické metódy Reakcia antigénu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex: 1. Primárna – rýchla, nepozorovateľná voľným okom fáza – tvorba imunokomplexov Ag + Ab – vznik väzby jednotlivých epitopov s väzbovými miestami protilátok 1. Sekundárna – pomalá, pozorovateľná voľným okom fáza – uplatňuje sa multivalencia Ag a polyvalencia Ab – vznik priestorového komplexu Pokiaľ nedochádza k sekundárnej fáze reakcie, je nutné imunokomplexy vzniknuté v primárnej fáze vizualizovať – imunochemické metódy http://www.wikiskripta.eu Imunoprecipitačná krivka Serologické metódy 1. Klasické serologické metódy - Aglutinácia (priama / nepriama) - Precipitácia (v kvapaline, v géle) 2. Imunochemické metódy s následnou detekciou - Imunofluroscencie (priama / nepriama) - Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA) - Imunoblot, imunodot 3. Metódy založené na efektorovom účinku protilátok (využívané v klinickej mikrobiológii) - Komplement fixačné reakcie - Inhibičné a neutralizačné testy Aglutinácia vs Precipitácia Aglutinácia (zhlukovanie) Ag + Ab  Ag-Ab aglutinogén aglutinin aglutinát makromolekulárny imunokomplex korpuskulárny nerozpustný Protilátky namierené proti epitopom antigénnych častíc vytvárajú medzi korpuskulami mostíky, ktoré vedú k vzniku zhlukov (aglutinátov) Precipitácia (zrážanie) Ag + Ab  Ag-Ab precipitogén precipitin precipitát nízkomolekulárny imunokomplex nekorpuskulárny rozpustný Reakcia medzi solubilným antigénom a protilátkou s následným vznikom precipitátu (hydrofóbne väzby – nerozpustný komplex) Aglutinácia 1. Priama - korpuskulárny Ag prirodzene nesie cieľové epitopy - identifikácia baktérií, hemaglutinácia – krevní skupiny 2. Nepriama - rozpustný antigén naviazaný na povrchu vhodných makromolekulárnych častíc (latex) - stanovenie - revmatioidní faktor (RF) - antistreptolysin-O (ASLO) Hodnotenie aglutinácie  KVALITATÍVNE - aglutinácii dochádza / nedochádza (pozitívna / negatívna)  KVANTITATÍVNE - stanovenie najvyššieho riedenia séra, kedy je ešte badateľná aglutinácia = titer - titer (titr) = prevrátená hodnota riedenia séra (riedenie 1:32 → titer 32) Reumatoidná artritída  Symetrické zápalové ochorenie kĺbov  Infiltrácia sinoviálneho tkaniva plazmocytmi, makrofágmi, T a B lymfocytmi  Produkujú zápalové mediátory, ktoré indukujú tvorbu enzýmov degradujúcich bielkoviny, deštrukcia kĺbu  muži : ženy 1 : 2-3  1 % populácie  (Špecifickejší diagnostický test ako RF je stanovenie CCP (cyklické citrulinové proteíny)) Latex-fixačný test  Reumatoidný faktor (RF) - autoprotilátka namierená proti Fc části IgG molekuly - prítomný asi u 80% pacientov s reumatoidnou artritídou - pozitívny je tiež u asi 5-10% chorých s inými systémovými autoimunitnými ochoreniami (autoimunitné hepatitídy, endocarditis lenta) - môže byť pozitívny i u osôb bez příznaků onemocnění (vyšší věk) - diagnosticky najdôležitejší je RF v triede IgM Princíp testu: Stanovenie ASLO nepriamou aglutináciou  ASLO - Anti StreptoLysin O antibodies  Slúži k stanoveniu protilátok v sére proti Streptolysinu O (exotoxín bakterií z rodu Streptococcus)  Diagnostika: retrospektivní průkaz proběhlé infekce, popř. sterilních následků onemocnění  Princíp testu: - streptolysin O je naviazaný na povrchu latexových častíc - pokiaľ sú v sére pacienta prítomné protilátky proti streptolysínu, dôjde k ich naviazaniu na streptolysín na latexových časticiach, aglutinácia častíc, ktorá je okom pozorovateľná Úloha č. 1 Stanovení RF pomocí latexového kitu Precipitácia 1. V géle - Jednoduchá RID (radiální imuno difuze) - Dvojitá RID 2. V tekutom prostredí - Nefelometria - Turbidimetria Precipitácia v géle  Prostredí - agaróza  Je založená na pasívnej difúzii látok v prostredí koncentračného