Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-1
Pavel Nezbeda
Kapitola 12 Železo a stopové prvky
Stavby organismu se zúčastňuje celá řada prvků. Jejich účast je různá a podle obsahu se také různě
nazývají.
V této kapitole se zmíníme o železe a ze stopových prvků pak o mědi, zinku, křemíku, selenu, chrómu,
kobaltu, manganu, molybdenu, fluóru a jódu. V tabulce výš jsou zdůrazněny tučným písmem.
12.1. Železo
Železo je jedním z fyziologicky nejvýznamnějších prvků. V organismu dospělého člověka se nacházejí
přibližně 3 – 4 g železa. Železo hraje důležitou roli v řadě redoxních reakcí probíhajících v organismu.
Všeobecně známá je role železa (ve formě iontu Fe
2+
) v hemu, který je součástí hemoglobinu a myoglobinu,
cytochromů, cytochromoxidázy, peroxidázy, katalázy a jiných enzymů. V dýchacím řetězci se ve formě
FeS-proteinu účastní přenosu elektronů. Navzdory nadbytku Fe v přírodě a v erytrocytech, připomíná jeho
metabolismus stopových prvků. V plasmě a ECT i buňkách se nachází velmi málo volného Fe, organismus
se chrání před jeho toxickými účinky. Současně si ale organismus i chrání obsah železa, denně dojde ke
ztrátě pouze asi jedné tisíciny obsahu Fe a ostatní železo se „recykluje“.
12.1.1. Rozdělení železa v organismu
Železo je v organismu rozděleno následujícím způsobem (zaujímá určitou oblast či "oddělení" či „část“,
anglicky „compartement“):
 v hemoglobinu,
 v myoglobinu,
 navázáno na transportní bílkovinu apotransferin (= transferin),
 v zásobní formě (ferritin + hemosiderin) = „sklad“, v tkáních,
 v hypotetickém tzv. „labilním poolu“.
Vstřebávání železa: Železo je do střevních buněk (enterocytů v horní části tenkého střeva, duodenu)
přijímáno jako dvojmocné, takže trojmocné železo, kterého je v potravě přebytek, je před resorpcí nutno
zredukovat na dvojmocné pomocí Fe(III)-reduktázy (předpokládá se, že tuto aktivitu vykazuje duodenální
cytochrom B, Dcytb) v kartáčovém lemu enterocytů (navíc zde působí příznivý vliv různých kyselin, např.
žaludeční HCL, askorbové, ale také jablečné z potravy ap.). Pokud se tak nestane, železo se nevstřebá (!).
Vstup se děje prostřednictvím transportéru pro Me
2+
, tzv. DMT-1 (divalent metal transportér – přenašeče pro
dvojmocné kovy). Mechanismus vstřebávání hemového železa není ještě dostatečně prozkoumán,
pravděpodobně se ho účastní Haem Carrier Protein 1 (HCP1).
DMT1 je znám také jako NRAMP2, tj. natural resistance-associated macrophage protein 2, a také jako DCT1, tj. divalent cation
transporter 1.
Do krevního oběhu se dostává železo z enterocytu pomocí feroportinu-1 (viz odst. 12.1.2.).
S feroportinem (velmi pravděpodobně) spolupracuje hephaestin (HEPH) na mědi závislá feroxidáza, klíčový
protein na průsečíku metabolismu železa a mědi, který mění dvojmocné železo na trojmocné (srovnej
s reakcí katalyzované cerulopasminem na str. 12-2 a v kapitole 13, na str. 13-8). Feroportin i hephaestin
jsou situovány na basolaterální membráně enterocytu (viz obr. na str. 12-4).
*)
vyslov [i´festin]
Asi 75% celkového obsahu železa v organismu se nachází v hemoglobinu, což představuje 2,5 až 3 g
Fe, neboli 44,8 až 53,8 mol Fe. Ve váhovém objemu hemoglobinu je asi 0,34% železa.
Podíl na celkové
hmotnosti
organismu
Prvky Název Jiný název
1 – 60% H, C, N, O, P Stálé primární prvky Prvky I. řádu
0,05 – 1% Na, K, Mg, Ca, S, Cl, Fe Stálé sekundární prvky Prvky II. řádu
< 0,05% B, Sn, F, Cr, I, Co, Si, Mn, Cu, Mo, Ni, Se, V, Zn Stopové prvky invariabilní
Prvky III. řádu,
„mikroprvky“
< 0,05% Li, Rb, Cs, Ag, Be, Sr, Ba, Cd, Al, Ti, Ge, Pb, As Stopové prvky variabilní
Prvky III. řádu,
„mikroprvky“
Hg, Tl, Bi, Au ... Prvky kontaminující
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-2
Pavel Nezbeda
Myoglobin obsahuje celkově přibližně 130 mg Fe, tj. 2,33 mol Fe. Myoglobin velmi připomíná podjednotku
hemoglobinu, netvoří však tetramery a není ovlivňován koncentrací 2,3-DPG (2,3-difosfoglycerát).
Transport železa z orgánu do orgánu zprostředkovává plasmatický transportér apotransferin,
globulin o molekulové hmotnosti 79 600, s dvěma vazebnými místy pro atomy železa na jedné molekule.
Každé místo váže jeden ion Fe
3+
spolu s HCO3
.
Po navázání Fe
3+
má výsledný komplex slabě růžovou
barvu. Tento komplex apotransferin-Fe
3+
se nazývá transferin (TRF), nebo také siderofilin (siderophyllin).
Nachází se i v buněčném cytosolu, tzn., že působí také jako intracelulární přenašeč.
Referenční hodnoty TRF v plazmě jsou 1,8 – 4,0 g/l.
Pokud není železo v trojmocném stavu, jako je tomu např. u hemového železa z rozpadlých erytrocytů
pohlceného makrofágy, převede se před vazbou na apotransferin pomocí ceruloplasminu (bílkovina
s oxidázovou aktivitou) na trojmocné a teprve potom se může na apotransferin navázat:
ceruloplasmin
Fe
2+
Fe
3+
Při překročení vazebné kapacity transferinu se v plazmě vyskytuje železo volné, které je toxické.
Transferin vstupuje do buňky prostřednictvím transferinových receptorů (TfR), procesem zvaným
receptorem zprostředkovaná endocytóza (velmi dobře znázorněno na videu – odkaz pod obrázkem na str. 8-12).
Při tomto ději dojde opět k redukci železa na dvojmocné a jeho uvolnění (kanálem DMT-1) z endosomu do
buňky (endosom = buněčná organela, do níž putují endocytotické váčky).
Video o metabolismu železa je možno nalézt zde.
Hlavní sloučeninou při skladování železa je ferritin, sférická molekula skládající se ze skořápky
apoferritinu a vnitřního krystalického jádra s obsahem Fe. Apoferritin je složen z 24 podjednotek (monomerů).
Pro zvídavé studenty. Podjednotky mají průměr asi 13 nm; vnitřního krystalické jádro je složeno z oxyhydroxidu železitého
(FeOOH)x, dutina ve skořápce má průměr asi 7 nm. Skořápkou do dutiny vede 6 pórů o průměru 0,7 - 1,0 nm, kudy může dovnitř
difundovat, Fe
2+
, kyselina askorbová a FMN. Konec pórů = enzymatická vazba Fe. Při difúzi dvou Fe
2+
dojde k tvorbě FeOOH a jeho
navázání na povrch jádra, které se obvykle skládá z maximálně 2000 atomů Fe (i méně), i když maximálně může být v jádře až 4000
Plasma + ECT
Erytropoesa a
syntéza hemu
Kostní
dřeň
Erytrocyty
Fagocyty
Destrukce
erytrocytů a
katabolismus Hb
Absorpce ze střeva
Sklad
Ferritin +
hemosiderin
Neefektivní
erytropoesa
Ztráty
Krvácení a jiné ztráty
(epiteliální buňky,
erytrocyty v moči a ve
stolici, menstruace 20 –
40 mg Fe, těhotenství
600 – 900 mg Fe; ztráty
z menstruace a
v těhotenství jsou těžko
nahraditelné
M1
Ž2
7
2
26
23
24
23
M1
Ž2
2
5
Čísla vyjadřují přibližně mg Fe směněné za den.
M = muži, Ž = ženy
mg Fe = 0,01791 mmol Fe
Schéma metabolismu a metabolických cest Fe v lidském organismu
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-3
Pavel Nezbeda
atomů Fe. Uvolnění Fe z ferritinu je asi neenzymatické a může obsahovat redukci redukovaným FMN či jinými redukčními činidly.
Uvolněné Fe
2+
difunduje pórem ve skořápce ferritinu . Oxidace i redukce jsou rychlé děje, ferritin je tedy jak pastí na Fe, tak
zdrojem Fe. (Podle Tietz Textbook of Clinical Chemistry)
Ferritin se nachází téměř ve všech somatických buňkách. V hepatocytech v játrech, v systému makrofágů
kostní dřeně a jiných orgánů slouží ferritin jako rezerva železa pro hemoglobin a jiné hemové proteiny. Jako
zásobní ferritin se ukládá železo v případě, že okamžitě po vstřebání nedojde k syntéze hemu. Při velké
nabídce železa se tvoří hemosiderin (viz dál). Celková zásoba železa (především ve formě ferritinu) je u
zdravých jedinců asi 800 mg (14,3 mol) u mužů a 0 - 200 mg (0 – 3,58 mol) u žen
Poškození jater (např. infekčním zánětem jater) vede k uvolnění relativně velkého množství ferritinu do plasmy (!), protože se
ferritin chová jako reaktant akutní fáze (viz kapitola 16, Biomarkery). Nutno brát v potaz při hodnocení stanovených hodnot.
Druhou zásobní formou železa je hemosiderin, agregovaný, částečně deproteinizovaný ferritin, na rozdíl
od ferritinu nerozpustný ve vodných roztocích (původně jediný vzájemný rozlišovací znak). Železo se z
hemosiderinu uvolňuje pouze pomalu, pravděpodobně proto, že se hemosiderin nachází ve velkých
agregátech a má tak mnohem menší poměr povrch/objem. Podobě jako ferritin i hemosiderin se převážně
nachází v buňkách jater, sleziny a kostní dřeně.
Tkáňové železo je obsaženo v enzymech a koenzymech. Mnohé buněčné enzymy a koenzymy vyžadují
železo buď jako součást molekuly, nebo jako kofaktor. Zejména to jsou peroxidázy a cytochromy, železo
však vyžaduje také asi polovina enzymů z Krebsova cyklu. Toto železo, obsažené v enzymech a
koenzymech nacházejících se ve všech jaderných somatických buňkách, se nazývá kompartment
tkáňového železa (tissue iron compartment) či stručně tkáňové železo. Tkáňového železa je asi 8 mg (0,14
mol), malé množství, ale metabolicky kritické (rozhodující). Při deficitu železa mizí tkáňové železo jako
první. (Compartment = prostor, oddělení, přihrádka).
Hypotetický labilní pool obsahuje asi 80 mg Fe, tj. 1,43 mol Fe. Anatomická lokalizace této části není
jasná: je to koncept vycházející z kinetických měření s radioaktivně značeným železem. Má se za to, že se
jedná buď o železo v lymfatickém oběhu, nebo o cytoplasmatické skladovací sloučeniny železa rozdílné od
ferritinu, které se nacházejí ve většině buněk, a které rychle vychytávají či uvolňují železo.
