Katedra laboratorních metod Bakalářské studium – zdravotní laborant LF MU Klinická biochemie – cvičení Praktické cvičení č. datum:__________ jméno:______________________ Téma praktika: Biochemické a cytomorfologické vyšetření mozkomíšního moku Okruhy k nastudování a dotazy: 1) Přečtěte si protokol a zopakujte si popsanou problematiku. 2) Které parametry v likvoru stanovujeme na biochemickém automatickém analyzátoru? 3) Které buňky hodnotíme v cytospinu? 4) K čemu slouží výsledky spektrofotometrické křivky likvoru? 5) Co je to izoelektrická fokuzace ? Přístroje a pomůcky: Automatický biochemický analyzátor Vzorky likvoru Úkoly: 1) Rozdělte vzorek likvoru č.1 a č.2 na alikvoty pro biochemické vyšetření a alikvoty pro cytologické vyšetření.Alikvot pro biochemické vyšetření centrifugujte při 2500 otáčkách po dobu 5 minut: 2) Proveďte makroskopický popis vzhledu před centrifugací a po centrifugaci s využitím komentářů používaných na OKBH: Likvor 1: Likvor 2: 3) Proveďte semikvantitativní stanovení koncentrace hemoglobinu pomocí proužku HEMOPHAN: Likvor 1: Likvor 2: 4) Na biochemickém analyzátoru proveďte základní biochemické vyšetření likvidu – stanovení glukosy, CB a laktátu. Výsledky včetně jednotek zapište: glukosa CB laktát Likvor 1: Likvor 2: Normální hodnoty: CB – 0,15 – 0,40 g/l Laktát – 1,2 – 2,1 mmol/l glukosa – 2,5 – 4,0 mmol/l 5) Kvantitativní cytologie – seznámení a demonstrace Připraví se dva preparáty – nativní a barvený. Zatím co počítáme buňky v nativním preparátu, v druhém dochází k cytolýze erytrocytů a obarvení jaderných buněk. Optimální doba barvení je 5-15 minut. Po delší době může dojít k přebarvení buněk a je pak lépe připravit preparát nový. Počítání elementů ve Fuchs-Rosenthalově komůrce: Dle níže uvedeného postupu naplnit komůrku a prohlížet a počítat v mikroskopu za použití objektivu 20 (event. 40). Počítat ve všech , tj. 16 x 16 = 256 čtverečcích. Při velkém množství buněk, lze počítat jen v části komůrky a příslušně vynásobit. a) celkový počet buněk se počítá v nativním likvoru: 20 ul nativního, promíchaného likvoru se napipetuje do komůrky , vloží do mikroskopu a spočítá se. b) počet jaderných elementů se získá po obarvení a rozpadu erytrocytů vlivem kyselé methylvioleti. 50 ul promíchaného likvoru napipetovat na hodinové sklo + 5 ul neředěné barvy (methylvioleť) Promíchat a napipetovat 20 ul nabarveného likvoru do komůrky a spočítat pouze jaderné buňky. Odhad procentuálního poměru mezi jadernými buňkami ( mononukleáry a polynukleáry) se určí až z cytospinového preparátu . c) počet erytrocytů : celkový počet buněk z nativního likvoru -- celkový počet jaderných buněk z obarveného likvoru = počet erytrocytů Takto získané výsledky se dělí 3 a vyjadřují počet buněk v 1 ul. 6) Kvalitativní cytologie - seznámení a demonstrace Zhotovení preparátu na Cytospinu: - na podložní sklo napsat číslo preparátu tužkou - vyjmeme rotor z Cytospinu a zatažením za uvolňovací kolíček odjistíme a odejmeme vrchní průhlednou část rotoru - do kyvety v připraveném klipu napipetujeme 200 ul moku - vložit do rotoru, vyvážit jiným klipem - uzavřít průhledným krytem a zajistit zatlačením na uvolňovací/zajišťovací kolíček - vložit do Cytospinu, uzavřít, zapnout přístroj a dále : 1.vyvolat příslušný program - zmáčknout LOAD 2.zvolit číslo programu 1 3.potvrdit – ENTER 4.START (Nastavení : 800 otáček,10 minut,low-pomalu). Cytospin se sám zastaví,otevřít – OPEN/LID – 2x,cytospinový klip vyndat,odstranit filtrační papír , komůrku namočit do desinfekčního roztoku. - sklo se vzorkem musí