Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-1
Kapitola 13 Bílkoviny
V lidském těle se nachází asi 500 000 různých druhů a forem proteinů. Jejich studiem, tzn. identifikací a
kvantifikací všech proteinů v organismu, poznáním jejich struktury a biochemických vlastností, úlohou
v buňce, orgánech i celém organismu, studiem změn těchto parametrů za fyziologických i patologických
okolností se zabývá proteomika (proteomics). Je to obrovská vědní oblast širokého záběru, jejíž význam
stále roste. Výzkumný projekt, který se celou problematikou zabývá se nazývá HUPO (Human Proteome
Organization - Organizace humánní/lidské proteomiky, resp. zabývající se lidskou proteomikou; Internetová
adresa je http://www.hupo.org/).
V tomto textu se omezíme pouze na některé bílkoviny nacházející se v lidském těle. Předmětem našeho
zájmu budou především bílkoviny krevní plazmy.
13.1. Bílkoviny krevní plazmy
Plasma obsahuje několik stovek, možná i několik tisíc proteinů, biologická funkce je však známa pouze u
menší části z nich. Kromě albuminu a C-reaktivního proteinu jsou to glykoproteiny, s obsahem sacharidů
mezi 10 – 25%.
Největší část obsahu plazmatických bílkovin tvoří albumin, dále pak imunoglobulin G a zbytek s víceméně
stejným (menším) podílem tvoří transferin, fibrinogen, imunoglobuliny A a M, alfa-1-antitrypsin, složka
komplementu C3 a haptoglobin. Asi 10% celkového obsahu plazmatických proteinů je rozděleno mezi
lipoprotein (a) a apolipoprrotein A1, které představují největší podíl této části plazmatických bílkovin,
apoliprotein B, kterého je o něco méně a v menších množstvích faktor H, ceruloplasmin, složku
komplementu C4, komplement faktor B, složky komplementu C8, C9, C1q a prealbumin. Jedná se hrubý
odhad obsahu nejdůležitějších plazmatických bílkovin, jejich obsah v plazmě se dynamicky mění, závisí na
rychlosti syntézy a katabolismu a distribuci bílkovin mezi intravazální a extravazální tekutinu. Na
následujícím obrázku je ukázáno poměrné zastoupení hlavních bílkovin v plazmě v grafické formě.
Převzato z edukačního materiálu fy Abbott, Learning Guide Protein
13.1.1. Význam bílkovin krevní plazmy
 Udržování osmotického tlaku bílkovin (tj. koloidně osmotického = onkotického tlaku), což je
důležité zejména v krevní kapiláře, jejíž stěna propouští vodu i ionty a prakticky nepropouští
bílkoviny, tedy osmotický tlak v kapiláře je dán zejména osmotickým tlakem bílkovin, na kterém se
podílí z asi 70% albumin; význam pro udržení tekutin v krevním řečišti, zabránění vzniku otoků
 Transport řady látek, především látek nerozpustných ve vodě, případně i léků (prealbumin,
albumin, ceruloplazmin, transferin, apoproteiny, transkortin, protein vázající thyroxin = TBP)
 Obrana proti infekci (imunoglobuliny = specifická humorální imunita a komplement = nespecifická
humorální imunita)
 Hemokoagulace a fibrinolýza (koagulační faktory a faktory zajišťující rozpouštění trombu)
 Funkce enzymů a inhibitorů
- enzymy (v plazmě jsou aktivní např. cholinesteráza a ceruloplazmin)
- inhibitory proteáz bránící napadení poškozených a zanícených tkání proteolytickými enzymy
(patří sem např.1-antitrypsin,1-antichymotrypsin a -makroglobulin)
 Speciální funkce, např. ochrana před volnými radikály, resp. zábrana jejich tvorby (albumin,
ceruloplazmin, haptoglobin, hemopexin)
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-2
13.1.2. Metody stanovení celkových bílkovin
1. Podle Kjeldahla (referenční metoda)
2. Pomocí Folinova a Ciocalteauova činidla (Folin-Ciocalteau)
3. Biuretovým činidlem (biuret)
4. Přímá fotometrie v UV oblasti
5. Turbidimetrie
6. Vazbou barviva (pyrogalollová červeň)
Stanovení celkových bílkovin podle Kjeldahla
Princip: Po mineralizaci organické dusíkaté látky varem s koncentrovanou kyselinou sírovou se dusík
přítomný ve formě různých funkčních skupin převede na amoniak, který zůstane vázán ve formě síranu
amonného, alkalizací se amoniak ze síranu uvolní a stanoví se titračně.
a. mineralizace (kjeldahlizace)
Ke vzorku se přidá
 kyselina sírová + peroxid vodíku nebo
 kyselina chloristá nebo
 katalyzátor (tzn. směs síranu měďnatého, selenu a síranu draselného)
a vzorek se zahřívá na pískové lázni nebo elektrické plotně; kyselina sírová mineralizuje bílkoviny (obsah
černá uhlíkem z organických látek), oxidační činidla převádějí uhlík na oxid uhličitý (mineralizovaná směs se
odbarví). Odbarvení obsahu a husté bílé dýmy oxidu sírového avizují (oznamují) konec mineralizace. Dusík
z organických látek dává s kyselinou sírovou síran amonný.
b. stanovení amonného iontu titračně:
Po alkalizaci obsahu mineralizační baňky louhem sodným se uvolněný amoniak destiluje s vodní parou
do
 HCl + titrace nadbytku kyseliny louhem sodným, za použití metylčerveně jako indikátoru, nebo do
 H3BO3 + titrace KHJ2O6 (tj. KJO3.HJO3; kyselý jodičnan draselný), což je přesnější než titrace
louhem
Existují i jiná uspořádání metody
Hodnota koncentrace bílkovin se vypočte pomocí empirického faktoru:
Nbílk x 6,25 = bílkoviny [g/l]
kde N je stanovená hodnota dusíku a 6,25 je empirický faktor: 100/16 = 6,25 (bílkoviny
obsahují v průměru 16% dusíku); v literatuře lze nalézt i jiné hodnoty přepočítávacího faktoru
(obsah dusíku v jednotlivých bílkovinách se různí)
Stanovení bílkovin krevního séra kjeldahlizací je komplikovanější o to, že v krvi jsou
přítomny i dusíkaté látky nebílkovinného původu. Je proto zapotřebí stanovit
celkový dusík v krvi, poté vysrážet bílkoviny, např. kyselinou trichloroctovou a v
supernatantu také stanovit dusík. Dusík bílkovin pak bude rozdílem mezi dusíkem
celkovým a nebílkovinným:
Dusík plazmatických bílkovin = celkový dusík (plná krev) - nebílkovinný dusík (supernatant)
Metoda je obecně zdlouhavá a vyžaduje digestoř. V běžné praxi (klinické
biochemie) se v podstatě nepoužívá, slouží však stále jako metoda
referenční pro definici referenčních materiálů.
Mineralizace
vzorku
Alkalizace
pomocí NaOH
Destilace NH4
+
do
HCl
H3BO3
Titrace NaOH
Titrace KHJ2O6
Metody 4., 5. a 6. jsou vhodné pro stanovení nízkých koncentrací proteinů
(např. v moči, likvoru...)
Souhrn
Kjeltec 8400
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-3
Dříve používaná rutinní mineralizační metoda
Vysrážené bílkoviny se mineralizovaly s kyselinou sírovou a
 vzniklý síran amonný se stanovil fotometricky při použití Nesslerova činidla (K2[HgI4] = HgI2.2KI)
[tetrajodortuťnatan draselný)
 uvolněný amoniak reagoval za katalýzy nitroprussidem sodným s fenolovým činidlem (fenolátem
sodným) Berthelotovou reakcí za vzniku modrého zbarvení vhodného k fotometrii.
Existují moderní automaty na stanovení dusíku Kjeldahlovou metodou, které poskytují spolehlivé výsledky,
a to poměrně rychle. Příkladem přístroje může být např. Kjeltec 8400 firmy FOSS, učený pro analýzu
potravin (podrobnosti lze nalézt zde).
Fotometrické stanovení bílkovin podle Folina
Činidlo se nazývá fenolické, protože se používá ke stanovení fenolů.
Princip: Fenolický hydroxyl tyrosinu z bílkoviny redukuje fosfomolybdenany a
fosfowolframany činidla za vzniku modrého zbarvení (wolframová a molybdenová
modř), které se fotometruje.
Standard: tyrozin (1 g bílkoviny obsahuje cca 16 mg tyrozinu)
Stanovení bílkovin biuretovým činidlem
Princip: Tvorba fialově zbarvených komplexů mědi s bílkovinou
Reakce není specifická jenom pro bílkoviny, reagují i peptidy, počínaje tripeptidy (je nutná přítomnost
minimálně dvou peptidických vazeb). Vhodné pro stanovení bílkovin v séru, v moči jedině po vysrážení a
rozpuštění bílkovin (existují však přijatelnější metody – viz dříve), pro bílkoviny v mozkomíšním moku se
nehodí.
Nejjednodušší takto stanovitelnou látkou je BIURET – odtud název metody.
Biuret vzniká tepelnou přeměnou močoviny (NH2-CO-NH2).
Standard: albumin.
Stanovení bílkovin přímou fotometrií při 280 nm
Princip: Aromatické kruhy tyrozinu a tryptofanu (ty jsou standardně zastoupeny ve většině proteinů)
absorbují záření o vlnové délce 280 nm. Takto lze stanovit většinu bílkovin.
Interferují např. nukleové kyseliny, které ale absorbují více při 260 nm.
Interferenci lze potlačit zavedením korekčních faktorů.