12.1.2. Regulace hladiny železa v organismu
Hlavním regulátorem metabolismu železa
v organismu je hepcidin, peptidový hormon
složený z 25 aminokyselin. Hepcidin je signální
molekula, která zajišťuje komunikaci mezi místy,
kde se Fe schraňuje, střádá, jako jsou hepatocyty
a makrofágy a místy, kde se Fe buď vstřebává
(enterocty), spotřebovává (erytroidní buňky),
anebo recykluje a uvolňuje do krevního oběhu
(makrofágy). Cílovou strukturou působení
hepcidinu je feroportin, což je hlavní bílkovina
zajišťující export Fe z buněk. Hepcidin je
negativní regulátor uvolňování železa
z enterocytů duodena, z makrofágů a
z hepatocytů: zvýšení koncentrace hepcidinu
vede ve zvýšené míře k jeho vazbě na feroportin.
Po navázání hepcidinu se feroportin zanoří do
buňky, kde dojde k jeho rozkladu. Příslušná
buňka tak ztrácí schopnost exportu Fe do plazmy.
Výsledkem zvýšení hladiny Fe je tedy snížení
jeho hladiny v plazmě a zadržení železa
v makrofázích a enterocytech.
Vzhledem k omezeným možnostem vylučování železa z organismu je hlavním mechanismem udržování
homeostázy Fe kontrola jeho příjmu/absorpce v enterocytech, regulovaná právě popsaným mechanismem
účinku hepcidinu. Přitom syntéza hepcidinu je regulována signály reagujícími na zánět, aktivitu erytropoezy,
hladinu Fe a jeho zásoby v organismu a na tenzi kyslíku.
Hepcidin
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-4
Pavel Nezbeda
Nedostatek Fe, hypoxie a
zvýšení erytropoetické
aktivity se zvýšenou
potřebou přísunu Fe
produkci hepcidinu tlumí,
zánět a zvýšená hladina Fe
v krvi či jeho zvýšené
zásoby v organismu
produkci hepcidinu stimulují.
Konkrétní faktory potlačující
produkci hepcidinu však
dosud nebyly kompletně
popsány. Změny v hladině
hepcidinu mohou být jak
vlastní příčinou, tak
následkem změn, které vedu
k anémii a deficitu Fe
v organismu nebo naopak
k jeho akumulaci v buňkách
a tkáních s rozvojem
přetížení organismu
železem.
Poznámka: O stanovení hepcidinu metodou ELISA si můžete počíst zde,případně zde.
Pěkný obrázek transportu železa přes enterocyt, lze nalézt na stránkách Vulpe Lab Univerity of California
Berkeley (http://www.vulpelab.net/)
Regulace systémové homeostázy Fe hepcidinem
(Podle Kolektiv autorů: Význam stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice vybraných typů
anémií dětském věku; Transfuze Hematol. Dnes, 18,2012)
Nedostatek Fe; Akcelerovaná erytropoesa; Hypoxie
X
Nadbytek Fe; Zánět
Enterocyt Makrofág Feroportin
Hepatocyty
Hepcidin X
X
Fe
Fe
Hepatocyty
Hepcidin
Fe
Fe
PLAZMA Fe
PLAZMA Fe
Vysvětlivky:
HC P1 = Haem (Heme) Carrier Protein 1 (protein 1 přenášející hem)
FPN = feroportin; HO-1 = Haem (Heme) Oxygenase (viz kap. 9, str. 9-6)
Gut = střevní; Apical = apikální, vrcholový
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-5
Pavel Nezbeda
12.1.3. Klinické poznámky
V organismu může být jak nadbytek, tak nedostatek železa, hovoříme o poruchách metabolismu Fe.
 Nedostatek Fe
Patří k nejrozšířenějším poruchám, vyskytuje se zvláště u dětí, mladých žen a starých osob. U dětí je
příčinou především dieta (karence, tj. nedostatek v potravě) a zvýšená potřeba železa (růst). U dospělých
jsou příčinou chronické ztráty železa (menstruace), špatné vstřebávání při nemocech trávicího ústrojí a
zvýšená potřeba (těhotenství, kojení). Další příčinou nedostatku železa je krvácení, ať již zjevné nebo skryté
(okultní, často první znak přítomnosti kolorektálního karcinomu). Mezi další známé příčiny ztráty železa patří
jícnové varixy, hemoroidy, polypy apod., vyvolávající příčinou krvácení může být i nadbytečný příjem
některých léků (kyselina acetylsalicylová, nesteroidní antirevmatika, antikoagulancia aj.). Při nedostatku
železa je omezena krvetvorba, dochází ke snížené tvorbě erytrocytů, ty jsou menší (mikrocyty) a jsou
hypochromní (obsahují méně hemoglobinu). Vyvíjí se sideropenická anémie, tj. anémie z nedostatku
železa. Protože železo ke svému fungování potřebuje většina buněk, mohou být projevy z nedostatku
železa patrné i na kůži, nehtech a sliznicích.
Obvykle se pro stanovení nedostatku železa používají hodnoty sérového železa a celkové vazebné kapacity
pro železo.
(Před nástupem anémie dochází k poklesu sérového železa, k poklesu sérového ferritinu a vzrůstu hodnot transferinu,
zvyšuje se volná vazebná kapacita, tj. snižuje se saturace transferinu).
Sérový ferritin má pro tuto poruchu vyšší vypovídací hodnotu než sérové železo.
Jako pomůcka se také používá stanovení koncentrace volného protoporfyrinu erytrocytů (FEP = free erythrocyte
protoporphyrin; viz také poznámku na str. 24), kde se nacházejí zvýšené hodnoty u pacientů s nedostatkem železa (u
thalassemia minor jsou normální hodnoty). Velmi spolehlivou metodou pro diagnostiku nedostatku Fe je
cytochemické stanovení aspirátu kostní dřeně reakcí s pruskou modří, na průkaz přítomností či nepřítomnosti
hemosiderinu (mikroskopie). Ale to je spíš metoda hematologická.
 Nadbytek Fe
Nadbytek železa může mít pro organismus fatální následky. Díky zvýšené tvorbě kyslíkových radikálů
dochází k poškození buněk různých tkání. K vážným újmám mohou dojít zejména játra (cirhóza,
hepatocelulární karcinom), pankreas (diabetes mellitus jako následek zničení Langerhansových ostrůvků),
myokard (kardiomyopatie až se srdečním selháním), klouby (bolesti) a také endokrinní žlázy (různé
poruchy). Příčinami přetížení organismu železem jsou nadbytečný přívod železa perorální nebo parenterální
cestou, mnohačetné transfuze a genetické onemocnění hereditární hemochromatóza.
Hereditární hemochromatóza (HH) je klasická choroba z nadbytku železa, kde příčinou je vrozená porucha ve vstřebávání železa.
Vlastní příčinou je porucha regulace syntézy hepcidinu, kterého se v játrech tvoří méně a v duodenu se tak vstřebává podstatně
více železa než za normálních okolností. Existuje několik typů hereditární hemochromatózy rozlišených podle zmutované regulační
molekuly: HH 1. typu je nejobvyklejší, zde dochází k mutaci molekuly proteinu HFE (human hemochromatosis protein),
nejzávažnější je juvenilní HH čili HH 2. typu, kdy je zmutován tzv. hemojuvelin (membránový rozpustný protein; zkratky HVJ, HFE2,
RGMc)) případně je zmutován (velmi vzácně) samotný hepcidin.
Je důležité chorobu diagnostikovat, jinak vede během několika let ke smrti. Léčba spočívá v odebírání asi 500 ml krve jednou či
dvakrát týdně do celkového odebraného objemu asi 50 l.
Hemochromatóza je pojem označující původně nadbytek Fe s poškozením příslušných orgánů, což se projevuje buněčnou
degenerací a fibrózou. Dnes se tímto pojmem označuje stav s nadbytkem Fe bez ohledu na to, zda existují či neexistují důkazy o
tkáňovém poškození.
Hemosideróza je pojem označující nadbytek Fe bez poškození tkání.
Sideroblastická anémie - skupina chorob často z neznámé příčiny, se zmnoženým výskytem sideroblastů. Železo se hromadí
v erytroidních prekurzorech.
Metody používané ke stanovení nadbytku železa
 Stanovení koncentrace sérového železa (S-Fe) a hodnoty celkové vazebné kapacity pro železo (STIBC,
S-CVK). Podle použité metody je u osob s nadbytkem železa koncentrace S-Fe obvykle větší
než 27 mol/l. Význam stanovení sérového železa a celkové vazebné kapacity je v podstatě pouze
ve screeningu chorob s nadbytkem železa a v potvrzení a monitorování akutní otravy železem u
dětí.
 Saturace transferrinu přesahující 60% rovněž většinou svědčí o nadbytku Fe. V pokročilých
stádiích nadbytku Fe přesahuje saturace transferrinu 90%.
FEP test (free erythrocyte protoporphyrin test; viz výš) se při diagnostikování nadbytku železa nedá použít.
Sérový ferritin (S-ferritin) je necitlivý pro stanovení raných stadií nadbytku Fe..
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-6
Pavel Nezbeda
N N
Pro zvídavé studenty: Interpretace nálezů sérového železa (S-Fe)
S-Fe představuje Fe
3+
vázané na transferrin, neobsahuje Fe ve volném hemoglobinu v séru.
 Pokles S-Fe: u většiny, ne však u všech, anemií z nedostatku Fe, a u chronických zánětlivých chorob, jako jsou akutní
infekce, imunizace a infarkt myokardu (pokles koncentrace sérového železa je vyvolán hepcidinem, který reaguje na
zánět jako pozitivní reaktant akutní fáze a jeho zvýšené množství inhibuje resorpci železa ve střevě a uvolňování
železa z makrofágů; to následně vede právě k poklesu S-Fe a k poklesu koncentrace transferinu; koncentrace ferritinu,
jako pozitivního reaktantu akutní fáze, se zvyšuje; stav charakteristický pro tzv. anémii chronických chorob; železo je
nezbytné i pro bakterie, pokles sérového železa zabraňuje bakteriím v množení, je to tedy jeden z obranných
mechanismů organismu).
Markantní pokles je u pacientů začínajících reagovat na specifickou hematologickou léčbu anemií z jiných příčin, např.
na léčení perniciosní anémie vitamínem B12. Akutní či nedávná hemorrhagie, včetně dárcovství krve, rovněž vedou k
poklesu S-Fe. Dále: během menstruace. Hormonální kontraceptiva zvyšují hladinu S-Fe, při zastavení antikoncepce
však dojde až k 30% poklesu S-Fe (uterinní krvácení).
 Zvýšení S-Fe: u chorob se zvýšeným vstřebáváním Fe - hemochromatosa, akutní otrava železem u dětí - a u orální či
parenterální medikace železa nebo u akutní hepatitidy (tableta 0,3 g síranu železnatého požitá dospělým člověkem
může zvýšit hladinu S-Fe o 50 - 90 mol/l).Hodnoty přesahující 35mol/l mohou být pozorovány u žen beroucích
kontraceptiva na bázi progesteronu příbuzných látek a dále při kontaminaci stříkačky, či sběrné nádoby.
