CH50

                             Funkční vyšetření komplementového systému

                                     (klasická cesta aktivace)

Teorie:

            Komplement řadíme mezi humorální složky vrozené imunity. Je tvořen souborem asi 30
sérových a membránových termolabilních proteinů, které za normálních okolností kolují v těle ve
formě inaktivních proenzymů. Komplementový systém je aktivován třemi způsoby: alternativní,
klasickou či lektinovou cestou. Po aktivaci komplementu se spouští kaskáda po sobě následujících
kroků, které vedou k amplifikaci imunitní odpovědi a tvorbě lytického komplexu MAC (membrane attack
komplex). Hlavními funkcemi komplementových složek jsou: lýza buněk, opsonizace a chemotaxe.

            CH50 je funkčním testem komplementového systému spouštěného klasickou cestou. K tomuto
účelu se využívají beraní erytrocyty a amboceptor (králičí protilátka proti beraním erytrocytům),
ke kterým se přidá vzorek vyšetřovaného séra. Pokud je komplementový systém v séru funkční, dojde v
přítomnosti amboceptoru k lýze beraních erytrocytů. Uvolněný hemoglobin způsobí zvýšení absorbance
roztoku, která se změří spektrofotometricky. K vyjádření výsledku se používá tzv. jednotka CH-50,
která udává množství komplementu v 1 ml séra, které způsobí za standardních podmínek 50% lýzu
definované suspenze beraních erytrocytů. V prostředí destilované vody dojde ke 100% hemolýze.



Materiál a pomůcky:

5% suspenze beraních erytrocytů, pracovní roztok amboceptoru (králičí protilátka třídy IgM proti
beraním erytrocytům), fyziologický roztok, destilovaná voda, kádinky, mikrozkumavky (eppendorfky),
vortex, centrifuga, reader absorbance, pipety, špičky, stepper + nástavec, mikrotitrační destičky.



Postup:


1.    Příprava sér: Sérum, které bylo do hodiny od odběru zamraženo (složky komplementu jsou
termolabilní!) je nutno rozmrazit na pokojovou teplotu a před pipetováním důkladně promíchat na
vortexu.

     Pro každé sérum připravíme do mikrozkumavky 2 ředění:


     ředění I (40x)  ... 25 ml séra + 975 ml fyz.roz.

     ředění II (60x) ... 15 ml séra + 885 ml fyz.roz.


     Promíchejte na vortexu.



2.    Příprava hemolytického systému: do 5% suspenze beraních erytrocytů se přidá stejný objem
pracovního roztoku amboceptoru (JE NUTNÉ PŘIDÁVAT AMBOCEPTOR DO ERYTROCYTŮ, NE NAOPAK!) – inkubace
15-30 min v lednici.

Na 1 desku se připraví 4 ml hemolytického systému (2 ml suspenze + 2 ml amboceptor).





3.    Rozmístění vzorků na mikrotitrační destičce:

     Každý vzorek séra se pipetuje v dubletu (2 sloupce). Máme 2 vzorky séra, takže obsadíme první
4 sloupce destičky.


Do jamek B,C,D a F,G napipetujte 100 ml fyz. roztoku.

Do jamek A a B napipetujte 100 ml séra ředění I (40x).

V jamkách B promíchejte špičkou obsah a přepipetujte z nich 100 ml do jamek C.

V jamkách C promíchejte špičkou obsah a přepipetujte z nich 100 ml do jamek D

V jamkách D promíchejte špičkou obsah, odsajte z nich 100 ml a vyhoďte.


Do jamek E a F pro příslušný vzorek napipetujte 100 ml séra ředění II (60x).

V jamkách F promíchejte špičkou obsah a přepipetujte z nich 100 ml do jamek G.

V jamkách G promíchejte špičkou obsah, odsajte z nich 100 ml a vyhoďte.


Do liché jamky H napipetujde 100 ml fyz. roztoku, do sudé jamky H 100 ml destilované vody.


Do všech jamek napipetujte 100 ml hemolytického systému (multikanálovou pipetou).


4.    Přikryjte desku víčkem a inkubujte 60 min v termostatu při 37°C.


5.    Centrifugace destičky 5 min při 2000 ot./min (centrifuga MPW, prog. 22)


6.    Po centrifugaci přepipetovat 100ul z každé jamky do nepoužitých jamek mikrotitrační destičky
při zachování pořadí a umístění jamek.


7.    Změřit na readeru absorbanci při 541 nm. (ELISA reader SUNRISE, program CH50)


8.    Výsledky jamek v dubletu vždy zprůměrovat kromě jamek v řadě H. Seřadit dle stoupající
koncentrace séra v jamce – tzn. dle stoupající hemolýzy.