Metoda je, při odpovídající instrumentaci, vhodná pro stanovení malých množství
bílkovin. Využívá se např. pro měření koncentrace bílkovin v průtokové kyvetě na
výstuu chromatografu.
Turbidimetrické stanovení bílkovin
Princip: Měření zákalu po denaturaci bílkovin kyselinou sulfosalicylovou, trichloroctovou,
benzethoniumchloridem aj.
Dříve bylo velmi používáno tzv. Extonovo činidlo, jehož základem je kyselina sulfosalicylová. Moderním
činidlem je benzethoniumchlorid (vzorec viz v kapitole 5.na str. 5.11).
Stanovení bílkovin s využitím vazby barviva na bílkoviny
Princip: Barvivo (Coomasie modř, Ponceau červeň, pyrogallolová červeň, bromkresolová modř aj.) se
naváže na bílkovinu a přitom dojde ke změně zbarvení. Měří se úbytek absorbance. V principu se jedná o
stejný jev, jaký je popsán u průkazu bílkovin v moči diagnostickým proužkem, proteinovou chybu
acidobazického indikátoru (viz kapitola 5, str. 5-10).
Standard: lidské sérum se známým obsahem bílkovin
Referenční hodnoty: 62 – 82 g/l
13.1.3. Klinické poznámky
 Hypoproteinémie – příčiny: převodnění pacienta, malnutriční stavy, snížení koncentrace jedné nebo
několika málo bílkovin (např. ztráta albuminu při nefrotickém syndromu, nedostatečná tvorba albuminu u
těžkých hepatopatií aj. = celková hypoproteinémie)
 Hyperproteinémie – příčiny: dehydratace pacienta, zvýšení koncentrace jedné nebo několika málo
bílkovin (např. polyklonální či monoklonální hyperimunoglobulinémie)
Tryptofan
Tyrozin
NH2NH2 NH
O O
Biuret
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-4
13.1.4. Elektroforéza bílkovin
Princip:
V podstatě lze rozlišit elektroforézu volnou, tj. v roztoku a elektroforézu na nosičích.
V současné době se nejvíce používá právě elektroforéza na nosičích, čili zónová.
Elektroforeticky zkoumaná látka se pohybuje v pórovitém prostředí, kterým je
agarový gel, agarosový gel, škrobový gel, polyakrylamidový gel či proužky z
acetylované celulózy.
Pohyblivost jednotlivých částic (iontů) je ovlivňována
 napětím
 procházejícím proudem
 složením použitého pufru (pH, iontová síla, použitý pufrový systém, čili
přítomné ionty),
 do jisté míry i použitým prostředím (např. putování bílkovinných frakcí
v agaru či agaróze se do značné míry blíží elektroforéze volné; v agaru se
uplatňuje tzv. elektroendosmóza, která strhává některé frakce zpětným
tokem ke katodickému konci a proto start musí být uprostřed nosiče, na
rozdíl např. od elektroforézy na acetylované celulóze apod.)
 velikostí molekuly testovaného iontu (ve většině případů je prostředí
tvořeno tzv. molekulovými síty, typickými příklady jsou škrob a
polyakrylamidový gel). [Technické parametry v hodinách instrumentální
analýzy].
V českých zemích je jedním z nejpoužívanějších komerčně dostupných nosičů Hydragel (firma Sebia),
což jsou agarózové gely určené pro různé typy dělení (bílkovin v plazmě, v moči, v mozkomíšním moku; lipoproteinů; isoenzymů LD
aj.) Viz též WEB Sebia. Současným trendem je přechod na kapilární elektroforézu.
Kdo má rád hry, může si pohrát s vcelku zdařilým grafickým znázorněním vertikální gelové elektroforézy v polyakrylamidovém gelu o
různých koncentracích na internetové adrese http://people.rit.edu/pac8612/electro/Electro_Sim.html ; jediným požadavkem je
angličtina, ale i bez ní to lze zvládnout, a připojení na Internet.
Rozdělení směsi bílkovin na frakce
Elektroforéza na fóliích z acetátcelulózy nebo v agarózovém gelu dělí bílkoviny krevního séra na 5 až 6
frakcí: albumin a čtyři (až pět) frakcí globulinů - 1,2(1 a 2) a . Frakce albuminu je tvořena
jedinou bílkovinou. Někdy je před albuminem patrná frakce prealbuminu, tj. transthyretinu.
Elektroforeogram
Denzitometrické vyhodnocení
elektroforeogramu typického
dělení sérových bílkovin
soupravou HYDRAGEL PROTEIN
K20 firmy Sebia s rozpisem
obsahu jednotlivých bílkovin
v oddělených frakcích
Elektroforézou se rozumí pohyb (nabitých) koloidních částic nebo iontů
v homogenním stejnosměrném elektrickém poli
Ukázka zdroje napětí a
proudu a elektroforetických
van z nabídky firmy BioTech a.s.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-5
Ostatní frakce, tj. frakce globulinové, obsahují větší množství bílkovin:
 1-globuliny:1-lipoprotein, orosomukoid,1-antitrypsin
 2-globuliny: 2-makroglobulin, ceruloplasmin, haptoglobin, pre--lipoprotein
 -globuliny: transferin, fibrinogen, C-reaktivní protein,lipoprotein
 -globuliny: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
Elektroforetické typy
Na základě dlouholetých zkušeností s elektroforézou bílkovin krevního séra
na konkrétním nosiči lze z charakteru rozdělení frakcí, tj. z určitého
elektroforetického typu (vymizení frakcí, objevení se nových frakcí, jiný
vzájemný poměr frakcí atd.) usuzovat na určité skupiny chorob či stavů.
Nárůst (,  atd. podle intenzity nárůstu) či pokles (, ...) jednotlivých
frakcí lze hodnotit vizuálně nebo pomocí jednoúčelového fotometru, tzv.
denzitometru, který výsledky vydá číselně i ve formě křivky.
ELFO typ
Elektroforetická frakce
Albumin Globuliny
    
1. Typ akutního zánětu    N () N
2. Typ chronického zánětu    N N *)
3. Typ chronické hepatopatie      
4. Typ nefrotického syndromu  N    
5. Typ malnutrice  () N () N () N N
6. Typ monoklonální
hyperimunoglobulinémie
 Kdekoli úzký proužek monoklonálního imunoglobulinu; -frakce může zcela vymizet
7. Vzácnější nálezy Viz dále popis "Vzácnější nálezy"
*)
široký pruh -globulinů různých typů = polyklonální hyperimunoglobulinémie
Legenda: N = nezměněno, = zvýšeno ,  = sníženo [v obou případech počet šipek označuje sílu změny], () = může být
zvýšeno
1. Typ akutního zánětu
Celková bílkovina je normální, lehké snížení albuminu, vzestup 1- a
2-globulinů, případně i 2-globulinů.
Akutní rozsáhlý zánět, především bakteriální. Nález je u všech akutních
stavů (po operacích, úrazech, infarktu myokardu apod.). Akutní
hepatitida. Aktivní zánět u revmatoidní arthritidy, u rychle rostoucích
malignit (zhoubných nádorů).
2. Typ chronického zánětu
Pokles albuminu. Vzestup 1- a 2-globulinů (menší než u typu ad 1.),
výrazný vzestup -globulinů (široký pruh -globulinů na
elektroforeogramu). Jedná se o tzv. polyklonální
hyperimunoglobulinémii.Chronické infekční choroby, zánětlivá
onemocnění pojiva, autoimunitní choroby, maligní nádory
1 + 2 + 3 + 4 (± 5)
A B C
2 (± 5)
1 + 2 + 3 + 4 + 5
2 (± 5)
1 + 3 + 4 (± 5)
2-zóna
1 = 2-makroglobulin
2 = haptoglobin
3 = ceruloplasmin
4 = GC globuin
5 = 1-lipoprotein
Rozdělení sérových proteinů
do pěti frakcí na Hydragelu firmy Sebia
Automat HYDRASYS 2
Eelektroforéza proteinů; firma Sebia
Rozkreslení možných tvarů dělení alfa-2 zóny
(obrázky převzaty z, ev. upraveny podle
firemních materiálů firmy A. L.Instruments a z
www.sebia.com)
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-6
3. Typ chronické hepatopatie
Pokles albuminu,1-, 2- aglobulinů (tj. bílkovin
tvořených játry). Vzestup -globulinů (především IgA,
který se nalézá mezi  a  globuliny a tvoří tzv. 
můstek mezi těmito frakcemi,-globulinová frakce
nasedá přímo na frakci -globulinů)
Těžká fibróza až jaterní cirhóza, chronická hepatitida.
4. Typ nefrotického syndromu (ztráty bílkovin)
Velký pokles albuminu. Poklesglobulinů.
Nárůst2- aglobulinů. (Ztráty především bílkovin
s malou molekulou)
Nefrotický syndrom (chronická glomerulonefritida,
postižení ledvin při systémových onemocněních,
diabetická glomeruloskleróza, amyloidóza, některá
infekční onemocnění)
5. Malnutriční typ
Celková bílkovina výrazně snížena. Velký pokles
albuminu a1-globulinů.
Chybění aminokyselin, z toho vyplývající porucha
syntézy bílkovin.
6. Monoklonální hyperimunoglobulinémie
Nižší koncentrace albuminu. Někde (tj. kdekoli) mezi 1- až -globuliny se nachází úzký proužek monoklonálního
imunoglobulinu.
Nádorové onemocnění mnohočetný myelom. Waldenströmova makroglobulinémie, hemoblastózy, karcinom,
plazmocytom aj. S věkem výskyt paraproteinů roste, ve stáří se i u zdravých lidí objevují benigní monoklonální
imunoglobuliny, a to bez klinických příznaků onemocnění.