12.1.4. Metody stanovení sérového železa (S-Fe)
1. Atomová absorpční spektrofotometrie. Železo se stanovuje v supernatantu po deproteinaci séra
(odstranění hemoglobinu!)
2. Fotometrické stanovení S-Fe. Železo se uvolní z transferrinu snížením pH séra, zredukuje se z Fe
3+
na Fe
2+
a pak naváže do komplexu s chromogenem, který obsahuje reaktivní skupinu
[=N‒C‒C‒N=].(Stejná struktura jak u známého antikoagulans EDTA). Železo je vázáno chelátovou
vazbou mezi dvěma dusíkovými atomy. Komplex [Fe-chromogen] má extrémně vysokou
absorbanci, která je přímo úměrná koncentraci.
Výjimku ve struktuře tvoří chromogen Chromazurol B, který neobsahuje dusík. Do této reakce ale vstupuje
cetyltrimethyl ammonium bromid (CTMA).
.
Bathofenanthrolin
Tripyridyl triazin, TPZT
Chromogeny
N
N
N N
S
O
O
OH
S
O
O
OH
N
N
N
N
N
N
CH3
CH3
ClCl
O
O
OH
O
OHOH
Chromazurol B
CTMA
N
+
CH3
CH3
CH3
CH3
Br
Ferrozin,
PST
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-7
Pavel Nezbeda
Diagnostické soupravy Erba Lachema s.r.o. :
Železo (Fe 70), s bathofenantrolinem, deproteinace séra (roztokem s kyselinou chlorovodíkovou, trichloroctovou a thioglykolovou),
červeně zbarvený komplex, fotometrie při 535 (510 –550) nm; velká spotřeba séra (1
ml) nelze zpracovávat hemolytická séra.Normální hodnoty touto metodou: muži 14 –
26 mol/l, ženy 11 – 22 mol/l.
Železo PST (Fe 100 PST), s ferrozinem, fialově zbarvený komplex, fotometrie při 540 –
570 nm, nedeproteinuje se, metoda je vhodná k automatizaci, lze používat i manuálně
Železo liquid 200 (Fe L 200), s Ferene, fotometrie při 623, 620 až 640 nm, metoda
určená k automatizovanému provozu
Diagnostické soupravy jiných firem: např.
Železo 400, SKALAB Svitavy, s Ferenem S a kyselinou askorbovou, fotometrie při 580 nm, určeno pro manuální i automatizovaný
provoz
Serum Iron and TIBC, „Diapack“, Dialab, stejný princip jako Železo 400 aj.
12.1.5. Transferrin
Sérový transferrin slouží, kromě své transportní funkce, jako vazebná rezerva pro železo, neboť za
normálních okolností je obsazena pouze asi 1/3 jeho vazebných míst. Tato rezerva se nazývá
nesaturovaná vazebná kapacita železa UIBC (unsaturated iron binding capacity) a je pro organismus velmi
důležitá, neboť, jak již bylo uvedeno, volné železo je toxické. Asi přesnější by bylo definovat „ ... kapacita
pro železo“ nebo „.. železo vázající kapacita“. Celková vazebná kapacita (TIBC) je stanovení maximální
koncentrace železa, kterou mohou navázat sérové proteiny, principiálně transferrin. S-TIBC kolísá podle
poruch metabolismu železa. Celková vazebná kapacita je součet sérového železa (S-Fe, tj. železa již na
bílkoviny navázaného) a volné vazebné kapacity (UIBC), jak je znázorněno na schématu:
12.1.5.1. Stanovení celkové (TIBC) a volné (UIBC) vazebné kapacity
V testovaném vzorku se stanoví sérové železo (tj. navázané železo, S-Fe) a poté se do vzorku přidá
dostatečné množství Fe
3+
pro saturaci vazebných míst na bílkovinách, zejména na transferinu. Další postup
má minimálně dvě varianty:
1. Adsorpcí na uhličitan hořečnatý, pomocí ionexu, případně jinými podobnými technikami, se odstraní
přebytek železitých iontů, tj. iontů, které se na bílkoviny nenavázaly, protože všechna vazebná místa již
byla obsazena. V tomto vzorku s odstraněným přebytkem Fe
3+
se znovu stanoví S-Fe. Výsledek
představuje celkovou vazebnou kapacitu (TIBC), protože v předchozím kroku byl vzorek nasycen
železem a železo obsadilo všechna vazebná místa: S-Fe = TIBC. Volná kapacita (UIBC) se získá
odečtením hodnoty sérového železa z původního vzorku (S-Fe) od TIBC, tj. od výsledku z druhého
stanovení (po úpravě vzorku):
UIBC = TIBC – S-Fe, resp. VVK = CVK - S-Fe
S-Fe = koncentrace sérového železa naměřená před přidáním Fe3+
2. Stanoví se úbytek železa z přidaného množství, což odpovídá vazbě na volnou kapacitu sérových
bílkovin, zejména transferinu. V praxi to vypadá tak, že po vysycení volné kapacity ve vzorku roztokem
Fe
3+
o známé koncentraci CFe, se ve stejném vzorku znovu stanoví koncentrace železa (Fesat). Protože
navázané železo nereaguje (bylo by nutno ho z bílkovin oddělit – viz stanovení Fe), představuje tento
výsledek zbylou koncentraci železa, tj. toho, které se nenavázalo a zůstalo v roztoku. Odečtením této
hodnoty od původní, známé hodnoty CFe,, získáme podíl, který se navázal na volnou kapacitu a
nemohl tak vstoupit do reakce s činidlem:
Výpočet UIBC (VVK): UIBC (VVK) = cFe – Fesat
kde CFe = koncentrace přidaného Fe, Fesat = koncentrace Fe naměřená po vysycení transferinu
O
O
N
N
N
N
S
O
O
OH
S
O
O
OH
Ferene
UIBC = Unsaturated Iron Binding
Capacity (nevysycená = volná vazebná
kapacita pro Fe)
TIBC = Total Iron Binding Capacity
(celková vazebná kapacita pro železo)
Dodatečně navázané Fe (UIBC) S-Fe
(„sérové železo“)
TIBC (CVK)
(celková vazebná kapacita)
UIBC (VVK)
(volná vazebná kapacita)
S-Fe
(„sérové železo“)
TIBC (CVK)
(celková vazebná kapacita)
Schéma vzájemných vztahů CVK, VVK a S-Fe
Dodatečně navázané Fe +původní S-Fe
= stanovené sérové železo po vysycení
vazebných míst přídavkem železitých
iontů= TIBC
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-8
Pavel Nezbeda
12.1.5.2. Klinické poznámky
PoklesTIBC: Celková vazebná kapacita se snižuje při chronických infekcích, zhoubných nádorech, otravě
železem, onemocnění ledvin, nefróze, Kwashiorkoru a talasemii.
Kwashiorkor je forma závažné proteinově-energetické malnutrice charakterizovaná edémem, dráždivostí, anorexií, ulcerativními (s
vředy) dermatózami a zvětšenými játry s tukovými infiltracemi. Vyskytuje se v oblastech s hladomorem a/nebo s nedostatečným
přísunem proteinů, ve vyspělém světě vzácná.
Nárůst TIBC: Běžnými příčinami zvýšení hodnot celkové vazebné kapacity jsou anémie způsobená
nedostatkem železa, těhotenství, orální antikoncepce a virová hepatitida.
12.1.5.3. Saturace a koncentrace transferinu
Saturaci transferinu lze vypočítat např.: Saturace transferrinu (%)
Výpočet koncentrace S-transferinu z hodnot TIBC: S-transferrin (g/l) = 0,007 x TIBC
Vztah není zcela lineární, je však postačující pro běžnou praxi. Transferin lze stanovit imunochemicky (viz
kapitolu 10.Bílkoviny, Imunochemické metody).
Hodnoty S-Fe, S-TIBC a saturace transferinu by neměly být používány pro určení nedostatku Fe, ale pouze
jako screening pro choroby z chronického nadbytečného příjmu železa a pro potvrzení a monitorování
akutní otravy železem u dětí.
Praktické poznámky:
 kromě AAS má hemolýza velmi malý vliv na stanovení S-Fe (z hemoglobinu se uvolní pouze malá množství železa) odběr
by měl být opakován pouze u markantních hemolýz.
 stanovení TIBC je ovlivněno mnoha faktory (viz tabulka na str. 9-19): kolísání ze dne na den i u zdravých osob, diurnální
variace (odpoledne jsou nižší hodnoty než ráno, nejnižší jsou večer - rozdíl 2 až 4mol/l). Mnoho osob s nedostatkem
železa má normální hodnoty S-Fe a TIBC. Pro všeobecnou rozšířenost Fe je nutno dbát na čistotu používaných potřeb.
12.1.6. Ferritin a význam jeho stanovení
V krvi se nachází ve velmi nízké koncentraci, asi 1% plasmatického Fe (P-Fe) je obsaženo ve ferritinu.
Plazmatický ferritin (P-ferritin) je v rovnováze s tělesnými zásobami a rozdíly v kvantitativním obsahu
v zásobovacích kompartmentech se odráží v koncentraci P-ferritinu, jehož koncentrace klesá velmi záhy při
rozvoji Fe nedostatečnosti, daleko dřív, než jsou pozorovatelné změny v B-Hb (krevní hemoglobin), velikosti
erytrocytů či v S-Fe (sérové Fe) koncentraci. Za normálních podmínek je ferritin produkován
retikuloendoteliárními buňkami sleziny, jater a kostní dřeně.
P(S)-Ferritin je citlivý indikátor nedostatku železa (není-li komplikace konkurenčními chorobami).
Druhá strana mince: hladinu S-ferritinu zvyšuje mnoho chorob (ferritin se chová jako bílkovina akutní fáze
– viz kapitola 15, Biomarkery - např. chronické infekce, chronické zánětlivé choroby jako revmatoidní
artritida nebo ledvinová choroba, velký počet malignit, zvl. lymfomy, leukémie, plicní rakovina a
neuroblastom. Kombinace těchto chorob s nedostatkem Fe velmi často vede k normální hladině
plazmatického/sérového ferritinu. Vzrůst P/S-ferritinu se objevuje i u pacientů s virovou hepatitidou nebo po
toxickém jaterním poškození jako výsledek uvolnění ferritinu z poškozených jaterních buněk. Ke vzrůstu
dále dochází u pacientů s hemosiderosou a hemochromatosou. Pro měření raného zvýšení Fe se
stanovení S-ferritinu jeví jako méně citlivá metoda, než je stanovení S-Fe, TIBC (CVK), saturace transferinu.
12.1.6.1. Principy stanovení ferritinu
Ferritin se stanovuje pomocí specifických protilátek metodami IRMA, ELISA, případně imunoturbidimetricky.
Jedná o imunochemická stanovení na principu reakce antigen + protilátka = komplex [antigen-protilátka].
Vniklý komplex [antigen-protilátka] se kvantifikuje pomocí různých metod: s využitím radioizotopu = IRMA,
enzymu = ELISA, nebo fotometrickým proměřením vzniklého homogenního zákalu = turbidimetrie.