gradientu  Ag aj Ab difundujú gélom a v mieste, kde koncentrácie Ag i Ab dosiahnu optimálneho (ekvimolárneho) pomeru vzniká precipitát Radiálna imunodifúzia (RID)  Pomocou RID je možné stanoviť koncentrácie mnohých bielkovinových súčastí séra  Metodika sa v minulosti používala pri meraní hladín celkového IgG, IgA, IgM, zložiek komplementu alebo rôznych proteínov akútnej fáze- väčšina týchto vyšetrení je dnes automatizovaná a prevádzaná na princípe nefelometrie  Stanovenie C2 a C5 zložiek komplementu Podľa počtu difundujúcich reaktantov  Jednoduchá RID - koncentračný gradient jedného z reaktantov (väčšinou Ag) - druhý reaktant (väčšinou Ab)- rovnomerne rozptýlený v štruktúre gélu - výsledkom sú ostro ohraničené krúžka precipitátu - plocha prstenca = úmerná koncentrácii vyšetrovaného Ag - podľa konc. štandardu – kalibračná krivka - kalibračná krivka: - Charakterizuje vzťah medzi koncentráciou vyšetrovanej látky a priemerom kruhov na príslušnej vyšetrovacej doske  Dvojitá RID (podľa Ouchterlonyho) - sledujeme antigennú príbuznosť antigénov - gradient vytvára ako Ag, tak Ab a dochádza k protismernej difúzii oboch reaktantov (radiálne) - v zóne ekvivalencie – precipitačná línia, ktorá ukazuje na pozitivitu reakcie - hodnotenie: kvalitatívne Precipitácia- v tekutom prostredí  Využíva sa efekt, že pri reakcii Ag-Ab vzniká zákal- precipitát, ktorého intenzita je pri konštantnom množstve pridanej protilátky úmerná pridanej koncentrácii vyšetrovaného antigénu  Meranie intenzity zákalu: nefelometria, turbidimetria  Obe metodiky umožňujú kvantitatívne stanovenie obsahu proteínov vo vzorke odčítaním z kalibračnej krivky Nefelometria a turbidimetria  Metodiky založené na meraní množstva imunitných komplexov vytvorených interakciou špecifických protilátok s antigénom  Stanovenie sérových bielkovín  Meranie prebieha v tekutom prostredí v meracej kyvete (pufr, látka urýchľujúca reakciu, Ag, Ab)  Množstvo vytvorených komplexov je úmerné koncentrácii Ag Precipitácia v tekutom prostredí Nefelometria - vhodná pre nižšie koncentrácie viditeľné svetlo detektor je v smere kolmom na vstupujúci lúč Meria množstvo svetla rozptýleného pri prechode lúča (množstvo svetla odrazeného od vznikajúcich komplexov) Turbidimetria - Vhodná pre koncentrovanejšie roztoky viditeľné svetlo detektor je v ose lúča Meria množstvo prechádzajúceho svetla (úbytok intenzity svetla, ktoré prešlo roztokom v kyvete) nefelometria je 5-10x citlivejšia Beckman Coulter IMMAGE 800  Stanovenie koncentrácie:  Analyzátor I: - imunoglobulíny: IgG, IgA, IgM (g/l) - proteíny akútnej fáze: CRP (mg/l) - (RF+ASLO)  Analyzátor II: - imunoglobulíny: IgM, IgG1,2,3,4 - zložky komplementu: C3, C4, C1q - proteíny akútnej fáze: A1AT (alfa 1 antitrypsin), OROSO (orosomukoid), A2M (alfa 2 makroglobulin), CPL (ceruloplasmin), TRF (transferin), PREA (prealbumin) www.beckmancoulter.com/en/products/ protein-chemistry/immage-800 Siemens BNII  Stanovenie koncentrácie: - imunoglobulíny: IgE (IU/ml), IgD, IgA1, IgA2, IgAp (nízke koncentrácie) - zložky komplementu: C1 inhibitor, C3d www.healthcare.siemens.com/plasma- protein/systems/bn-ii-system IgG 7-16 g/l IgA 0,7-4 g/l IgM 0,4-2,3 g/l CRP <0,5 mg/l C3 0,9-1,8 g/l C4 0,1-0,4 g/l Denná prax na analyzátore  Provozní denník  Údržba analyzátorov: - denná/týždenná/mesačná  Kalibrácie: - 1 krát do mesiaca / pri zmene šarže reagencií - kalibračná krivka  Kontroly IKK: - každý deň, pred zahájením merania pacientskych vzoriek - viazané na metódu, jedno-/viac-úrovňové - referenčné medze  Kontroly EHK (SEKK- systém externí kontroly kvality): - podľa časového plánu - zasielané z externého laboratória (nie je známa výsledná koncentrácia) - prevedie sa meranie → Výsledky sa vo forme protokolu