7. Vzácnější nálezy
Bisalbuminémie (zdvojení frakce albuminu), analbuminémie (chybí frakce albuminu),
deficit 1-antitrypsinu (chybí 1-frakce), atransferinémie (pokles 1-globulinů),
hypogamaglobulinémie (dědičný či získaný defekt syntézy imunoglobulinů).
Hemolytické sérum – projevy při elektroforéze:
 posun 2-globulinů ke katodě
 zvýšení 2-globulinů)
 fibrinogen (proužek mezi - a -globuliny),
 zvýšení -lipoproteinů (LDL; intenzivní proužek voblasti)
Moderním trendem v oblasti elektroforézy bílkovin je využívání kapilární
elektroforézy, což je v podstatě volná elektroforéza. Svými dělicími
vlastnostmi se blíží metodám chromatografickým, je jednodušší a méně
nákladná.
Zajímavostí je např. použití kapilární elektroforézy pro stanovení kyseliny mravenčí,
metabolitu metylalkoholu (viz Kapitola 18, Toxikologie, str. 18-14).
Různé elektroforetické typy
Agarosový gel, Hydragel Protein(e) 15/30, firma Sebia
Hereditární bisalbuminémie
A. Klasické dělení na
Hydragel Proteine
B. Dělení pomocí kapilární
elektroforézy Capillarys®
Sebia
Přístroj pro kapilární elektroforézu
od firmy Beckman-Coulter
MINICAP pro kapilární elektroforézu
od firmy Sebia
(video zde)
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-7
13.1.5. Jednotlivé bílkoviny krevní plazmy
Prealbumin (transthyretin)
Jaterní transportní protein pro hormony štítné žlázy, molekulová hmotnost 55 000, váže i transportní
bílkovinu pro vitamín A (zábrana ztrátám do moči)
 = porucha proteosyntézy v játrech u těžkých hepatopatií nebo proteinové malnutrice
Albumin
Více než polovina plazmatických bílkovin, tvoří se v játrech, molekulová hmotnost 68 000, ze 75% se podílí
na onkotickém tlaku (osmotický tlak bílkovin) plazmy, transportní bílkovina pro nekonjugovaný bilirubin,
neesterifikované mastné kyseliny, hormony štítné žlázy, vápník, hořčík, zinek a jiné minerály. Váže i některé
léky. Součást extracelulárního antioxidačního systému v ochraně proti volným radikálům. Plazmatická
koncentrace albuminu je jedním z klinických parametrů celkového zdraví. Existuje výrazná korelace mezi
nízkou koncentrací plazmatickou albuminu a morbiditou a mortalitou hospitalizovaných pacientů.
 = snížená syntéza u těžké hepatopatie či proteinové malnutrice, zvýšený katabolizmus u akutních zánětů a nádorů
v akutních stavech (negativní reaktant akutní fáze – viz str. 10-9), zvýšené ztráty ledvinami (nefrotický syndrom),
do GIT, kůží ap., převodnění (hyperhydratace), v těhotenství (nárůst tělní tekutiny)
Metody stanovení albuminu
 Bromokresolový purpur – BCP (5,5´-dibrom-o-kresolsufoftalein) tvoří s albuminem ve slabě kyselém
prostředí za přítomnosti povrchově aktivních látek komplex vhodný k fotometrickému stanovení (603
nm), dochází k přeměně barvy ze žluté (barvivo) na zelenou (komplex)
 Bromkresolová zeleň - BCG (3,3´,5,5´-tetrabrom-m-kresolsulfoftalein) se váže na albumin a
vytvořený komplex se stanovuje fotometricky při 628 nm
 malá množství albuminu (např. v moči) se stanovují imunochemicky (viz mikroalbuminurie v kap.14)
Referenční hodnoty: 35 – 53 g/l (metoda s BCG, fa Erba Lachema s.r.o.
Alfa1-globuliny
Alfa1-inhibitor proteáz (API)
Jaterní glykoprotein nazývaný též 1-antitrypsin (AAT), inhibitor proteolytických enzymů (elastázy,
kolagenázy) uvolňovaných při zánětlivé reakci. Hlavní podíl1-globulinové frakce.
 = akutní záněty a akutní závažné stavy, těhotenství
 = těžké hepatopatie, dědičný defekt tvorby API (důsledkem může být cirhóza jater, dále se rozvíjí plicní enfyzém)
Alfa1-kyselý glykoprotein (orosomukoid)
Jaterní glykoprotein, fyziologická funkce není známa. Koncentrace stoupá u akutních stavů, klesá při poruše
proteosyntézy v játrech.
 = akutní stavy
 = porucha proteosyntézy v játrech
Alfa1-fetoprotein
Tumorový marker, použití v prenatální diagnostice.Více v kapitole 16, na str. 16-6.
Alfa1-lipoprotein
Součást HDL2 a HDL3, v menší míře i HDL1 – viz např. Elektroforéza lipoproteinů, kapitola 11, Lipidy a lipoproteiny, str.
11-10.
Alfa1-mikroglobulin
Molekulová hmotnost 26 000. Při snížení glomerulární filtrace stoupá v séru. V moči se nalézá při tubulární
poruše (tubulární proteinurie)
 = snížení glomerulární filtrace (podobně ostatní mikroproteiny)
Alfa2-globuliny
Alfa2-makroglobulin
Molekulová hmotnost 820 000, inhibitor endoproteáz (trypsinu, chymotrypsinu, plazminu aj.)
 = nefrotický syndrom, chronické hepatopatie, v dětském věku
 = akutní pankreatitida
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-8
Haptoglobin
Jaterní glykoprotein složený ze čtyř řetězců (tetramer) dvou typů a několika variant. Pevně váže dimery
hemoglobinu, na které se hemoglobin rozpadá při degradaci a komplex je rychle vychytán buňkami RES
z krevního oběhu. Zabraňuje tvorbě nebezpečného hydroxylového radikálu.
 = akutní stavy
 = poruchy proteosyntézy v játrech, intravaskulární hemolýza (velmi nízké až nulové hodnoty haptoglobinu)
Ceruloplazmin
Protein s osmi atomy mědi v molekule. Účastní se transportu a skladování mědi. Svou činností zabraňuje
toxickému působení mědi (srovnej také odst. 12.2.1. na str. 12-11 v kapitole 12). Patří mezi pozitivní
reaktanty akutní fáze (str. 19-18). Vykazuje oxidázová aktivitu a tím zabraňuje vzniku nebezpečného
hydroxylového radikálu).
Ke vzniku volných hydroxylových radikálů vede např. tzv. Fentonova reakce:
H2O2 + Fe
2+ .
OH +
OH
+ Fe
3+
Role ceruloplazminu spočívá v tom, že katalyzuje oxidaci Fe
2+
na Fe
3+
a zmíněnou Fentonovu reakci tak inhibuje:
ceruloplazmin
Fe
2+
Fe
3+
Jak již bylo uvedeno v kapitole 12 (str. 12-2), bez této reakce se kationty železa nemohou navázat na apotransferin,
ceruloplasmin tak představuje důležitý prvek v transportu železa. Feroxidázovou aktivitu má i hephaestin (str. 12-1),
oba proteiny jsou si do značné míry podobné.
 = postupný nárůst v těhotenství
 = genetická porucha způsobující nedostatečnou tvorbu ceruloplasminu, tzv. hepatolentikulární degenerace (Wilsonova
choroba)
Ferritin
Zásobní bílkovina pro železo, nachází se v játrech, ve slezině, kostní dřeni a střevní sliznici (viz
metabolizmus železa v kapitole 8). Tumorový marker.
Proteiny transportující hormony
Např. transkortin přenášející kortizol, globulin vázající tyroxin (tj. thyroxin-binding globulin, TBG).
Beta-globuliny
Transferin
Jaterní 2-globulin, molekulová hmotnost 76 500, polypeptidický řetězec obsahuje dva oligosacharidové
řetězce zakončené kyselinou sialovou, rozlišují se formy asialo-, monosialo- až pentasialo-, nejhojnější je
forma tetrasialová, čili se čtyřmi molekulami kyeliny sialové. Transferin může vázat dva atomy železa (Fe
3+
),
transportní bílkovina pro železo.
 = nedostatek železa v organismu (při malnutrici nedojde ke zvýšení);
 = přebytek železa v organismu (hemosideróza, hemochromatóza, osteomyelofibróza aj.), porucha proteosyntézy
v játrech, akutní zátěž organismu
Bezsacharidový transferin – transferin se sníženým podílem cukerné složky (carbohydrate-deficient
transferin, CDT), nachází se u alkoholiků. V kombinaci s jinými markery (např. GMT) má dg význam jako
marker chronického abúzu alkoholu (zejména u mužů, diagnostická senzitivita u mužů je 83%, u žen 60%,
specifita u mužů 97%, u žen 88%).
Hemopexin
-globulin vázající hem, který se uvolňuje při degradaci hemoglobinu. Komplex je vychytáván jaterními
makrofágy a železo uskladněno ve formě feritinu nebo hemosiderinu pro další použití (viz metabolismus
železa v kapitole 8).