Podrobnosti k metodám viz kapitola 13. Bílkoviny.
Bývalá souprava reagencií PLIVA-Lachema Diagnostika pro turbidimetrické stanovení ferritinu
FERRITIN Ready-to-use (IC-FER R1x15) (protilátka připravená k přímému použití);FERRITIN Pufr (IC-FER DBUF 1x100)
FERRITIN Standard (FERS 6x1); FERRITIN Control (FERC 1x5)
Princip metody pro zvídavé studenty: Ferritin ze vzorku reaguje s monoklonálními protilátkami proti lidskému ferritinu, kterými
jsou potaženy částice koloidního zlata. Dochází k aglutinaci a zvýšení absorbance zlatého koloidu (při 600 nm). Zvýšení absorbance
je přímo úměrné koncentraci ferritinu ve vzorku.
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-9
Pavel Nezbeda
Referenční intervaly
muži 20 - 300 g/l
Poznámky:
- U různých metod se dosahují různé výsledky - každá
laboratoř si musí stanovit vlastní referenční intervaly
- Metody mají svá úskalí - vzorky by měly být ředěny
na koncentraci 200- 400 g/l (pokud je koncentrace
vyšší) a stanovení zopakováno, duplikáty by se
neměly lišit o více jak 7%, jinak zopakovat.
ženy 15 - 120 g/l
novorozenci 25 - 200g/l
1 měsíc 200 - 600 g/l
2 - 5 měsíců 50 - 200 g/l
6 měs - 15 let 7 - 142g/l
12.1.7. Podmínky, o nichž je známo, že ovlivňují koncentraci S-Fe, TIBC a saturaci
transferrinu
Podmínky Efekt
Denní variace Normální hodnoty ráno, nízké hodnoty uprostřed odpoledne, velmi
nízké hodnoty k půlnoci
Menstruační cyklus Zvýšené hodnoty před menstruací (S-Fe o 10-30%), při menstruaci nízké
hodnoty (S-Fe pokles o 10-30%)
Těhotenství Může dojít ke zvýšení S- Fe následkem zvýšeného progesteronu, může
dojít ke snížení S-Fe následkem nedostatku Fe
Příjem Fe (včetně vitaminů
obohacených Fe)
Vysoké hodnoty, mohou zvýšit S-Fe o +54mol/l a saturaci Trf
na 100%
Orální kontraceptiva (progesteron-like) Mohou zvýšit Szvyšuje
TIBC (CVK)
Kontaminace stříkačky železem Vysoké hodnoty, tj. S- o 75 - 100% (obtížně
dokazatelné)
Injekce dextranu s železem Velmi vysoké hodnoty; S-Fe může být >180 mol/l,saturace Trf
100%, pravděpodobně z cirkulujícího železa z dextranu, jev
může přetrvávat po několik týdnů
Hepatitida Velmi vysoké hodnoty; F-Se může být >180 mol/l, následkem
hyperferritinemie z poškození hepatocytů
Akutní zápal (infekce dýchacích cest,
absces, imunizace, infarkt myokardu)
Nízké nebo normální S-Fe; nízká nebo normální saturace Trf
Chronický zápal nebo malignita Nízké nebo normální S-Fe; nízká nebo normální saturace Trf
Nedostatek Fe Nízké nebo normální S-Fe; nízká nebo normální saturace Trf;
zvýšená TIBC (CVK)
Nadbytek Fe (hemochromatosa) Vysoké S-Fe; vysoká saturace Trf; normální nebo nízká TIBC
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-10
Pavel Nezbeda
12.2. Stopové prvky
Většina prvků v živých organismech se nachází v množstvích gramů na kg tkáně. Ty prvky, které se
vyskytují v množstvích miligramů na kg tkáně, se nazývají prvky stopové .Prvky ultrastopové jsou
v tkáních přítomny v množstvích mikrogramů na kg tkáně. V uvedené tabulce jsou vyznačeny stopové
prvky.
X esenciální stopový prvek (je nutný jeho příjem potravou)
X předpokládaný esenciální stopový prvek
Li Be X stopový prvek s neznámou fyziologickou funkcí B F
Na Mg Al Si P S Cl
K Ca Ti V Cr Mb Fe Co Ni Cu Zn As Se Br
Rb Sr Y Mo Ag Cd Sn I
Ba Pt Au Hg Pb Bi
Stopové prvky lze rozdělit podle jejich biologických funkcí na
 Esenciální stopové prvky s definovanou denní dávkou: Zn, I, Se, Fe
 Esenciální stopové prvky s definovanou esenciální rolí v metabolismu, ale bez přesného stanovení
denní dávky: Cu, Mn, Cr, Co, Mo, F
 Ultrastopové prvky, u nich nebylo doposud jednoznačně určeno zda jsou esenciální nebo škodlivé ve
zjišťovaných koncentracích: Li, Ni, Sn, Si, V, B
 Toxické stopové prvky u nichž není u lidí známa biologická funkce, ale které i v relativně nízkých
koncentracích způsobují patologické změny: Al, As, Cd, Pb, Hg.
Hlavní biochemickou úlohou stopových prvků je zřejmě katalytické působení v enzymových systémech, kde
se uplatňují jako kofaktory, nebo jako součásti metaloenzymů, kde jsou pevně spojeny s bílkovinou. Zdá se
také, že hrají významnou strukturální roli v jednotlivých buněčných komponentách (nukleární bílkovina,
DNA, buněčné membrány). Velmi významnou je také účast stopových prvků při likvidaci volných radikálů
v organismu. Zde se zapojuje několik enzymů, z nichž asi nejdůležitější je superoxiddismutáza (SOD), která
v různých částech buňky mění superoxidové radikály (anion O2
)
na peroxid vodíku. K tomu využívá různé
prvky – např. v mitochondriích Mn, v cytoplazmě Cu a Zn. Obecný průběh reakce lze popsat např. tak, jak je
uvedeno na schématu vpravo.
Tomuto typu (redoxní) reakce se říká dismutace
nebo také disproporcionace - látka se současně
oxiduje i redukuje a tvoří se dva rozdílné produkty.
Ve výše popsané reakci osciluje oxidační stav
kovového kationtu mezi „n“ a „n+1“.
Peroxid je dále rozkládán glutathionperoxidázou
(GPx), což je selenoenzym existující v několika
formách – izoenzymech kódovaných rozdílnými
geny, a které se liší v buněčné lokalizaci a
substrátové specifitě.
Pro zvídavé studenty: Hlavní biologickou funkcí GPx (což je
všeobecné označení enzymové rodiny s peroxidázovou
aktivitou) je ochrana organismu před oxidačním stresem.
Biochemickou funkcí je přeměna lipidových hydroperoxidů na
odpovídající alkoholy a volného peroxidu vodíku na vodu.
Obecné klinické poznámky
Rozeznávají se dva hlavní typy nutričních deficitů:
 Typ I: při poklesu tkáňové koncentrace dojde k defektu specifických metabolických cest, ke ztrátě
funkce a specifickým klinickým příznakům: Fe, I, Cu, Se. Klinický deficit se vyvíjí v různých
časových úsecích – Fe týdny, Cu několik měsíců, Se měsíce i roky.
 Typ II: specifické diagnostické klinické známky neexistují nebo se vyvíjejí až po poměrně dlouhé
době. Typickými představiteli jsou Zn a Cr.
O2
-
O2
Me
(n+1)+
- SOD Me
n+
- SOD
O2
-
2H
+
H2O2
(Me = příslušný kovový prvek; platí - pro Cu, n=1; Mn, n=2; Fe, n=2;
Ni, n=2)
Účast SOD a kovových prvků v dismutaci
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-11
Pavel Nezbeda
12.2.1. Měď
Měď je v krvi vázána na albumin, aminokyselinu histidin (volný i v bílkovinách) a na speciální
transportní bílkovinu transcuprein. Játra zabudovávají měď do ceruloplazminu secernovaného do
krve, kde je vázáno 90% plazmatické mědi. Měď se vylučuje žlučí. Nadměrný přívod mědi blokuje
vstřebávání zinku a naopak. Denní potřeba mědi je asi 20 g/kg, bezpečná dávka pro dospělého je
15-30 mg/den.
Zdrojem mědi jsou zelená zelenina, ústřice, ryby a vnitřnosti, ořechy, sušené ovoce a čokoláda.
Měď je součástí mnoha enzymů, které hrají významnou roli v metabolismu katecholaminů, při
stabilizaci elastinu a kolagenu, v energetickém metabolismu buňky i v antioxidační ochraně
organismu. Naopak volné měďnaté ionty jsou schopny, podobně jako železo, katalyzovat vznik
volného hydroxylového radikálu.
 Nedostatek mědi. Mankesova choroba - dědičná porucha absorpce mědi střevní sliznicí.
Nedostatek mědi obecně (příčinou může být malnutrice, těžké průjmy, dlouhodobá parenterální
výživa bez dodávání mědi) může vést k hypochromní normocytární anémii, poruchám kostí a
nedostatečné syntéze kolagenu.
 Přebytek mědi - toxicita mědi.
Wilsonova choroba = hepatolentikulární degenerace
*)
(dědičné onemocnění). Příčinou je
nedostatečná tvorba ceruloplazminu, celková koncentrace mědi v séru je snížená, je však vyšší volná
frakce mědi, která proniká do jater, mozku (postiženo je mozkové jádro nukleus lentiformis) a ledvin a
způsobuje cirhózu a neurologické poruchy. Pacienti mají zvýšené vylučování mědi močí.
*)
hepatolentikulární degenerace – jaterní onemocnění, při němž cirrhosa jater má vliv na mozek, což se projeví řadou
příznaků, mezi jiným velikým třesem; nucleus lentiformis – jádro v mozku charakteristicky postižené touto chorobou
Hepatitida, různé typy anémií, leukémie apod. - i zde se nacházejí vyšší koncentrace mědi.
Akutní intoxikace mědí se projevuje zvracením, průjmy, bolestmi v epigastriu (nadbřišku), může vést k
šoku a akutnímu selhání jater a ledvin.
Metody stanovení mědi
1. AAS – základní metoda stanovení
2. Fotometrické stanovení s bathocuproinem
V silně kyselém prostředí tvoří bathocuproin s Cu
+
oranžově zbarvený komplex
fotometrovatelný při 480 nm: Cu
+
+ bathocuproin = barevný komplex
Bathocuproin je látka velmi podobná bathofenantrolinu (viz vzorec bathofenantrolinu
na str. 8-12), obsahující navíc dvě –CH3 a dvě –SO3H skupiny. Používají se i jiná činidla,
např. diethyldithiokarbamát, bis-cyklohexanon, oxaldihydrazon (cuprizon) aj.