odošlú späť organizátorovi - organizátor porovná výsledky meraní jednotlivých laboratórií a spätne ich informuje o úspešnosti - medzi-laboratórne porovnávacie skúšky Priebeh vzorky  Sérum = odběr srážlivé krve  Alikvotácia vzorky  Vytvorenie pracovného listu pre jednotlivé analyzátory = zoznam vzoriek  Analyzátor = vzorka + špecifické antisérum + pufr (stabilizácia a urýchlenie reakcie)  Analyzátor prepojený s LIS (laboratórny informačný systém)= získa informácie o potrebnom meraní + výsledok automaticky odošle Interpretácia výsledkov  Výsledky sú pred vydaním viacnásobne kontrolované  Pozor:  falošná pozitivita (malá špecificita testu)  falošná negativita (malá senzitivita testu)  Hladina imunoglobulínov IgG, IgA, IgM (g/l): ↑ - zápalové procesy infekčného pôvodu - jedna trieda = myelom; monoklonálna gamapatia - zvyšovanie s vekom ↓ - poruchy tvorby = imunodeficity - lymfomy, leukémie, myelomy, následkom liečby Interpretácia výsledkov  Hladina IgE (IU/ml): ↑ - alergické stavy prvého typu precitlivenosti - parazitárne choroby - autoimunity, imunodeficiencie  Vyšetrenie komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH) ↑ - zápalová aktivita (zriedka) ↓ - vrodená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená spotreba- tvorba imunokomplexov; hereditárny angioedém) Interpretácia výsledkov  Reaktanty akútnej fázy ↑ - akútna zápalová reakcia = opsonizační a prozánětlivý efekt - regulačná funkcia; prenášače iontov; hemokoagulácia CRP (mg/l) ↑ - bakteriálne infekcie - infarkt myokardu, pooperačné obdobie - reumatické choroby Komplementový systém -stanovenie C3 zložky Humorálna zložka vrodenej imunity  Evolučne „starobylý“ systém – primitívne živočíchy disponujú podobnými proteínmi  produkované jaterními bunkami, makrofágmi, ... 9 základných zložiek: C1-C9 Regulátory - pozitívne: properdin (faktor P) - negatívne (inhibítory): C1 INH, CR1, MCP, DAF, faktor H, faktor I, CD59, C4bp Zdroj: Aleshin et al. JBC 287 p10210. membranolytický komplex (MAC) klasická cesta patogén + Ig / CRP C1q,r,s lektinová cesta patogén + MBL MASP 1, 2 alternatívna cesta patogén + C3b C3 konvertáza = C2a+C4b / C3b+Bb C3 C3b C5 C5b C5b C6, C7, C8 poly C9 C2, C4 C2, C4 C5 konvertáza = C2a+C4b+C3b / C3b+Bb+C3b Funkcie komplementu  Lýza buniek, mikroorganizmov (MAC)  Opsonizácia – označenie cudzích buniek a častíc, podpora fagocytózy (C3b)  Chemotaxia – privolanie ďalších zložiek imunitného systému (C3a,C5a)  Propagácia imunitnej reakcie – prozánětlivá aktivita (C3a,C5a)  Immune clearance – odstraňovanie imunokomplexov z cirkulácie (C3b, C4b) Vyšetrenie komplementu Indikácia:  Deficit niektorej zo zložiek?? → testujú sa hladiny jednotlivých zložiek, vyšetria sa funkcie celého systému  Podozrenie na hereditárny angioedém?? → vyšetrí sa hladina a funkcia C1 INH a hladiny jednotlivých zložiek  Monitorovanie zápalového procesu – zložky komplementu sa chovajú ako proteíny akútnej fázy (ich hladina vzrastá pri zápale)  Zvýšená spotreba zložiek?? → pri silnej aktivácii komplementu (diagnostika a monitorovanie imunokomplexových chorôb) Deficity komplementového systému  C1-C4 – deficit spôsobuje častejší výskyt pneumonií, pyogénnych infekcií, častý vývoj, systémových imunokomplexových chorôb (SLE-like)  C3-C9 – najmä náchylnosť k pyogénnym infekciám, u deficitu C9 sú typické opakované meningokové meningitidy  C1 INH – Hereditárny angioedém Úloha č. 2 Stanovení C3 složky komplementu  Kalibrátor – naředit diluentem:  Objem vzorku ve zkumavce: 300ul  Koncentrace kalibrátoru: 100%, 80%, 50% a 25%  Vzorek ?? ul + diluent ?? ul  Pozor: Koncentrace kalibrátoru na zkumavce – opsat si!  Vzorek A+B  Objem vzorku: 300ul  Naředit na 50%  Koncentraci odečíst z kalibrační křivky (sestrojit)