 = hemolytická anémie
 = akutní stavy
Složky komplementu C3 a C4
Komplement = 11 proteinů, patří k faktorům nespecifické humorální imunity (aktivuje se např. vazbou
antigenu a protilátky, výsledkem je lýza baktérií či jiných buněk)
 = akutní zátěž
 = tvorba imunokomplexů (např. autoimunitní choroby)
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-9
Beta-lipoprotein
Synonymum pro lipoprotein o nízké hustotě, LDL (více podrobností v kapitole 11, Lipidy)
Beta2-mikroglobulin
Mikroprotein, molekulová hmotnost 11 800, součást HLA systému na povrchu buněk, produkt myeloidních a
lymfoidních buněk, tumorový marker (odráží proliferaci buněk tohoto původu)
 = v moči – poruchy tubulu, v séru - pokles glomerulární filtrace
C-reaktivní protein (CRP)
C-reaktivní protein (CRP) je reaktantem akutní fáze (viz Kapitola 16, str. 16-
13)) s nejrychlejší a nejvýraznější reakcí ze všech bílkovin akutní fáze, zvl. u
bakteriálních infekcí. Název je odvozen ze skutečnosti, že precipituje Cpolysacharid
pneumokoků. Je syntetizován v játrech, podílí se na přirozené
imunitní odpovědi organismu. Má diskoidní stukturu tvořenou pěti stejnými,
nekovalentně vázanými, neglykosylovanými podjednotkami (bílkoviny
s podobnou strukturou tvoří tzv. rodinu pentraxinů).
 = akutní zánět, akutní stavy (revmatické choroby, malignity, stres, pooperační stavy
apod.)
Fibrinogen
Plazmatická bílkovina, molekulová hmotnost 340 000, při elektroforéze putuje mezi beta- a gama-globuliny.
Uplatňuje se při hemokoagulaci (viz hematologie); rizikový faktor aterosklerózy
 = akutní stavy (např. zánětlivé choroby pojiva)
 = těžké hepatopatie (nedostatečná syntéza), diseminovaná intravaskulární koagulopatie = DIC (zvýšená spotřeba)
Gama-globuliny
Největší podíl této frakce tvoří imunoglobuliny, protilátky,
tvořené buňkami lymforetikulárního systému (proliferujícími
buněčnými klony B lymfocytové řady, které byly antigenně
aktivovány na úrovni imunokompetentních B lymfocytů).
Imunoglobuliny při elektroforéze však zasahují až do frakce
beta a zčásti i do frakce alfa2.
IgG
Tvoří největší podíl plazmatických imunoglobulinů. Odpověď
na rozpustné antigeny (toxiny a produkty lýzy bakterií),
procházejí fetoplacentární bariérou a novorozenec má vysokou
hladinu IgG. Ta klesá, nejnižší je mezi 3. - 6. měsícem. Vlastní
tvorba IgG začíná již před narozením dítěte.
IgA
Vyskytují se v plazmě jako monomer, na povrchu sliznic (GIT, spojivky, dýchací cesty) jako dimer,
neprocházejí fetoplacentární bariérou, ochrana sliznic před bakteriální infekcí.
IgM
V plazmě jsou ve formě pentameru, molekulová hmotnost 970
000, rychlá reakce na bakteriální a virovou infekci (později je
jejich tvorba vystřídána tvorbou IgG protilátek).
IgD
Nachází se jako membránový protein (spolu s IgM)
v membránách zralých B-lymfocytů. Ve velmi omezeném
množství existuje i ve vylučované formě (monomer) a lze ho
nalézt ve velmi nízkých koncentracích v krevním séru. Jeho
funkcí je (pravděpodobně) předat signál B-lymfocytům, aby se
aktivovaly, čímž se stanou připraveny zaujmout své místo
v imunitním systému při obraně organismu.
IgE
Tzv. reagíny u alergiků, reagují s alergeny, přitom se uvolňují
mediátory alergické reakce z mastocytů (např. histamin).
Molekula CRP
Obecné schéma imunoglobulinu
(podrobnější popis i obrázek dále v textu)
Molekula imunoglobulinu M
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-10
Klinické poznámky. Stavy s nadbytkem a nedostatkem imunoglobulinů
 = hypoimunoglobulinémie: fyziologicky u novorozenců a kojenců, dědičné poruchy syntézy všech tříd =
agamaglobulinémie (důsledkem jsou těžké bakteriální infekce), nebo jen některých = dysgamaglobulinémie (u
některých typů se vyskytuje porucha buněčné imunity)
 = hyperimunoglobulinémie: polyklonální, vznikají protilátky různých typů, na elektroforeogramu široký pruh v oblasti
gama-globulinů (chronické záněty, chronická hepatopatie, automimunitní choroby); monoklonální, tvoří se jediný
typ Ig, úzký pruh na elektroforeogramu (viz dál paraproteiny)
Monoklonální imunoglobuliny (paraproteiny) jsou produktem jednoho klonu (kmene) proliferujících
buněk B-lymfocytové řady. Jejich molekula je tvořena těžkými řetězci pouze jedné třídy (případně podtřídy)
a lehkými řetězci jednoho antigenního typu. Paraproteiny jsou obvykle složeny z kompletních molekul a
nacházejí se v pořadí, v jakém jsou koncentračně v krvi zastoupeny jednotlivé imunoglobuliny, tj. IgG, IgA,
IgM, IgD a IgE. Paraproteiny lze prokázat i v moči, konkrétně lehké řetězce, které vzhledem ke své velikosti
do moči volně přecházejí a jsou za normálních okolností reabsorbovány. Jiné názvy pro tyto proteiny jsou
myelomové proteiny nebo M-proteiny, M-komponenty, M-gradienty, M-Ig. Jsou-li tyto proteiny zjištěny
v krevním séru/plazmě jedná se o monoklonální gamapatii (monoklonální hypergamaglobulinemii.
Některé paraproteiny jsou tvořeny z nekompletních molekul monoklonálních imunoglobulinů. Tvoří je volné
lehké řetězce (FLC, Free Light Chains) kappa nebo lambda. Příkladem je Bence-Jonesova bílkovina.
Vyskytují se i paraproteiny s nekompletní molekulou tvořené pouze těžkými řetězci (Franklinova choroba).
Monoklonální gamapatie se dělí na primární a sekundární. Primární monoklonální gamapatie mají svůj
původ v autonomní transformaci a proliferaci (novotvoření, bujení, chorobný růst) plazmatických buněk,
sekundární jsou způsobeny autoimunními, infekčními, metabolickými a toxickými onemocněními.
Nejčastější formou monoklonální gamapatie je tzv. monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS,
monoclonal gammopathy of undetermined significance). Jde o němý, bezpříznakový stav, při kterém nejsou
splěna diagnostická kritéria žádného zhoubného onemocnění spojeného s monoklonální gamapatií, ale
paraprotein je přítomen. U zdravých jedinců ve věku <50 roků se vyskytuje se poměrně řídce (1-3%), ve
starším věku se, díky poklesu imunitní kontroly, jeho frekvence výskytu zvyšuje, ve věku >75 let až na 3 -
10%, po 85. roce života se incidence pohybuje mezi 8 – 15%. Vskytuje se v různém procentu i u různých
etnických skupin, u některých s narůstajícím věkem se nemění (u afroameričanů) V současné době je
výskyt monoklonální gamapatie považován za významný premaligní marker, protože u 20 – 25% nosičů
paraproteinu dojde po 1 až více létech k malignímu zvratu. Výskyt paraproteinu v podstatě signalizuje
nekoordinovanou proteosyntézu. Poznatky s poslední doby nasvědčují tomu, že transformací MGUS
praděpodobně vznikají všechny případy mnohočetného myelomu, že neexistuje mnohočetný myelom bez
předchozí fáze MGUS. Jedním z ukazatelů rizika progrese MGUS do malignity je hodnota faktoru FLCr
(Free Light Chains ratio), což je poměr volných řetězců /(kappa/lambda).
Klasickými metodami vyšetřování monoklonálních gamapatií je vedle
standardní elektroforézy také elektroforéza imunofixační a turbidimetrické
či nefelometrické vyšetření sérových hladin volných lehkých řetězců.
Novou analytickou metodou v diagnostice a hodnocení průběhu monoklonálních
gamapatií je HEVYLITE METODA (HLC – Heavy Light Chain, čili těžké a lehké řetězce).
V metodě se využívají protilátky specifické proti junkčním („pantovým“) epitopům
umístěným mezi konstantními doménami těžkých a lehkých řetězců molekul
imunoglobulinu. Tyto protilátky umožňují separátní rozpoznání a kvantifikaci lehkých
řetězců  a. Stupeň klonality se obecně určuje z poměru/indexu /. Hevylite v rámci
jedné třídy imunoglobulinů (např. IgG) umožňuje separátní kvantitativní vyhodnocení
(např. IgG a IgGcož dává podobné možnosti jako výše uvedený index.
Příklad souprav na vyšetřování FLC (Free Light Chains = volné lehké řetězce): N Latex FLC
kappa a N Latex FLC lambda Assays pro stanovení lehkých řetězců na automatických
imunonefelometrických systémech fy Siemens.
Poznámka I: Pojem „paraprotein“ použil poprvé K. Apitz v roce 1940, který považoval
úzký pruh v elektroforeogramu sér lidí s monohočeným myelomem za patologickou
bílkovinu, což samozřejmě není pravda, a proto se vedou spory o používání tohoto pojmu.
Nicméně v laboratořích je pojem paraprotein zažitý a používá se.
Poznámka II: Od roku 2009 je stanovení volných lehkých řetězců oficiálně doporučenou
částí screeningového panelu pro mnohočetný myelom.
Polyklonální gamapatie. Pokud je antigenním podnětem aktivováno více
klonů plazmatických buněk, dochází ke zvýšení koncentrace
imunoglobulinů příslušejících více třídám, pak se hovoří o polyklonální
gamapatii (polyklonální hypergamaglobulinemii).
Zájemce o více podrobností z problematiky paraproteinů odkazuji na výbornou monografii
profesora Tichého: Tichý, M., Laboratorní analýzy monoklonálních imunoglobulinů
(paraproteinů), FINIDR, s.r.o., Český Těšín, 1997
Elektroforéza séra
v agarosovém gelu (HYDRAGEL)
s nálezem paraproteinu.