Referenční hodnoty
Dospělí: 11 - 22mol/l
Novorozenci: 3 - 10 mol/l
12.2.2. Zinek
Tělo obsahuje asi 2 g zinku. Zinek je součástí mnoha enzymů (např. LD, CA, ALP, AMS, ACE aj.), je
součástí superoxiddismutázy (základní antioxidační enzym), stabilizuje buněčné membrány,
podporuje antioxidační účinek jiných látek. Je potřebný pro buněčnou imunitu, množení buněk, tvorbu
vaziva, hojení ran a tvorbu spermií, podporuje absorpci glukózy a usnadňuje vazbu inzulínových
receptorů na hepatocyty. Při nedostatku železa vstupuje do protoporfyrinu a tvoří tzv. ZPP (zinc
protoporhyrin), namísto hemu a dále se váže s globinem a tvoří ZPP-globin (analogie hem a
hemoglobin). Koncentrace ZPP tak mohou sloužit jako parametr Fe-deficitní erytropoézy.
Zinek je typický intracelulární prvek. Při katabolismu se vyplavuje z buněk a koncentrace v séru je
úměrná stupni katabolismu. V krvi je vázán na bílkovinu metalotionein a na albumin (65%). Není
skladován v játrech, jeho deficit se proto projevuje poměrně brzo. Močí se vylučuje asi 10% denní
exkrece, většina se vylučuje pankreatickou šťávou a žlučí. Denní potřeba u dospělého je 12 - 19 mg,
u dětí 50 g/kg, u novorozenců asi dvojnásobek.
Zdrojem zinku je zejména maso, obzvláště zvěřina. Celozrnné obilniny a zelenina sice obsahují dostatek zinku,
ale ten je biologicky nedostupný (vegetariánství!), protože jeho absorpci inhibuje vláknina, která je v této
stravě rovněž přítomna. Absorpci naopak podporují mořské ryby, játra a vejce.
N N
CH3 CH3
Bathocuproin
N N
CH3 CH3
S
O
O
OHS
O
O
OH
Bathocuproinsulfonát
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-12
Pavel Nezbeda
 Zvýšené množství Zn je všude tam, kde se tvoří nové buňky (tedy i v nádorové tkáni).
 Akutní otrava - zvracení, průjmy, horečka. Zvýšený příjem Zn snižuje absorpci mědi.
 Nedostatek zinku může být způsoben dědičným defektem zabraňujícím vstřebávání zinku ve střevě.
Častěji se jedná o malnutrici, malabsorpci a nedostatečný přísun při parenterální výživě. Ke zvýšeným
ztrátám může docházet při katabolismu, popáleninách, zánětech, větších sportovních výkonech a u
některých terapií (penicilaminem aj.). Výsledkem je špatné hojení ran, poruchy růstu, imunity, vypadávání
vlasů, poruchy metabolismu cukrů.
Metody stanovení zinku
1. AAS – prvořadá metoda stanovení
2. Fotometrické stanovení s 5-Br-PAPS
Zinek tvoří s 2-(5-brom-2-pyridylazo)-5-(N-n-propyl-N-3-sulfopropylamino)fenolem barevný
komplex, jehož zbarvení se měří při 560 nm. Metoda není příliš citlivá.
Referenční hodnoty:
Dospělí: 10 - 20 mol/l
Novorozenci: 11 - 40 mol/l
12.2.3. Křemík
O metabolismu křemíku je toho známo poměrně málo. Předpokládá se, že je pro člověka esenciální a tudíž
je vyžadována určitá denní dávka potřeby. Ta se odhaduje na 5 – 20 mg/den, pro sportovce se doporučují
dávky vyšší, 30 – 35 mg/den. Z běžné stravy se ho vstřebává asi 50% přítomného obsahu, absorpce je
však značně ovlivněna formou sloučeniny (anorganické se vstřebávají asi z 1%, organické asi ze 70%), pH,
přítomností vlákniny, hliníku a molybdenu. V krvi křemík není vázán na bílkovinu, vylučuje se močí.
Křemík se považuje za netoxický, vyšší dávky však mohou vést ke vzniku močových kamenů,
v kamenolomech pracující lidé mohou být postiženi poškozením plic a silikózou (profesionální nemoc
vznikající vdechováním malých částeček obsahujících oxid křemičitý).
Křemík je důležitý pro zesíťování kolagenu a elastinu a pro tvorbu kolagenu. Ovlivňuje složení chrupavek,
především jejich kalcifikaci. Ovlivnění tvorby kolagenu je na biochemické úrovni vysvětleno tím, že křemík je
potřebný pro aktivitu kostní prolylhydroxylázy a ornitinaminotransferázy, enzymů, nezbytných pro tvorbu
kolagenu. Vyskytuje se v pojivových tkáních (s narůstajícím věkem obsah křemíku v pojivových tkáních
klesá), v kostech, šlachách a kůži, v játrech, srdci a ve svalech. Křemík zachovává pevnost a pružnost
šlach, kůže, vlasů, nehtů, cév, fibrinu a vnitřních orgánů, ve kterých je přítomen. Má zřejmě i vztah
k ateroskleróze, osteoartritidě, hypertenzi a k procesu stárnutí.
Zdroji křemíku jsou hlavně potraviny rostlinného původu, vysoký obsah je v přesličce a kopřivě.
 Nedostatek křemíku vede ke ztrátě elasticity a zeslabení cévní stěny, která se tak stává náchylnější
k rozvoji aterosklerózy; negativně ovlivňuje vývoj pohybového aparátu a celkový růst, vznikají abnormality
kostí a chrupavek s výrazným snížením kostního kolagenu, zejména u lebky a dlouhých kostí.
Metody stanovení křemíku: Plamenová atomová absorpční spektrometrie (FAAS), atomová absorpční
spektrometrie s elektrotermickou atomizací (ETA – AAS)
Referenční hodnoty: v séru se nachází (podle zdroje) 0,4/0,3 – 10,0 mg Si/l, tj. 14,2/10,7 – 356 mol Si/l
12.2.4. Selen
V organismu se selen neskladuje, při zastavení příjmu (cibulová zelenina) rychle
vzniká jeho deficit. Vylučuje se převážně močí. Bezpečný příjem je 50 - 200g/den.
Nejvíce Se je obsaženo v selenoproteinu-P, což je určitá zásobní forma, dále je
obsažen v některých enzymech (např. glutationperoxidáza - ochrana před oxidačním
poškozením, viz výš; jodotyronin-5-dejodáza - přeměna T4 na T3 viz kapitola 14.
Hormony, str. 14-13), v proteinech je v podobě selenocysteinu (21. aminokyselina).
Má význam pro správný vývoj spermií a chrání před rozvojem zhoubného bujení.
Zdroji selenu jsou cibule, pór, česnek, pažitka, vnitřnosti, vepřové a hovězí maso, některé druhy ořechů; celozrnné
obiloviny (ovesné vločky, hnědá rýže). Obecně platí, že obsah selenu v obilovinách je ovlivněn obsahem prvku v půdě.
 Nedostatek selenu. Dlouhodobý nedostatek vede ke kardiomyopatii a k postižení kosterních svalů
(Keshan disease, onemocnění Keshan; poprvé zjištěno v r. 1907 v oblasti Keshan, Čína; existuje zde však souvislost s viry);
degenerativní onemocnění kloubů (Kashin-Beck syndrom; poprvé ho popsal ruský doktor Nikolaj Ivanovič Kašin
Selenocystein
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-13
Pavel Nezbeda
v roce 1848, příčiny zůstaly neobjasněny; podobný případ poté popsala v roce 1906 americká (USA) doktorka Melinda A.
Becková, odtud název; onemocnění zřejmě souvisí i s nedostatkem jódu a konzumací obilovin kontaminovaných
mykotoxiny a pitné vody kontaminované kyselinou fulvinovou
*)
); zvýšené riziko karcinogeneze, rozvoje
aterosklerózy, poruchy funkce štítné žlázy, snížení imunity.
*)
Fulvinové kyseliny (lépe fulvonové kyseliny), patří mezi huminové látky, tj. přírodní organické látky vznikající rozkladem
převážně rostlinných zbytků. Huminové látky se dělí (podle rozpustnosti) na huminy, humonové kyseliny a fulvonové
kyseliny.
 Toxicita selenu. Při dlouhodobě zvýšeném příjmu Se dochází k charakteristickým změnám na
nehtech (roztřepané nehty; červené zabarvení) a zubech (červené zabarvení) a gastrointestinálním
příznakům. U akutní otravy páchne dech typicky po česneku.
Metody stanovení selenu: Atomová absorpční spektrometrie (AAS, v různých provedeních), fluorimetrie
Referenční hodnoty dospělých: 1,0 - 1,9 mol/l
12.2.5. Chróm
V krvi je chrom přepravován transferinem a dostává se do všech prokrvených orgánů. Antagonisty
vstřebávání chrómu jsou zinek a vanad.. Nárůst hladiny chromu nastává bezprostředně po vzrůstu
koncentrace krevní glukózy a/nebo inzulinu. Tento nárůst je závislý na věku, u starších osob je menší.
Poločas vylučování je 3 měsíce. 80% chromu absorbovaného se střeva se vyloučí močí, zbytek žlučí, stolicí
a potem. Vylučování močí není reprezentativní pro zhodnocení bilance chromu v organismu.
Denní potřeba u dospělých je asi 50 až 200 g, u novorozenců 0,20 g/kg hmotnosti.
Zdrojem chrómu jsou celozrnné obilniny, brambory, ořechy, zelené fazole, pivovarské kvasnice a mořské produkty.
Při zpracování potravin klesá v nich obsah chrómu, takže dieta je obecně na chróm chudá.
Chróm vykazuje různé vlastnosti podle mocenství:
- trojmocný: reguluje účinek inzulinu, zvyšuje průnik glukózy do buněk, působí jako antioxidans, snižuje
lipoproteinoxidaci lipoproteinů
- šestimocný: mutagen, karcinogen, podporuje lipoperoxidaci; šestimocný chróm se vstřebává lépe než
trojmocný
 Nedostatek chrómu lze zjistit nejčastěji při diabetu, v těhotenství a ve stáří. Projevy nedostatku chromu
nejsou za přirozených podmínek zjišťovány, symptomy nedostatku (intolerance glukózy, glykosurie, zvýšená
hladina cholesterolu a triacylglycerolů v séru, neuropatie, encefalopatie, snížená fertilita a počet spermií,
zkrácení délky života, poruchy růstu, snížení podílu svaloviny a naopak zvýšení podílu tělesného tuku,
snížení humorální imunitní odpovědi a zvýšená morbidita) byl pozorovány pouze v experimentech na
různých druzích zvířat i na lidech.
Metody stanovení chrómu: AAS (v různých provedeních), neutronová aktivační analýza
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: 0,1 – 0,2g/l, tj. 1,9 – 3,8 nmol/l.
12.2.6. Kobalt
Biologický význam kobaltu spočívá v tom, že působí jako kofaktor v některých enzymatických reakcích,
konkrétně v těch, které obsahují cytochromoxidázu, superoxiddismutázu a urikázu a zejména v jeho klíčové
úloze jako součásti vitamínu B12 . V této formě, nikoliv jako volný prvek, se také dostává do organismu (o
vitamínu B12 a korinoidech obecně viz v kapitole 13, Vitamíny). Při vstřebávání může docházet k interakci
mezi kobaltem a železem a manganem, což může vést k deficitu kobaltu. Vstřebávání kobaltu jako součásti
kobalaminu ovlivňuje mukoprotein parietálních
*)
buněk žaludeční sliznice, tzv. vnitřní faktor. V krvi je kobalt
transportován glykoproteinem transkobalaminem
**
zejména do jater a kostní dřeně, kde spolupůsobí při
stimulaci erytropoézy. Z organismu se vylučuje stolicí (90%) a močí (10%).Tento poměr svědčí o jeho
špatné absorbovatelnosti.