být dokonale suché, pak ihned barvit. Barvení preparátu : setem Diff-Quik (MEDION Diagnostics) Set obsahuje 3 roztoky,umožňující rychlé obarvení cytologických preparátů se zcela srovnatelným výsledkem jako při klasickém barvení dle Pappenheima. Roztok I - fixační (Fast green v metanolu) zelenomodrý Roztok II – barvící roztok 1 ( Eosin G v pufru) červenooranžový Roztok III – barvicí roztok 2 (Thiazin v pufru) tmavomodrý Provedení: • sklíčko s cytologickým sedimentem ponoříme 5 x na 1 vteřinu do roztoku I.Přebytek barvy lehce oklepeme do buničité vaty a ze zadní stěny otřeme. • sklíčko ponoříme 5 x na 1 vteřinu do roztoku II a přebytek barvy odstraníme stejným způsobem. • sklíčko ponoříme 4-5 x (dle potřeby) na 1 vteřinu do roztoku III a ihned opláchneme destilovanou vodou. (Nutno používat destilovanou vodu dobré kvality – od Moduláru.) Hodnocení: jádra buněk modrá, cytoplazma šedo-modrá - mononukleáry jádra buněk granulovaná modrá, cytoplazma růžová - polynukleáry červené buňky s projasněním - erytrocyty Normální rozmezí : mononukleáry do 3 /ul polynukleáry do 0,3 /ul erytrocyty 0 /ul Výsledky získané v bodě pět a korigované pomocí cytospinu zapište do tabulky: Počet/ul mononukleáry polynukleáry erytrocyty Likvor 1: Likvor 2: 7) Dle návodu používaného na OKBH proveďte měření spektrofotometrické křivky likvoru. Výsledky včetně spektra zhodnoťte a přiložte k protokolu: Při spektrofotometrii patologického likvoru lze prokázat krevní pigmenty s absorpčními maximy: oxyhemoglobin – HbO[2] 415 nm ( minoritní max.540 a 577nm) methemoglobin - MetHb 407nm bilirubin 420 a 460 nm (měříme při 455 nm) Výsledná spektrofotometrická křivka je sumační - maxima nejsou oddělena, ale často jen naznačena. Přítomnost MetHb se projeví posunem abs. maxima Hb ke kratším vlnovým délkám 410 ‑ 408 nm Hodnocení: 8) Průkaz oligoklonálních pásů v séru a likvoru – seznámení s izoelektrickou fokuzací, ukázka elektroforeogramů a jejich hodnocení: Takto se získají důležité informace pro podporu klinické diagnózy některých demyelinizačních onemocnění (hlavně SM) a infekčních chorob CNS. Použitá metoda : izoelektrická fokuzace na agarózové vrstvě Izoelektrická fokusace bílkovin se využívá k průkazu oligoklonálních pásů IgG v likvoru. Dělení probíhá v elektrickém poli v gradientu pH podle izoelektrického bodu jednotlivých bílkovin. OSN-SPrincip:OSN-E::.::x: Jde o elektroforetickou metodu, při které se látky dělí podle velikosti svého izoelektrického bodu. Izoelektrický bod je taková oblast pH, kdy má částice celkový náboj nulový a v elektrickém poli se nepohybuje. Dělení probíhá v gradientu pH (pH nosiče se v průběhu dělení rovnoměrně mění směrem od kyselé k alkalické oblasti). U anody je pH nejnižší a směrem ke katodě roste. Při dělení narazí bílkoviny na pH svého izoelektrického bodu (pI) a dále se již v el. poli nepohybují. Pro stanovení se nejprve stanoví koncentrace IgG v séru a likvoru, sérum i likvor se naředí na koncentraci 20 mg/l. Při analýze se vždy nanáší vzorek likvoru a séra vedle sebe. Výsledek je positivní v případě, že jsou pásy přítomny. Možnosti přítomnosti pásů: 1) Přítomny v likvoru a nejsou v séru - lokální syntéza imunoglobulinů ve třídě IgG (autoimunitní onemocnění – RS , neuroinfekce - borelióza) 2) V likvoru a séru jsou ve stejném místě – porušena hematolikvorová bariéra (meningitida) 3) Kombinová porucha – více pásu v likvoru než v séru - těžké poškození CNS, encefalitida 4) Přítomnost monoklonálního IgG – 3-4 silné použky v úzkém gradientu pH v séru i likvoru – monoklonální gamapatie