Dvě pacientská séra dělená
v duplikátu. Sérum v pozicích 3 a
4 má výrazný paraprotein (IgA
s hodnotou 58g/l), viz šipka.
(Autentický elektroforeogram
z rutinního provozu OKB).
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-11
13.2. Imunochemické metody stanovení bílkovin
Imunochemické metody jsou moderní vysoce citlivé a specifické metody, vhodné pro stanovení jednotlivých
bílkovin krevní plazmy. Principem je reakce mezi antigenem a specifickou protilátkou.
Poznámka: Pojem „imunoglobulíny“ byl vymezen na zasedání komese expertů WHO v Praze v roce 1964, kdy byly definovány jako
„živočišné glykoproeiny s určitou protilátkovou aktivitou: patří k nim i skladebné součásti imunoglobulinů a monoklonální
imunoglobuliny“.
13.2.1. Úvod
Antigen (imunogen, kompletní antigen): Vysokomolekulární látka (protein, polysacharid, lipoprotein,
lipopolysacharid, glykoprotein; mikroorganismy; viry; apod.) mající ve své molekule několik vazebných míst
pro navázání protilátky (tzv. epitopů) a je schopna vyvolat tvorbu protilátek. Antigeny vyvolávají imunitní
odpověď v reaktivním organismu, namířenou specificky proti použitému antigenu. Nejlepší antigenní
vlastnosti mají bílkoviny.
Pro zvídavé studenty: v literatuře se lze s pojmem antigen setkat v poněkud odlišných významech
 Jednak jako s výrazem pro sloučeniny, které sice reagují s protilátkami, ale samy nejsou imunogenní. V tomto případě se pro
látky, které mohou vyvolat imunitní odpověď (buněčnou, humorální, nejčastěji obě), užívá výraz imunogen. Pak platí, že je
každý imunogen antigenem, ale opačně to neplatí.
 Moderní prameny mluví zcela opačně, tj. pojem imunogen se vůbec nepoužívá a používá se výraz antigen v původním
významu, tedy jako označení pro látku schopnou vyvolat imunitní odpověď organizmu (a reagovat s protilátkou).
Epitop: část molekuly antigenu (5 - 8 aminokyselin nebo monosacharidových jednotek vyskytujících se u
sebe), která se účastní vlastní reakce s protilátkou; tato část (makro)molekuly se váže ve vazebném místě
protilátky nebo na buněčný receptor
buněk T; dříve se nazývala "antigenní
determinanta"; epitopů může být v
molekule imunogenu několik, např. na
molekule vaječného albuminu se jich
nachází 5, na molekule thyroglobulinu
se nachází 40 epitopů.
Hapten (nekompletní antigen):
Jakákoliv nízkomolekulární látka, která
nemůže vyvolat tvorbu protilátek, ale
která s produkty imunitní odpovědi
může specificky reagovat. Sama o sobě
nemůže vyvolat tvorbu protilátek, ale
může „vysytit“ vazebné oblasti protilátek
a tím zabránit reakci antigen-protilátka.
Protilátky: Imunoglobuliny, které se
dělí do 5 tříd: IgG, IgA, IgM, IgD a IgE.
Všechny imunoglobuliny obsahují dvě
dvojice polypeptidových řetězců, které
jsou v molekule uspořádány symetricky,
molekula protilátky má tvar písmene Y viz
obrázek: oblast Fab obsahuje
vazebná místa, která se liší u různých
protilátek. Oblast Fc je konstantní částí
řetězce v rámci protilátkové třídy.
Rozlišují se řetězce lehké (L, od light =
lehký) a těžké (H, od heavy = těžký).
Existuje pět variant těžkých řetězců
označených  - odtud pět
tříd imunoglobulinů (tj. G, A, M, D, E,
viz výš) a dvě varianty lehkých řetězců
označených  - podle nich se řadí
protilátky do dvou antigenních typů K a
L. V imunoglobulinech jsou seskupeny
vždy dva lehké a dva těžké řetězce.
Podle dalších odlišností ve struktuře
jednotlivých řetězců lze rozlišovat ještě
podtřídy a podtypy imunoglobulinů. Všechny imunoglobuliny obsahují cukernou složku, jsou to tedy
glykoproteiny.
VH1
Vazba Ag
CH1
CH2
CH3
VL
CL
Cukerná složka
CH2
CH3
CH1
VH1
VL
CL
Cukerná složka
Vazba Ag
Pantová (hinge) oblast
Fab
Fc
Disulfidická vazba
H = těžký (heavy)
L = lehký (light)
C = konstantní část
V = variabilní část
Těžký řetězec je vyznačen modře
Lehký řetězec je vyznačen zeleně
Cukry jsou vyznačeny červeně
Disulfidické vazby jsou vyznačeny žlutě
Vazebná místa pro antigen jsou vyznačena
červenými šipkami
Schéma molekuly IgG
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-12
Antiséra: Jsou to séra s obsahem specifických protilátek proti příslušnému antigenu. Připravují se
imunizací zvířat opakovaným parenterálním (mimo trávicí trubici,
např. injekčně) podáváním antigenu.
Komerční séra proti lidským sérovým bílkovinám („antihumánní
séra“) bývají monovalentní (obsahují jednu protilátku proti
konkrétní sledované bílkovině) a polyvalentní (obsahují protilátky
proti mnoha bílkovinám).
Protilátky mohou být
 monoklonální, tzn., že pocházejí z jednoho klonu buněk,
vyráběné metodami genetického inženýrství (viz str. 10-
12). Molekuly protilátek jsou stejné struktury bez variant,
tvoří je jedna třída řetězců H a jeden typ řetězců L. Jsou
vysoce specifické pro jeden epitop na multivalentním
antigenu.
 polyklonální (produkt více klonů buněk) tvoří směs protilátek
reagujících se stejným antigenem, ale s různými epitopy
V laboratorní praxi se používají k detekci antigenů jak monoklonální, tak polyklonální protilátky, přičemž oba
typy mají své přednosti v konkrétních aplikacích.
Pokud se jedná o detekci protilátek v séru pacienta, pravděpodobně půjde o polyklonální protilátky
produkované imunitním systémem pacienta.
Komplex multivalentního
(polyvalentního) antigenu
Monoklonální protilátky
+
Komplex antigen-protilátka
+
Komplex multivalentního
(polyvalentního) antigenu
Polyklonální protilátky
Komplex antigen-protilátka
Reakce multivalentního antigenu (s více epitopy) s polyklonální protilátkou
Mnohočetná specifita polyklonálních protilátek k více epitopům jednoho antigenu
Reakce multivalentního antigenu (s více epitopy) s monoklonální protilátkou
Specifita monoklonálních protilátky k jednomu epitopu
Skutečnému tvaru molekuly IgG asi
lépe odpovídá tento náčrtek
Skutečnému tvaru molekuly IgG asi
lépe odpovídá tento náčrtek.
(Vymezte si sami na něm příslušné oblasti)
CukryCukry
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-13
Monoklonální protilátky se liší od polyklonálních protilátek vysokou specifitou k jednomu epitopu na
multivalentním antigenu, jak je ukázáno na obrázku výš. Jsou produkovány jednou buněčnou linií a
buněčnými liniemi myších myelomů, za využití hybridizační technologie (hybridoma technology).
Hybridomy (hybridomas) jsou nádorové (tumorové) buňky produkující protilátky v mnoha kopiích identické
molekuly protilátky a snadno rostoucí v podmínkách laboratorních buněčných kultur.
Postup přípravy monoklonálních protilátek (pro zvídavé studenty)
Celý postup sestává z několika kroků:
Vpravení specifického antigenu do
hostitelského organismu (myš); B-buňky
začnou (po omezenou dobu) produkovat
příslušnou protilátku
Izolace B-buněk (z myší sleziny)
Spojení (fúze) B-buněk se specifickým
typem tumorových buněk, které se
neustále dělí (snadno rostou v tkáňové
kultuře), ale neprodukují protilátky; po
fúzi začnou protilátky produkovat
Izolace a klonování úspěšných hybridů
(fúzované buňky), které produkují
protilátky se specifitou proti
uvažovanému antigenu (a v tkáňové
kultuře se množí)
Udržování hybridních tumorů v myším
organismu.
Kultivace vybraných klonů, jejich zmražení
a čištění monoklonálních protilátek.
Reakce mezi antigenem a protilátkou: Slouží ke kvalitativní a kvantitativní detekci antigenů a protilátek.
Jedná se o reakci rozpustného antigenu a rozpustné protilátky.
Výsledkem reakce mezi antigenem a protilátkou může být zákal, vazba bez změny koloidního stavu
(senzibilizace), aglutinace a (imuno)precipitace.
Aglutinace: Antigen se při setkání se specifickou protilátkou shlukuje v dobře viditelné vločky nebo zrníčka
(tzv. aglutinát). Aglutinát je tvořen hlavně antigenem.
Precipitace: Antigen tvoří s protilátkou komplexy, které po dosažení větších rozměrů vypadnou z roztoku
(precipitují). Precipitát je tvořen především imunoglobulínem (protilátkou). Množství precipitátu je závislé na
kvantitativním poměru antigenů a protilátek – existuje optimální koncentrace, kdy se tvoří precipitát, a mimo
kterou dochází k rozpouštění (resp. netvoření) precipitátu (podrobnosti viz dále v textu).