Zdrojem kobaltu jsou listová zelenina a játra.
*)
parietální = nástěnný, vztahující se k vnitřní části stěny tělesných dutin
**)
transkobalamin: typ I = zásobní forma; typ II = transportuje vitamín do buněk; typ III = transportuje vitamín do jater
 Nedostatek kobaltu. Choroba odvozená od izolovaného nedostatku kobaltu není u lidí známa.
Charakteristické symptomy způsobené nedostatkem kobaltu doposud u lidí pozorovány nebyly, navzdory
tomu, že kobalt funguje jako koenzym i jako inhibitor. Spíše se projeví nedostatek kobalaminu (vitamín B12),
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-14
Pavel Nezbeda
než nedostatek kobaltu. Tento deficit se projevuje anémií, hubnutím, zvýšenou únavou, nechutenstvím a
zpomalením růstu.
Metody stanovení kobaltu: Elektrotermická atomová absorpční spektrometrie (ETA-AAS). Problém
stanovení kobaltu tkví ve skutečnosti, že referenční hodnoty jsou obvykle blízké limitu detekce a také
kontaminace různých typů vzorků je značná.
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: 0,01 – 0,3 g/l, tj. 0,2 – 5,3 nmol/l
12.2.7. Mangan
Součást některých metaloenzymů (superoxiddismutáza - anitoxidační účinky, viz výš). Aktivuje enzymy
uplatňující se při syntéze glykosaminoglykanů (tj. mukopolysacharidů, nevětvených polysacharidů, které
tvoří velkou část mezibuněčné hmoty v pojivové tkáni, zejména v chrupavkách, vazech a šlachách),
cholesterolu a protrombinu. Při absorpci v tenkém střevě soutěží se železem, vylučuje se hlavně žlučí.
Zdrojem manganu jsou zejména cereálie, obilné klíčky, ovesné vločky, dále avokádo, kaštany, hrách, mandle,
vojtěška, borůvky, petržel a jeřabiny. Určité množství se nachází i v rýži, olivách, špenátu, kokosových ořeších a řeřiše.
Nedostatek manganu vede k poruchám syntézy lipoproteinů, kostním defektům a kožním změnám.
Nedostatek manganu souvisí obecně s malnutricí a pouze velmi vzácně se projeví patobiochemicky. Mangan
je totiž všeobecně rozšířený prvek a v dostatečném množství se dostává do organismu dýcháním (inspirací).
Intoxikace manganem působí závažné poškození bazálních ganglií (stav podobný Parkinsonově chorobě).
Mangan vykazuje i cytotoxický efekt na epitel plicních alveolů s možným vyústěním do pneumonie,
letálnější než jsou pneumonie způsobené bakteriemi.
Akutní i chronická intoxikace manganem jsou způsobeny inhalací par a prachu s obsahem manganu (v
hornictví s výskytem rud s obsahem manganu, v průmyslu při práci se slitinami manganu, jako je tomu ve
sklářství, při výrobě suchých baterií, laků, pesticidů, v keramickém průmyslu apod.).
Zvýšené hodnoty manganu jsou nacházeny také u akutních a chronických hepatitid, u posthepatických
cirhóz, u pacientů na dialýze a občas i u pacientů s ischemickou chorobou srdeční. Zvl. vysoké hodnoty
manganu se nacházejí u pacientů s omezeným průtokem v žlučových cestách z jater do tenkého střeva,
tudíž s narušením normální cesty exkrece manganu. V těchto případech je nutno přívod manganu omezit.
Metody stanovení manganu: Atomová absorpční spektrometrie (AAS, v různých provedeních), atomová
emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-AES), neutronová aktivační analýza (NAA)
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: 0,5 – 1,0 g/l, tj. 9 – 18 nmol/l
12.2.8. Molybden
V organismu se nachází asi 90 g molybdenu. Nachází se zejména v játrech, slezině a ledvinách. Jeho
množství se mění s věkem (do 20 let stoupá, pak klesá).
Molybden patří k prostetickým skupinám flavoenzymů. Je součástí xantinoxidázy, enzymu, který se
zúčastňuje metabolismu purinových látek. Z dalších enzymů to jsou sulfátoxidáza, aldehydoxidáza a enzym
zodpovědný za vstřebávání železa. Molybden také ovlivňuje metabolismus mědi.
Vstřebává se ze žaludku a z tenkého střeva. Úspěšnost absorpce je 24 – 80%, podle formy sloučeniny.
Přítomnost wolframových solí, sulfátů a mědi snižuje vstřebávání molybdenu.
V krvi je transportován v erytrocytech navázán na 2-makroglobulin, v plazmě se nachází jako molybdenan
(MoO4 2-). Vylučuje se ledvinami (hlavní mechanismus homeostázy molybdenu v organismu) a žlučí.
Zdrojem molybdenu jsou luštěniny, celozrnná strava a rýže, dále také vnitřnosti, mléko a mléčné výrobky, ovoce,
zelenina, ryby a tuky.
 Toxicita molybdenu není prokázána, avšak při nadbytečném příjmu (>5,2 mol/den) dochází ke
sníženému vstřebávání mědi a může dojít až jejímu deficitu.
Metody stanovení molybdenu: Atomová absorpční spektrometrie s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS)
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: <0,1 – 0,5 g/l, tj. <1,0 – 5,2 nmol/l
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-15
Pavel Nezbeda
12.2.9. Fluór
V organismu se nachází asi 2,6 g fluóru, tj. 136 mmolů. Uplatňuje se při mineralizaci kostí a zubní skloviny
[fluorapatit - Ca3(PO4)3F]. Má zásadní význam při růstu zubů a pro zubní sklovinu (kariostatické působení –
inhibuje růst a metabolismus bakterií). Nedostatek se projeví zvýšenou kazivostí zubů. Stimulačního účinku
fluoridů na osteoblasty se využívá při léčbě osteoporózy, kdy se fluoridy podávají spolu s Ca a vitamínem D.
Tato léčba podporuje osteoblastickou proliferaci, zadržování kalcia a novotvorbu kostí.
Vstřebává se v žaludku (jako kyselina fluorovodíková, HF) a v tenkém střevě (fluoridy). V plazmě se fluór
nachází ve formě fluoridů, vylučuje se močí a také je vychytáván v kalcifikovaných tkáních (kosti, zuby). Do
těchto tkání se ukládá přibližně polovina přijatého fluoru. Vylučování je ovlivněno hodnotou pH.
Zdrojem fluóru jsou pitná voda, mořské ryby, kravské mléko.
 Nedostatek fluóru se projevuje zvýšenou kazivostí zubů a narušenou kalcifikací kostí (experimentální
důkazy chybí). Je ale známo, že fluoridy stimulují osteoblasty k vyšší činnosti a výsledkem je tvorba větších
krystalků kostního minerálu, odolnějšího vůči osteoklastům. Tohoto jevu se využívá při léčbě osteoporózy,
kde se fluoridy podávají v kombinaci s vápníkem a vitamínem D, což vede k zadržování vápníku a
novotvorbě kostí. Doporučené dávky pro jedince starší 15 let jsou 1,5 – 4,0 mg/den, pro děti jsou nižší.
Zdrojem je především pitná voda.
Toxická koncentrace v séru je >15mol/l. Intoxikace může být akutní či chronická (např. ze zakázaných
deratizačních prostředků a insekticidů na bázi fluoridu sodného, resp. flluorosilikátů, vdechování prachu
s obsahem fluoru, při požívání jídel a pití vody bohatých na fluor, což může nastat např. ve vulkanických
krajinách). Příznaky intoxikace jsou spazmy a křeče (neuromuskulární), slinění, pocení, snížení krevní
srážlivosti, krvácení/hemorrhagie (hematologické). Může dojít až k úmrtí ochrnutím dechových center a
zástavou srdce v diastole.
Metody stanovení fluóru: Iontově selektivní elektroda (ISE), plynová chromatografie (GC)
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: 20 - 50g/l, tj. 1,0– 2,6 mol/l
12.2.10. Jód
Lidské tělo obsahuje přibližně 15 – 20 mg (120 – 160 mol) jódu. Významná je úloha jódu při syntéze
hormonů štítné žlázy, čemuž odpovídá i jeho vysoký obsah v této žláze (70 – 80% celkového obsahu).
Vyšší množství jódu je i ve slinných žlázách. Nedostatečný přísun jódu je příčinou mnoha funkčních i
vývojových abnormalit, které v extrémních případech mohou mít fatální následky, včetně mentální
retardace, prenatální a neonatální úmrtnosti, kretenismu apod. Potřebná denní dávka u dospělého je 150
až 220 g. Nedostatečný přísun jódu hrozí i v ČR (předpokládá se, že asi 1/3 populace u nás má deficit
jódu), proto je jódem např. fortifikovaná kuchyňská sůl. Nejlepším ukazatelem deficitu jódu je jeho snížený
odpad močí (hodnota jódurie).
Zdrojem jódu jsou mořské řasy a mořští živočichové, mléko, mléčné výrobky, maso, ryby, drůbež, cereálie, vejce a
jodidovaná sůl (obsah jódu 17 g/g). Část denní potřeby je kryta i jeho obsahem v pitné vodě. Příjem jódu mohou
inhibovat dusičnany, chloristany a některé rostlinné inhibitory.
 Nedostatek jódu se projevuje různě v různých obdobních života.
U plodu (fetus) jsou to aborty, kongenitální anomálie, zvýšená perinatální mortalita, zvýšená mortalita
kojenců, neurologický kretenismus, psychomotorické poruchy, zvýšená citlivost štítné žlázy na radiační
zatížení.
Novorozenci mohou mít neonatální hypotyreoidismus, strumu,
narušené mentální funkce, zpomalený fyzický vývoj, zvýšenou citlivost
štítné žlázy na nukleární radiaci.
Dospělí trpí strumou s komplikacemi, hypotyreoidismem, narušením
mentálních funkcí, zvýšenou citlivostí štítné žlázy na nukleární radiaci
Metody stanovení jódu: Iontově selektivní elektroda (ISE),
vysokoúčinná/vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC).
Referenční interval hodnot v séru/plazmě: 60 – 70g/l, tj. 0,47 –
0,56 mol/l
Stanovení jódurie pomocí iontově selektivní elektrody nebo HPLC.
Jodidy v moči lze stanovit i např. na analyzátoru EcaFlow 150GLP,
který využívá principy průtokové elektrochemie, coulometrie a coulometrických titrací.
Elekrochemický analyzátor
EcaFlow 150GLP
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-16
Pavel Nezbeda
12.3. Analytické metody užívané pro stanovení stopových prvků
Preanalytická fáze musí zabránit kontaminaci vzorků prvky, které mají být stanovovány. Používá se
speciálně myté sklo, nebo, zvl. v poslední době, odběrové nádobky (zkumavky) výrobcem přímo
určené pro sběr vzorků pro stanovení stopových prvků (metal free = prosté kovů).
