Burst test

                                    (test oxidačního vzplanutí)


Teorie

Test je využíván ke kvantitativnímu vyhodnocení oxidačního (respiračního) vzplanutí fagocytů
(především granulocytů). Pro vyšetření se používá plná nesrážlivá krev odebraná do zkumavek s
heparinem.

Fagocytující buňky se stimulují pomocí bakterií E. coli, fMLP
(N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin) a PMA (phorbol-myristát-acetát). Dochází k oxidačnímu
vzplanutí, při kterém se tvoří reaktivní kyslíkové sloučeniny a radikály, které oxidují
dihydrorhodamin (DHR) na rhodamin. Fluorogenní substrát DHR, který se na začátku přidá k buňkám,
prochází membránou a sám o sobě není fluorescenčně aktivní. Fluoreskuje až produkt (rhodamin),
který vzniká z DHR při oxidačním vzplanutí. Procento granulocytů, ve kterých došlo k oxidačnímu
vzplanutí měříme na průtokovém cytometru. Máme celkem 4 zkumavky: neg. kontrola - bez stimulátoru,
zjistí se podle ní fluorescence pozadí u daného pacienta, 3 zkumavky se stimulátory (E. coli, fMLP,
PMA).


Materiál a pomůcky

Plná krev v heparinu, PBS, dihydrorhodamin 123 (DHR123), E. coli, fMLP, PMA, zkumavky 5 ml,
mikrozkumavky 1,5 ml ("eppendorfky"), vortex, pipety, špičky, ledová lázeň, vodní lázeň 37°C,
lyzátor, cytometr.



Postup


 1. Plnou krev v heparinu rozpipetovat po 100 µl do 4 zkumavek.
 2. Všechny zkumavky dát na 5 min do ledové lázně.
 3. Naředit roztok PMA: k 16 µl rozmraženého PMA přidat 270 µl PBS.

Naředit roztok fMLP: k 15 µl rozmraženého fMLP přidat 30 µl PBS.
 4. K vychlazené krvi ve čtyřech zkumavkách pipetovat:


 a. zk.č.1 – 20 µl PBS
 b. zk.č.2 – 20 µl rozmraženého alikvotu E.Coli
 c. zk.č.3 – 20 µl fMLP
 d. zk.č.4 – 20 µl PMA


 5. Promíchat.
 6. Všechny zkumavky inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
 7. Naředit DHR – Nechat rozmrznout zkumavku s 45µl DHR, přidat 450µl PBS pro BT, důkladně
promíchat na Vortexu.
 8. Dát vychladit PBS tak, aby byl ledový, ale ne zmrzlý.
 9. Po ukončení inkubace přidat ke všem zkumavkám 30µl naředěného DHR. Důkladně promíchat na
Vortexu. Nechat inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
10. Přidat ke každé zkumavce 2ml ledového PBS pro BT. Centrifugovat 2000ot/5min.
11. Slít supernatant, sediment rozmíchat na Vortexu a lyzovat na lyzátoru.
12. Do odečtení uchovávat v ledničce.
13. Odečíst na průtokovém cytometru.



Vyhodnocení


Normální hodnoty při stimulaci - E. Coli          >70%

                                                 - PMA             >90%