Imunoprecipitační reakce má svá úskalí – precipitát se tvoří při optimálním množství obou komponent –
antigenu a protilátky. Při nadbytku některé z těchto složek se při určité koncentraci začne precipitát
rozpouštět (hook efekt = efekt prohnutí křivky do háku;hook = hák; prozon efekt). Závislost tvorby precipitátu
na vzrůstající koncentraci (např.) antigenu při neměnném množství (v tomto případě) protilátky vyjadřuje tzv.
imunoprecipitační křivka, známá také pod pojmem Heldebergerova křivka. Jak je zřejmé z grafu na
následující straně, na kterém je imunoprecipitační křivka znázorněna, po vzrůstajícím nárůstu tvorby
precipitátu dojde ke stagnaci jeho tvorby a posléze k rozpouštění precipitátu.
Obrázek je převzat (a přizpůsoben)
z edukačního materiálu firmy ABBOTT
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-14
Měřicí oblast, tzn. rozsah koncentrací, které je možno bezproblémově měřit, je vymezena hodnotami
kalibračních roztoků. Odpovídá jí víceméně) lineární část na vzrůstající straně grafu (viz obrázek). Je to část
nacházející se v oblasti nadbytku protilátky. Koncentracím antigenu v této části křivky přísluší určitá oblast
hodnot signálu. Následuje zóna ekvivalence, tzn. optimálních koncentrací protilátky a antigenu a posléze
oblast nadbytku antigenu. Koncentrace antigenu, při níž začíná oblast nadbytku antigenu (tj. bod na křivce
odpovídající poslednímu bodu měřicí oblasti) se nazývá kritický bod.
Měřicí oblast: koncentrace antigenu, které lze bez problémů změřit; dolní a horní limit měřicí oblasti
odpovídají nejnižším a nejvyšším kalibračním koncentracím (rozsahu kalibrační křivky).
Bezpečná oblast: přesáhne-li hodnota signálu horní mez měřicí oblasti je zřejmé, že koncentrace
stanovované bílkoviny (antigenu) je vyšší, než horní limit měřicí oblasti a vzorek je nutno naředit
(automaticky nebo manuálně) tak, aby se koncentrace stanovovaného antigenu pohybovala v měřicí oblasti.
Maximální koncentrace antigenu, kterou lze takto zachytit, je koncentrace označená na schématu jako CKb,
tedy koncentrace antigenu v kritickém bodu.
Vzorkům s vyšší koncentrací antigenu než je koncentrace v kritickém bodu, odpovídají hodnoty signálu
v měřicí oblasti. Jedné hodnotě signálu, tak odpovídají dvě hodnoty koncentrace antigenu: nízká, v měřicí
oblasti, a vysoká, mimo měřicí oblast. Může se tedy stát, že dojde (na základě nízké hodnoty signálu)
k mylnému odečtení nízké koncentrace, zatímco se jedná o vysokou koncentraci antigenu s následným
rozpouštěním precipitátu, tedy k vydání falešně nízkého nálezu místo nálezu vysoce pozitivního. Kritický
bod je proto nutno při zavádění metody důkladně ošetřit, tzn., je třeba provést taková analytická opatření,
aby k těmto omylům nedocházelo. Automatický analyzátor většinou disponuje možností sledovat u
homogenních zákalových metod (str. 10-20) tzv. prozon efekt, tj. pokles hodnoty signálu (turbidance)
v čase. Při nadbytku antigenu se totiž precipitát rychle vytvoří, ale postupně se začne rozpouštět, tak, jak to
odpovídá koncentracím podle imunoprecipitační křivky. Hodnota signálu klesá a při správném nastavení
analyzátoru je tato skutečnost zachycena. Analyzátor vydá varovné znamení (flag) a je-li tak nastaven,
měření zopakuje s menším množstvím vzorku nebo s naředěným vzorkem, nebo laborantka manuálně
vzorek naředí a analýzu zopakuje.
Prozon efektu u vazebných testů (str. 10-22) se jejich konstruktéři brání např. dvoustupňovým uspořádáním
(dvoustupňovým formátem) metody, kde se využívají promývací kroky k odstranění nadbytečného antigenu.
Imunoprecipitační reakce může obecně probíhat v gelovém prostředí nebo v roztoku. Ještě v nedávné době
reakce v gelovém prostředí tvořila základ většiny specifických metod stanovení jednotlivých proteinů. Dnes
má (pro rutinní praxi běžného biochemického oddělení) větší význam reakce v roztoku, i když metody
založené na reakci v gelovém prostředí opuštěny nebyly – lze jejich pomocí stanovit nižší hladiny bílkovin
než reakcí v roztoku a na specializovných pracovištích jsou využívány.
Zakřivení (hook) způsobené
nadbytkem antigenu
Nadbytek AgNadbytek Pl
Bezpečná oblast
Kritický bod
Ckb
Měřicí oblast
(v tomto rozsahu koncentrací antigenu odpovídá
nárůstu koncentrace nárůst hodnoty signálu)
Signál
Koncentrace Ag
Oblast ekvivalence
Hodnota signálu
odpovídající měřicí
oblasti
Hodnota signálu nad
horním limitem
měřicí oblasti
Této oblasti koncentrací odpovídá
hodnota signálu pro koncentrace
antigenu nižší
Podle hodnoty signálu víme,
že koncentrace antigenu je
vyšší, než přísluší měřicí
oblasti. Primární vzorek je
třeba naředit, aby se
koncentrace antigenu dostala
do měřicí oblasti
Heldebergerova křivka
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-15
13.2.2. Imunoprecipitační reakce v gelovém prostředí
Obrazový materiálu v tomto odstavci označený (UP) byl převzato zs WEB Univerzity Palackého, Biochemického oddělení, oboru
molekulární biochemie, http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/BAM/Imunometody.pdf
Princip: Antigen a protilátka difundují do gelového prostředí (kterým je nejčastěji agarózový gel) různou
rychlostí. Rychlost difúze závisí na koncentracích antigenu a protilátky, jejich fyzikálně chemických
vlastnostech a na struktuře a vlastnostech gelového prostředí. V místě optimální koncentrace vytvoří
precipitační oblouk, který se pro lepší zviditelnění barví.
Imunodifúze dvojitá: do gelu difundují obě složky; princip kvalitativních metod, kdy se pomocí různých
protilátek pátrá po povaze stanovované bílkoviny (antigenu).
Metody založené na dvojité imunodifúzi (kvalitativní metody)
 dvojitá radiální imunodifúze (podle Ouchterlonyho)
 imunoelektroforéza (Grabar a Williams)
 protisměrná imunoelektroforéza
Imunodifúze jednoduchá: do gelu difunduje pouze jedna složka (obvykle antigen), druhá je obsažena v
gelu; princip kvantitativních metod, kdy se stanovuje množství známe bílkoviny (v gelu je protilátka proti
konkrétní bílkovině).
Metody založené na jednoduché imunodifúzi (kvantitativní metody)
 jednoduchá lineární imunodifúze
- ve zkumavce (Oudin)
- v kapiláře (Oudin, modifikace Hitzig a Schwick)
- v kapiláře v elektrickém poli (imunoelektromigrace)
 jednoduchá radiální imunodifúze (Manciniová)
 elektroimunodifúze neboli raketová imunoelektroforéza a její varianty (Laurell)
 kvantitativní překračující imunoelektroforéza čili tandemová technika (KrØll)
 dvourozměrná překračující neboli křížová imunoelekfroforéza (Clarke a Freeman)
Na tomto zobrazení Heldebergerovy křivky je znázorněn mechanismus tvorby precipitátu a jeho rozpouštění
v oblasti přebytku antigenu. Obrázek převzat z edukačního materiálu fy Abbott Learning Protein
Měřicí zóna Zóna ekvivalence Zóna přebytku antigenu
Nárůst hladiny antigenu
Kritický bod
Heldebergerova křivka ještě jednou
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-16
Stručné popisy jednotlivých metod
Dvojitá radiální imunodifúze podle Ouchterlonyho
Na podložní sklíčko čtvercového tvaru se nalije gel (agarový,
agarózový). Do středu se vyhloubí centrální jamka (CJ) a kolem ní
jamky periferní. Do centrální jamky se umístí protilátka proti
sledovanému antigenu a do periferních jamek antigen (vzorek). Obě
složky difundují do gelu (kruhově čili radiálně kolem jamek) a v místě
střetu s optimální koncentrací antigenu a protilátky se vytvoří
precipitační proužek.
Vysvětlivka: Šipka na obr. ukazuje pozitivní precipitaci = precipitační proužek
Se simulací procesu je možno si pohrát
zde.
.
dvojitá
kvalitativní
Imunodifúze
Jednoduchá
kvantitativní
Dvojitá radiální imunodifúze
Imunoelektroforéza
Protisměrná imunoelektroforéza
Jednoduchá lineární
Ve zkumavce
V kapiláře
V kapiláře v el. poli
Jednoduchá radiální imunodifúze
Elektroimunodifúze
Tandemová technika
Křížová imunoelektroforéza
Metody založené na imunoprecipitační reakci v gelovém prostředí
CJ
Na fotografiích jsou vidět reakce
vzorků/sé.
Detail obrázku vpravo ukazuje
identickou precipitaci v jamkách č.
4 a č. 6 proti hovězímu albuminu
v centrální jamce
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-17
Imunoelektroforéza
Kombinace elektroforézy v agarovém gelu a dvojité imunodifúze. Po proběhlé elektroforéze se podél dělicí
dráhy vyhloubí jamka ve formě proužku a naplní se polyvalentním sérem. Rozdělené frakce bílkovin
difundují, rovněž tak polyvalentní sérum. V místě střetu s optimálními koncentracemi antigenu a protilátky se
vytvoří precipitační proužek. Na následujícím obrázku je v části a) znázorněna agarová elektroforéza:
putování frakcí jak zásluhou elektrického pole, tak elektroendoosmózy, dále difúze jednotlivých frakcí, difúze
polyvalentního séra a nakonec tvorba precipitačních obloučků. V části b) jsou fotografie výsledků po
vizualizaci imunoelektroforézy
Imunofixace
Elektroforéza se často kombinuje s tzv. imunofixací - po elektroforetickém rozdělení je na gel s rozdělenými
frakcemi bílkovin aplikováno příslušné antisérum. Je-li přítomen antigen, vytvoří se na místě, kde se
nachází, precipitát, který se následně barví. Precipitát je „fixován“ v gelu a ostatní proteiny lze z gelu vymýt.