Analytické metody pro stanovení stopových prvků musí být citlivé, specifické, přesné a relativně
rychlé.
Nejznámější techniky pro stanovení stopových prvků v biologických materiálech zahrnují
 iontově selektivní elektrody (ISE), stanovení zejména kationtů, z aniontů pak zejména fluoridů
a jodidů
 voltametrii (polarografii), stanovení látek schopných měnit oxidační stupeň
 rentgenovou fluorescenční spektrometrii (XRFS: X-ray fluorescence spectrometry; X-ray =
paprsky X, rentgenové záření), vhodnou zejména pro pevnou matrici, stanovení kovových i
nekovových (P, S, C) prvků
 fotometrii (viz např. příklady stanovení Cu a Zn)
 atomovou absorpční spektrometrii (AAS), technika vhodná pro rutinní stanovení mnoha prvků
((Cu, Ni, Mn, Co, Fe, Ca, Mg, Ba, Sr, Al, Mo, V, Zn, Cd, Pb, As); schéma přístroje a stručný
princip na str. 8-29
 hmotnostní spektrometrii (MS); schéma přístroje a stručný princip na str. 12-19
 neutronovou aktivační analýzu (NAA), což je víceprvková analýza s vysokou citlivostí a
selektivitou, vhodná pro malé vzorky, patřící mezi jaderné analytické metody; stručný princip
dole na stránce
 emisní spektroskopii (ES), do které patří
o plazmová emisní spektrometrie (ICPES: Inductively Coupled Plasma Emission
Spectrometry, emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, resp. ICP-AES:
Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry, atomová emisní
spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem).
o hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). Stručné popisy
metod na str. 12-17.
Popsány byly i HPLC techniky ke stanovení stopových prvků.
Stručný popis některých vyjmenovaných metod
Neutronová aktivační analýza (NAA) obsahuje ve svém názvu princip metody: ozářením vzorků neutrony
(aktivací) vznikají radioaktivní izotopy, které se identifikují pomocí gama spektrometrie. Změřené záření podává
informaci o přítomnosti prvku, jehož aktivací radionuklid vzniká a o množství daného prvku. Zdrojem neutronů
k aktivaci je jaderný reaktor, v České republice se vhodný reaktor (jediný) nachází v Ústavu jaderného výzkumu
Řež (viz). K aktivaci lze užít i protony z urychlovačů či vysoce energetické fotony.
Ne běžnou (rutinní) analýzu (ve zdravotnické laboratoři) tato metoda vhodná
není.
Podrobnosti lze nalézt zde.
LVR-15, lehkovodní výzkumný reaktor
Reaktor je vybaven jedním kanálem s
pneumatickým zařízením, které umožňuje
rychlou dopravu vzorků pro realizaci krátkodobé
NAA malých vzorků (pracoviště provozuje Ústav
jaderné fyziky Akademie věd ČR). Pro
dlouhodobé ozařování či NAA větších vzorků je
možné využít další vertikální ozařovací kanály na
reaktoru.
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-17
Pavel Nezbeda
Metody s indukčně vázaným plazmatem - ICP
Plazma je čtvrtým skupenstvím hmoty a nejrozšířenější formou látky ve vesmíru. Je to elektricky neutrální,
vysoce ionizovaný plyn, sestávající z iontů, elektronů a atomů Příklady plazmatu nacházejícího se v přírodě jsou
slunce, blesk a severní záře. V běžném životě se nachází plazma v zářivkách, neonech a v elektrickém oblouku.
Analytické plazma je tzv. nízkoteplotní (non-thermal), resp. „cold“, což nelze překládat doslova, protože plazmový
výboj dosahuje teplot 5000 – 10000 K, a tento výraz pouze vyjadřuje stupeň ionizace (převládají v něm neutrální
molekuly).
ICP výboj pro analytické účely je většinou vytvořen v proudu čistého argonu nebo helia, které obstarávají
hoření. Po zapálení jiskrou se v proudícím plynu vytvoří volné elektrony, které ionizují další atomy nosného
plynu. Plazma (plazmová hlavice) je umístěno v chlazené kruhové indukční cívce s protékajícím
vysokofrekvenčním proudem, jehož oscilující
(indukované) elektromagnetické pole vede po iniciaci
ke vzniku nabitých částic a indukčnímu ohřevu.
ICP-AES, atomová emisní spektrometrie s indukčně
vázaným plazmatem je jedna z technik atomové
spektrometrie. K atomizaci a excitaci atomů prvků
používá jako zdroj plazma, jak bylo uvedeno,
dostatečně teplé, aby snadno docházelo k vypaření
aerosolu vzorku, disociaci, atomizaci a excitaci atomů
a iontů prvků. Emitované záření je rozkládáno mřížkou
a vzniklé spektrální čáry se měří. Schéma postupu i
přístroje na str. 8-28.
ICP-AFS, atomová fluorescenční spektrometrie
s indukčně vázaným plazmatem, je méně používaná
metoda. V tomto případě se sleduje fluorescenční
záření, vybuzené (monochromatickým) zářením
výbojky s dutou katodou. Výbojek („dutých katod“)
může být několik, uspořádaných do kruhu kolem
plazmového výboje a příslušné záření je vybíráno
konkrétním filtrem a zesilováno fotonásobičem.
ICP-LEAFS, laserem excitovaná atomová
fluorescenční spektrometrie a
ICP-LEIFS, laserem excitovaná iontová fluorescenční
spektrometrie, používají místo výbojek LASER. Síla
fluorescenčního záření se použitím laseru zvýší.
ICP-MS, hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným
plazmatem; plazmový výboj lze kombinovat i s hmotností
spektrometrií. Tato metoda má nízké meze detekce a
možnost multiprvkové analýzy, případně stanovení
izotopového složení. Existují analyzátory vhodné k rutinní
praxi, jako příklad je uveden ICP-MS spektrometr Aurora m90.
Indukčně vázané plazma
ICP-MS spektrometr Aurora m90
http://www.icp-ms.cz/icp-ms-spektrometr-aurora-m90.php#content
Na této adrese lze nalézt podrobný popis moderních ICP-MS
spektrometrů Aurora m90 a Aurora elite. Kromě toho je na stránce
přístupné video, podrobně popisující přístroj Aurora m90 a principy jeho
funkce.
Plazmová hlavice je tvořena třemi křemennými trubicemi a je
umístěna v chlazené kruhové indukční cívce s protékajícím
vysokofrekvenčním proudem. Plazma je udržováno tím, že
v podstatě „zastupuje“ sekundární vinutí transformátoru.
Stručný, ale zcela postačující, přehledný popis metod pro analýzu stopových prvků
lze nalézt v publikaci
Kolektiv autorů: Vitaminy a stopové prvky 2007, ČSKB, SEKK, Pardubice 2007
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-18
Pavel Nezbeda
1. Příprava vzorku. Některé vzorky vyžadují
speciální přípravu, která zahrnuje působení
kyselinami, zahřívání a účinek mikrovln
2. Nebulizace: přeměna tekutiny na aerosol
3. Dehydratace/přeměna na plyn: voda je
odejmuta a zbývající tekuté a pevné části
jsou převedeny na plyn
4. Atomizace: vazby v plynné fázi jsou
přerušeny, přítomny jsou pouze atomy.
Důležitými podmínkami v této fázi jsou
inertní chemické prostředí a teplota plazmy
5. Excitace/emise: atomy získávají energii
z kolizí a vysílají charakteristické záření
6. Separace/detekce: mřížka rozkládá světlo,
které je kvantitativně měřeno
JEDNOTLIVÉ KROKY PŘI ANALÝZE VODNÝCH VZORKŮ METODOU ICP-AES
Schéma emisního spektrometru
s indukčně vázaným plazmatem
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-19
Pavel Nezbeda
Hmotnostní
spektrometrie:
 Látka se převede do
plynného stavu,
 neutrální molekuly plynu se
převedou (v iontovém
zdroji) na ionty a
 ty jsou v analyzátoru
hmotnostního spektrometru
rozděleny podle svých
specifických nábojů (poměr
hmotnosti částice k jejímu
náboji, m/z).
 Detekční a registrační
zařízení hmotnostního
spektrometru zaznamenává
hmotnostní spektrum, kde
poloha vrcholů (píků,
peaks) přísluší hmotnosti
iontu a výška píku odpovídá
intenzitě svazku
příslušných iontů.
Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS):
Vybraný ion je podroben excitaci (nejčastěji srážkami s inertním plynem, tzv. kolizním plynem), čímž může dojít k
rozpadu tohoto iontu na fragmentové ionty, jejichž hmotnostní spektrum se měří.
Podrobnosti k metodě viz např. na adresách
- http://www.pmfhk.cz/Prednasky/Zaklady_MS.pdf
- http://webak.upce.cz/~kbbv/Student/Vyuka/Imunologie_imunochemie/Prednasky/Prednasky_Henrychova/Zakla
dy_hmotnostni_spektrometrie.pdf
Hmotnostní spektrum chlorbenzenu
odrazná
elektroda
odrazná
elektroda
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-20
Pavel Nezbeda
Schéma atomového absorpčního spektrometru
Dutá
katoda
Atomizér
Vzorek
Monochromátor Detektor
Zesilovač
Výstup
Oblak
atomů
Z výbojky, tzv. duté katody (dutá výbojka má katodu z kovu, který chceme stanovit, např. z vápníku, hořčíku ze železa apod.),
prochází záření oblakem atomů získaným v atomizéru (plamen, uhlíková komora), monochormátor vybere konkrétní měřenou
vlnovou délku – charakteristické záření, detektor promění toto světelné záření na elektrickou veličinu, která je v zesilovači
zesílena, poté změřena a příslušným procesorem vyjádřena jako výstupní hodnota. Platí zde nepřímá úměra – čím více je atomů
v oblaku, tím více bude světlo pohlcováno a intenzita záření vstupujícího do detektoru bude tím menší.
Zdroj záření – dutá katoda – může být pouze pro konkrétní prvek, pak je vždy při měření dalšího prvku zdroj záření vyměnit,
nebo pro několik prvků, které je v tom případě možno měřit postupně za sebou.
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-21
Pavel Nezbeda
12.4. Stručné shrnutí kapitoly
12.4.1. Železo
 Železo je jedním z fyziologicky nejvýznamnějších prvků. Důležité je zejména v hemu, který je
součástí hemoglobinu a myoglobinu, cytochromů, cytochromoxidázy, peroxidázy, katalázy a jiných
enzymů. Ve formě FeS-proteinu se železo účastní přenosu elektronů.
 Metabolismus železa připomíná metabolismus stopových prvků, v plazmě, ECT a v buňkách se
nachází velmi málo volného železa, protože je pro organismus toxické. Organismus si železo
chrání a denně dojde ke ztrátě pouze asi jedné tisíciny celkového obsahu železa.
 V organismu se železo nachází v hemoglobinu, myoglobinu, v transferinu, ve feritinu a
hemosiderinu, v labilním poolu.