Používají se séra polyvalentní, monovalentní, případně specifická proti jednotlivým typům řetězců, takže je
možno bílkoviny přesně identifikovat
IgG
Na vedlejším schématu
elektroforeogramu bylo „použito“
monovalentní antisérum proti IgG
Jamka/korýtko
pro polyvalentní
antisérum
-+
Pomůcka k obrázku:
single Ag = jeden antigen 2 Ags = dva antigeny
wells with identical Abs = jamky se stejnými protilátkami
wells with different Abs = jamky s rozdílnými protilátkami
LINES OF IDENTITY = precipitační linie značící identitu
LINES OF NON-IDENTITY = precipitační linie značící
neidentitu
LINES OF PARTIAL IDENTITY = precipitační linie značící
částečnou identitu antigenů
Ag with 2 epitopes = antigen se dvěma epitopy
wells with identical Abs + 1 well with Ab specific for 2nd
epitope = jamky se stejnými protilátkami + 1 jamka
s protilátkou specifickou pro druhý epitop
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-18
Western blotting (přenos)
Je variantou imunofixace. Ne vždy lze přímo aplikovat antisérum (protilátku) na dělicí gel buď z technických
důvodů (např. to nelze aplikovat na polyakrylamidový gel, který denaturuje bílkoviny), či proto, že antigenu
na vytvoření precipitátu je málo. V těchto případech se přenese příslušný protein z dělicího media na
pevnou fázi, kde je fixován buď kovalentními vazbami (pevnou fází je papír aktivovaný cyanogen bromidem
nebo m-nitrobenzoyloxymethylbromidem) nebo adsorpčními silami (nitrocelulózový papír nebo membrány
na bázi nylonu). Přenos se děje kapilárními silami pomocí savého papíru, případně elektroforeticky. Pevná
fáze se potom inkubuje s příslušnou protilátkou, značenou enzymem nebo radioizotopem. Citlivost těchto
metod je 10 – 100x vyšší než při prosté imunofixaci se stanovením proteinu.
Poznámka: „blot“, angl. znamená skvrnu, ale také vysátí (savým
papírem), čili název „blotting“ je jasný. Pojem „western“ tj. „západní“
je slovní hříčkou: prakticky totožnou metodu pro fixaci a vizualizaci
DNA, vymyslel sir Edwin Mellor Southern (na obrázku), který rozvinul i
technologie DNA mikroarrayí a za svůj přínos v medicínském výzkumu
obdržel prestižní ocenění Alberta Laskera. „Southern“ je česky „jižní“,
takže příbuzné techniky byly postupně pojmenovávány podle
světových stran. „Nothern“ (severní) přenos (blotting) je určen pro
studium genových expresí pomocí detekce RNA, „eastern“ blotting se
používá k analýze posttranslačních modifikací a k detekci
karbohydrátových epitopů, „southwestern“ (jihozápadní) blotting je
kombinací „southern“ a „western“ přenosu a užívá se k charakterizaci
proteinů vázejících DNA. Srovnej též text v kapitole 20, str. 20-13.
-
+
Polyakrylamidový gel
Nitrocelulosa
Savý papír
Podložky
Směr
přenosu
Savý papír
močsérum
Schéma uspořádání při Western blotting
Zdvojená fólie Hydragel pro imunofixaci.
Sérum 1: monoklonální gamapatie IgA kappa.
Sérum 2: biklonální gamapatie IgG kappa a IgM kappa.
Edwin Mellor Southern
Imunofixace- pokračování
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-19
Protisměrná imunoelektroforéza
V gelu na podložním sklíčku se vyhloubí řady jamek. Vždy do řady blíže katodě se umístí antigen (vzorek),
do řady blíže anodě se umístí protilátka. Vlivem
elektroendosmózy putují protilátky v agarovém
(agarózovém) gelu ke katodě, antigeny (pokud jsou
přítomny) putují „normálně“ k anodě. V místě střetu
s optimálními koncentracemi antigenu a protilátky se vytvoří
precipitační proužek.
Jednoduchá radiální imunodifúze
Do gelu se při jeho přípravě přidá specifická protilátka (monovalentní
antisérum) proti stanovované bílkovině (antigenu). Do gelu na
podložním sklíčku se vyhloubí řady jamek. Do první řady se umístí
antigen o vzrůstající koncentraci (kalibrační křivka), do ostatních se
umístí vzorky. Bílkoviny (radiálně) difundují kolem jamek za tvorby
precipitační zóny (na obrázku vlevo jsou znázorněny pouze jamky,
precipitační zóny ne, ty jsou znázorněny na schématu níž). Velikost
zóny, přesněji čtverec jejího průměru (D), je úměrný koncentraci
antigenu. Závislost D
2
na koncentraci antigenu (kalibrační graf) se
získá z hodnot naměřených v první řadě se známými koncentracemi
stanovovaného antigenu
Postup při jednoduché radiální imunodifúzi
+ O O O O O O O O Pl
Pl O O O O O O O O Ag
O O O O O O O O Pl
O O O O O O O O Ag
Ag O O O O O O O O Pl
- O O O O O O O O Ag
PK
O O O O O O
O O O O O O
O O O O O O
O O O O O O
O O O O O O
Pomůcka k obrázku
Reagencie – agarový gel s obsahem anti-IgG
1. do jamek se nepipetují vzorky
séra (sample A a B) a
standardní roztoky (200 – 1600
mg/dl)
2. ponechá se čas difusi molekul
IgG do gelu
3. v místech optimální
koncentrace IgG:anti-IgG se
tvoří precipitační prstence
4. měření průměru (D) prstenců
(D je úměrné koncentraci IgG
ve vzorku)
Vysvětlivky:
Pl = protilátka
Ag = antigen, šipky znázorňují směr putování
příslušné bílkoviny
PK = pozitivní kontrola, vodorovná čárka znázorňuje
precipitační linii u pozitivní kontroly (ve skutečnosti se
jedná spíše o oblouček
Kalibrační řada
Vzorky pacientů
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-20
Elektroimunodifúze
(přesněji elektromimunoprecipitace) čili raketová (raketková) technika (podle Laurella)
Kombinace jednoduché radiální imunodifúze s elektroforézou (ta
slouží k urychlení imunoprecipitace).
V gelu je přítomna protilátka, v gelu vlivem elektrického
stejnosměrného napětí putuje antigen. Tvoří se komplex antigenprotilátka,
putujícího antigenu je však přebytek, takže dochází
k soustavnému rozpouštění tohoto komplexu až do okamžiku, kdy
je veškerý antigen vyvázán specifickou protilátkou. Výsledkem je
obraz ve tvaru raketky (kosmické). Raketky mají velikost podle
koncentrace příslušného antigenu ve vzorku.
Kalibrace se provádí podobně jako u jednoduché radiální
imunodifúze pomocí známých koncentrací stanovovaného
antigenu (několik jamek – obvykle 5 – slouží pro kalibraci, ostatní
pro vzorky, na obrázku vlevo možný příklad kalibrace)
(UP)
Dvojrozměrná čili tzv. křížová neboli překračující imunoelektroforéza
Kombinace elektroforézy v agarovém gelu s elektroimunoprecipitací, čili aplikace raketkové techniky na
sérum předem frakcionované pomocí elektroforézy.
Stručný postup je následující:
1. bílkoviny se podrobí elektroforéze (1.ELFO)
2. poté se část gelu podél dělicí dráhy odřízne, odstraní a nahradí se agarózovým gelem s polyvalentním
antisérem
3. nechá se proběhnout další elektroforéza (2.ELFO, kolmo na původní směr, do gelu migrují protilátky a další
postup je prakticky totožný s raketkovou technikou)
Moderní 2D (dvourozměrná, two dimensional) elektroforéza je kombinací izoelektrické fokusace (jednotlivé
frakce přestávají putovat v místě svého izoelektrického bodu v pufru s gradientem pH) a polyakrylamidové
(PAGE), kdy dochází k dělení podle velikosti náboje a částečně i velikosti molekuly).
13.2.3. Imunoprecipitační reakce v roztoku
Princip: Zředěný roztok antigenu reaguje s vhodně zředěnou protilátkou za tvorby zákalu
(imunoprecipitátu). Reakce se vyhodnocuje turbidimetricky nebo nefelometricky (existuje řada speciálních
fotometrů a nefelometrů zkonstruovaných právě k tomuto účelu). Jedná se o velmi moderní metody vhodné
i k automatizaci.
Zde se gel odřízne
Tato část gelu se odstraní
1. ELFO: zde probíhá první dělení vzorku
Směr dělení
2. ELFO: nově přiložený
gel, který obsahuje
polyvalentní
antisérum
Nový směr dělení (otočen o
90°proti původnímu směru)
Gel s původním dělením
bílkovin (první ELFO)
+
+
-
-
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-21
Turbidimetrie
Reakčním prostředím je pufr s obsahem
polyethylenglykolu (PEG), který podporuje
tvorbu suspenze (zákalu). Používají se
protilátky různých výrobců (Dako, Orion aj.).