 Železo se vstřebává (do enterocytů) jako dvojmocné, proto musí být před absorpcí zredukováno
z trojmocného stavu, ve kterém se nachází v přebytku v potravě. Absorpce se zúčastňují Fe(III)reduktáza,
různé kyseliny, transportér pro dvoumocné kovy DMT-1 a pravděpodobně i přenašeč
hemu HCP1.
 Do krevního oběhu se dostává železo přes transportér feroportin-1, za přispění hephaestinu
(ferooxidázy závislé na mědi)
 Z orgánu do orgánu je transportováno železo ve formě transferinu, což je globulin (apotransferin)
se dvěma vazebnými místy vždy pro jeden atom železa. Na apotransferin se váže železo trojmocné,
přeměnu z dvojmocného na trojmocné železo zajišťuje cerulopasmin.
 Skladuje se ve formě feritinu a hemosiderinu.
 Regulace metabolismu železa se děje prostřednictvím transportéru feroportinu-1 a negativního
regulátoru uvolňování železa z enterocytů duodena, makrofágů a hepatocytů, hepcidinu. Zvýšená
hladina železa v plazmě zapříčiní zvýšenou syntézu hepcidinu v játrech, hepcidin se naváže na
feroportin a ten se zanoří do buňky, kde dojde k jeho rozkladu. Buňka pak nemůže exportovat
železo do plazmy.
 Nedostatek železa patří k nejrozšířenějším poruchám. Příčinou nedostatku jsou karence v potravě,
zvýšená potřeba železa (děti, těhotné ženy), chronické ztráty (krvácení, menstruace, jícnové varixy,
hemeroidy, polypy), špatné vstřebávání (malabsorpce), nadbytečný příjem některých léků.
Důsledkem je omezená krvetvorba, vyvíjí se sideropenická anémie.
 Nadbytek železa může být pro organismus fatální, díky zvýšené tvorbě kyslíkových radikálů.
K vážným újmám mohou dojít zejména játra (cirhóza, hepatocelulární karcinom), pankreas
(diabetes mellitus jako následek zničení Langerhansových ostrůvků), myokard (kardiomyopatie až
se srdečním selháním), klouby (bolesti) a také endokrinní žlázy (různé poruchy). Příčinami jsou
nadbytečný přívod železa perorální nebo parenterální cestou, mnohačetné transfuze a genetické
onemocnění hereditární hemochromatóza.
 Metody stanovení železa jsou
o atomová absorpční spektrometrie (metoda první volby)
o fotometrie (bathofenantrolin, ferrozin, TPZT, ferene, chromazurol B, CTMA)
 Transferin kromě transportní funkce slouží jako vazebná rezerva pro železo. Transferin se
stanovuje imunochemicky.
 Celková vazebná kapacita je maximální koncentrace železa, kterou mohou navázat sérové proteiny,
zejména transferin. Je to součet sérového železa a volné vazebné kapacity. Volná vazebná
kapacita slouží jako „nárazník“ pro volné železo, mění se podle poruch metabolismu železa.
Celková vazebná kapacita se snižuje při chronických infekcích, zhoubných nádorech, otravě
železem, onemocnění ledvin, nefróze aj. Nedostatek železa, těhotenství, orální antikoncepce a
virová hepatitida naopak způsobují nárůst celkové vazebné kapacity.
 Plazmatický ferritin je v rovnováze s tělesnými zásobami. Jeho koncentrace klesá velmi záhy při
rozvoji nedostatku železa. Pro zjištění obsahu železa v organismu je proto lépe stanovit ferritin,
pokud tento není zvýšen jako reaktant akutní fáze. Feritin se stanovuje imunochemicky.
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-22
Pavel Nezbeda
12.4.2. Stopové prvky
 Většina prvků v živých organismech se nachází v gramových množstvích na kg tkáně. Prvky
stopové se vyskytují v miligramových množstvích na kg tkáně, prvky ultrastopové jsou
v tkáních přítomny v mikrogramových množstvích na kg tkáně.
 Stopové prvky lze rozdělit podle jejich biologických funkcí na esenciální stopové prvky
s definovanou denní dávkou (Zn, I, Se, Fe), esenciální stopové prvky s definovanou esenciální rolí
v metabolismu, ale bez přesného stanovení denní dávky (Cu, Mn, Cr, Co, Mo, F), ultrastopové
prvky, u nich nebylo doposud jednoznačně určeno zda jsou esenciální nebo škodlivé ve
zjišťovaných koncentracích (Li, Ni, Sn, Si, V, B) a toxické stopové prvky u nichž není u lidí známa
biologická funkce, ale které i v relativně nízkých koncentracích způsobují patologické změny (Al, As,
Cd, Pb, Hg).
 Hlavní biochemickou úlohou stopových prvků je katalytické působení v enzymových systémech, kde
se uplatňují jako kofaktory, nebo jako součásti metaloenzymů, pevně navázány na bílkovinu. Zdá se
také, že hrají významnou strukturální roli v jednotlivých buněčných komponentách. Významnou je
také účast při likvidaci volných radikálů (např. superoxiddismutáza, SOD).
 Obsah stopových prvků v organismu je závislý na dietě, tj. na přísunu zvenku a na schopnosti
organismu prvky absorbovat. Rozeznávají se dva hlavní typy nutričních deficitů:
o Typ I: dojde k defektu specifických metabolických cest, ke ztrátě funkce a specifickým
klinickým příznakům: Fe, I, Cu, Se. Klinický deficit se vyvíjí v různých časových úsecích –
Fe týdny, Cu několik měsíců, Se měsíce i roky.
o Typ II: specifické diagnostické klinické známky neexistují nebo se vyvíjejí až po poměrně
dlouhé době. Typickými představiteli jsou Zn a Cr.
12.4.3. Metody stanovení stopových prvků
 Nejznámější metody pro stanovení stopových prvků v biologických materiálech jsou
o Potenciometrie (iontově selektivní elektrody)
o Voltametrie (polarografie apod.)
o Rentgenová fluorescenční spektrometrie
o Fotometrie a spektrofotometrie
o Atomová absorpční spektrometrie
o Hmotnostní spektrometrie
o Neutronová aktivační analýza
o Emisní spektroskopie
 plazmová emisní spektrometrie,
 hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem
o HPLC techniky
 Pro klinickou biochemii připadají v úvahu zejména atomová absorpční spektrometrie (větší
pracoviště) a fotometrie (menší pracoviště, omezené portfolio metod)
 Preanalytická fáze musí zabránit kontaminaci vzorků prvky, které mají být stanovovány.
Používají se metal free (prosté kovů) odběrové nádobky, případně speciálně myté sklo.
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-23
Pavel Nezbeda
12.5. Kontrolní otázky
1 Zodpovězte si otázku, proč jsou vápník, hořčík a fosfor probírány společně.
2 V jakých formách se tyto prvky vyskytují v organismu? Zejména vápník a hořčík?
3 Co znamená pojem „ionizovaný vápník“ a formy „aktivní“ a „inaktivní“?
4 Jaký je fyziologický význam vápníku, hořčíku a fosfátů?
5 Kde tato kapitola navazuje na kapitolu věnovanou hormonům? Dokážete najít všechna styčná
místa?
6 Jaké jsou metody stanovení vápníku? V čem se shodují se stanovením hořčíku? V čem se odlišují?
Dá se stejnými metodami stanovit ionizovaný vápník?
7 Jaký je rozdíl mezi titrační látkou pro komplexometrii a komplexometrickým indikátorem?
8 Jaký vliv mají přebytek a nedostatek vápníku? A co hořčík?
9 Uplatňuje se zde (otázka č. 7) nějakým způsobem fosfor? Případně jiné látky?
10 Stanovují se tyto prvky i v moči? Pokud ano, proč?
11 Co je to anorganický a organický fosfor (fosfát)?
12 Jak se stanovují anorganické fosfáty?
13 Existují stavy z nedostatku či přebytku fosfátů?
14 Je železo stopový prvek nebo není?
15 V jakých formách existuje železo v těle?
16 Prostudujte si „Schéma metabolismu a metabolických cest Fe v lidském organismu“, případně si i
pusťte video (odkaz je pod schématem).
17 Pochopili jste pojem „receptorem zprostředkovaná endocytóza“?
18 Jak je to s mocenstvím železa?
19 Co zásobní formy?
20 Co je to „hepcidin“?
21 Jak se stanovuje železo?
22 Co je to vazebná kapacita a jak se stanovuje? Rozumíte pojmům „celková vazebná kapacita“ a
„volná vazebná kapacita“?
23 Máte představu o klinice Fe?
24 Co je to transferin?
25 Co je to ferritin? Kde je o něm ještě pojednáváno zvlášť?
26 Které stopové prvky jsou pro člověka esenciální, tj. nezbytné?
27 Uvědomujete si které prvky jsou pravděpodobně pro člověka nezbytné?
28 Co jsou to nutriční deficity?
29 Co víte o zinku, mědi a selenu?
30 Umíte vyjmenovat základní analytické metody stanovení stopových prvků? Rozumíte jejich
principům?
Klinická biochemie Kapitola 12. Železo a stopové prvky
12-24
Pavel Nezbeda
OBSAH:
Kapitola 12 Železo a stopové prvky............................................................................................................. 12-1
12.1. Železo............................................................................................................................................. 12-1
12.1.1. Rozdělení železa v organismu................................................................................................ 12-1
12.1.2. Regulace hladiny železa v organismu .................................................................................... 12-3
12.1.3. Klinické poznámky .................................................................................................................. 12-5
12.1.4. Metody stanovení sérového železa (S-Fe)............................................................................. 12-6
12.1.5. Transferrin............................................................................................................................... 12-7
12.1.5.1. Stanovení celkové (TIBC) a volné (UIBC) vazebné kapacity.......................................... 12-7
12.1.5.2. Klinické poznámky........................................................................................................... 12-8
12.1.5.3. Saturace a koncentrace transferinu................................................................................. 12-8
12.1.6. Ferritin a význam jeho stanovení ............................................................................................ 12-8
12.1.6.1. Principy stanovení ferritinu .............................................................................................. 12-8
12.1.7. Podmínky, o nichž je známo, že ovlivňují koncentraci S-Fe, TIBC, saturaci transferrinu……12-9
12.2. Stopové prvky.............................................................................................................................. 12-10
12.2.1. Měď ....................................................................................................................................... 12-11
12.2.2. Zinek ..................................................................................................................................... 12-11
12.2.3. Křemík................................................................................................................................... 12-12
12.2.4. Selen ..................................................................................................................................... 12-12
12.2.5. Chróm ................................................................................................................................... 12-13
12.2.6. Kobalt .................................................................................................................................... 12-13
12.2.7. Mangan ................................................................................................................................. 12-14
12.2.8. Molybden............................................................................................................................... 12-14
12.2.9. Fluór ...................................................................................................................................... 12-15
12.2.10. Jód ...................................................................................................................................... 12-15
12.3. Analytické metody užívané pro stanovení stopových prvků ........................................................ 12-16
12.4. Stručné shrnutí kapitoly................................................................................................................ 12-21
12.4.1. Železo ................................................................................................................................... 12-21
12.4.2. Stopové prvky ....................................................................................................................... 12-22
12.4.3. Metody stanovení stopových prvků ...................................................................................... 12-22
12.5. Kontrolní otázky............................................................................................................................ 12-23