Podle použitého pufru a protilátky se aplikují
metody na jednotlivé přístroje. Závislost
turbidance na koncentraci stanovované
bílkoviny je obecně nelineární a kalibrace
vyžaduje řadu standardů, většinou pěti.
Vzhledem k mnoha okolnostem ovlivňujícím
imunoprecipitační reakci, je zavádění metod
obtížné, vlastní využití již zavedené metody
je však obvykle snadnou a rutinní záležitostí.
PETIA
Další uspořádání (PETINIA) přináší opačný výsledek, zeslabení turbidance. Stanovované molekuly, příliš
malé na to, aby samy o sobě mohly s protilátkami tvořit nerozpustné komplexy, lze „upevnit“ na mikročástice
(particles), zvětšit tímto způsobem jejich velikost a „posílit“ (enhance) tak metodu (jak vysvitne z dalšího
textu, v daném případě inhibici turbidimetrického stanovení (turbidimetric inhibition immunoassay; schéma
na str. 13-22)). Mikročástice „potažené“ malými molekulami (analytem) tvoří s protilátkami zesíťované,
nerozpustné komplexy. Je-li však ve vzorku pacienta přítomen analyt, soupeří tento s analytem na
mikročásticích o vazebné místo na protilátce, a protože sám není schopen tvorby komplexů, ruší (inhibuje)
tuto tvorbu. Výsledná turbidita je mnohem nižší, než by byla bez volného analytu. Toto uspořádání je typické
pro stanovení léků.
Na podobném principu jako PENIA je založeno stanovení Particle Enhanced Nephelometric Immuno
Assay (PENIA).
Turbidimetrické imunometody mají svá omezení, především směrem k nízkým, ale i vysokým koncentracím
stanovované bílkoviny. Hodí se pro omezený počet použití, v rutinní praxi však mají bohaté zastoupení.
analyt
protilátka
Turbidimetrie
Particle Enhanced Turbidimetric Immunoassay (PETIA)
mikročástice potažená protilátkami analyt
Zesílení turbidance je možné
dosáhnout pomocí mikročástic.
Mikročástice lze „potáhnout“
protilátkami (viz obrázek vlevo).
Při reakci těchto mikročástic
s analytem dochází k tvorbě
zesíťovaného kompaktního
precipitujícího komplexu a k
naměření vyšších hodnot
turbidance.
Takto je pomocí (mikro)částic
(particles) posíleno (enhanced)
turbidimetrické imunostanovení
(turbidimetric immunoassay).
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-22
Příkladem je stanovení v séru např.: IgG, IgA, IgM, C3, C4, prealbuminu, transferinu, orosomukoidu aj.,
v moči pak mikromnožství (malá množství) albuminu (tzv. mikroalbuminurie, správněji albumin v moči).
PETINIA
13.2.4. Vazebné testy (ligandové techniky)
Principem vazebných testů je opět reakce analytu s vazebným proteinem, kterým je nejčastěji protilátka.
Analyt nebo vazebný protein jsou určitým způsobem označeny, aby bylo možno prokázat vytvořený
komplex antigen-protilátka, resp. analyt-vazebný protein. Jednotlivé analytické metody nesou název podle
charakteru detekčního prvku použitého k průkazu interakce (vzájemného působení) analytu a vazebného
proteinu. Detekční prvek se volí podle charakteru značení zúčastněného reaktantu. Všechny vazebné testy
používají ke kalibraci standardy, s jejichž reakcí v systému je srovnávána reakce stanovované látky.
V současné době existuje řada vazebných testů, rutinně používaných ke stanovení biologicky významných
sloučenin – hormonů, nádorových markerů, farmak, alergenů a protilátek podílejících se na alergických
reakcích organismu. Jejich škála se stále rozšiřuje.
Spíše než s pojmem „vazebný test“ se lze v literatuře i v praxi setkat s pojmem „ligandové techniky“
(z latinského ligare, svazovat), o analytu se v této souvislosti mluví jako o ligandu, nebo s obecným pojmem
imunoanalýza, imunostanovení, imunoesej, immunoassay apod.
Vazebné testy lze např. rozdělit
1. podle uspořádání testu na
 nekompetitivní a
 kompetitivní
2. podle nutnosti oddělit vytvořený komplex antigen-protilátka na
 heterogenní a
 homogenní
Ať už se jedná o jakékoliv uspořádání testu, aby bylo možno stanovení provést, je u všech těchto
imunoanalýz nutno používat značené antigeny nebo protilátky, které slouží jako tzv. labels (k identifikaci
vytvořeného komplexu antigen-protilátka (Ag-Pl).
label (angl.), [leibel], štítek, nálepka, etiketa, visačka
Particle Enhanced Turbidimetric Inhibition Immunoassay (PETINIA)
mikročástice potažená analytem
protilátka
vzorek pacienta
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-23
Ke značení antigenů či protilátek se používají
1. Radioaktivní zářiče, např.
125
I (izotop jódu). Metody se nazývají RIA (radio immunoassay) a patří
mezi klasické imunometody
2. Enzymy (alkalická fosfatáza, peroxidáza,galaktozidáza), které po přidání substrátu do reakční
směsi katalyzují reakci, na jejímž konci je barevná látka vhodná k fotometrii. Tyto metody se
nazývají EIA (enzyme immunoassay)
3. Fluorescenční látky, které po ozáření světlem jedné vlnové délky emitují světlo o větší vlnové délce
než je světlo iniciační. Emitované světlo se fluorimetricky měří. Použití fluorescenčního indikátoru se
objeví v názvu konkrétní metody, např. FPIA (Fluorescence Polarization Immunoassay)
4. Chemiluminiscenční látky, bioluminiscenční látky, elektrochemiluminiscenční látky – moderní
metody, kdy k emisi světla dochází po chemické nebo elektrochemické iniciaci, případně po
působení specifického enzymu (luciferáza). Názvy jednotlivých metod obvykle zohledňují způsob
značení i provedení testu – např. CMIA (Chemiluminescent Magnetic Immunoassay)
Při kompetitivním (soutěživém) uspořádání soupeří značený a neznačený antigen o vazebné místo na
specifické protilátce. V praxi to znamená, že do reakční směsi s limitovaným množstvím protilátky se přidá
ke stanovovanému antigenu antigen značený. Během inkubace se tvoří komplexy antigen-protilátka jak se
značeným, tak s neznačeným antigenem. Převažuje ta forma komplexu, které formy antigenu (značený x
neznačený) bylo více. Platí zde přímá úměra: čím více (neznačeného) antigenu ve vzorku, tím více
komplexu s neznačeným antigenem a méně komplexu se značeným antigenem (více značeného antigenu
zůstane nezreagováno v reakční směsi).
Jednostupňová kompetitivní imunoanalýza
+
Reagencie s protilátkou
Stanovovaný analyt
ve vzorku
Komplex antigen-protilátka
+
Reagencie
s označeným
analytem
Označený antigen také umožňuje při
imunochemických reakcích detekci komplexu
antigen-protilátka
+
Reagencie s označenou protilátkou Stanovovaný analyt ve vzorku Komplex antigen-protilátka
Schémata znázorňující značení protilátek a antigenů ve vazebných testech
Označená protilátka umožňuje při imunochemických
reakcích detekci komplexu antigen-protilátka
+ +
Pl Ag Ag*
Pl-Ag Pl-Ag*
+
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-24
Dvoustupňová kompetitivní imunonalýza
U dvoustupňové kompetitivní analýzy se přidává nadbytek protilátky (vzhledem k antigenu). Nejprve se
s protilátkou inkubuje stanovovaný antigen, značený antigen se přidává v druhém kroku. Dvoustupňová
metoda je citlivější než jednostupňová
Při nekompetitivním (tzv. sendvičovém) uspořádání je analyt vázán mezi dvě vysoce specifické protilátky
(jako plátek masa mezi dvěma chleby – „sendviči“). Jedna z nich je vázána na pevnou fázi (stěnu
zkumavky, jamku destičky, mikročástici), druhá je značená a přidává se až k vytvořenému komplexu. Opět
platí, že čím více antigenu ve vzorku, tím více antigenu v komplexu a tím více značené protilátky
v následném „dvojitém“ komplexu.
Poznámka:“sendvič“ je v podstatě plátek masa mezi dvěma krajíci chleba; název pochází od jistého Angličana jménem John
Montagu, čtvrtý Earl ze Sandwich, který údajně tak miloval šachy, že se od nich nechtěl ani na chvíli odtrhnout, ani jít k obědu a
v zájmu ušetření času „vynalezl“ tohle rychlé občerstvení (Ivan Crha, Dědeček na scestí a dalších 300 míchaných nápojů). Jsou i jiná,
i když obdobná vysvětlení (http://en.wikipedia.org/wiki/Sandwich).
Nekompetitivní sendvičová imunoanalýza
Sandwichové uspořádání u imunoesejí, které používají myší monoklonální protilátky, je poměrně citlivé na
přítomnost lidských protilátek proti myším antigenům (Human Anti-Mouse Antibodies, HAMA), které mohou
být příčinou jak falešně zvýšených (pozitivních), tak falešně snížených (negativních) výsledků. Tyto
protilátky (HAMA) se mohou vyskytovat v lidské krvi jako důsledek expozice organismu myším antigenům.
Příčiny expozice jsou různé – může to být v důsledku léčby některých typů rakoviny, kdy se používají myší
monoklonální protilátky, ale také jako imunologická odpověď organismu na expozici přímo myši, pokud s ní
pacient nějakým způsobem přijde do styku, přičemž se nevylučuje ani expozice environmentální.
+
+
Ag
Ag*
Pl-Ag Pl
+
+ +
Pl-Ag Pl Pl-Ag Pl-Ag*
Pevná fáze:
 Mikročástice
 Náplň
speciálních
nádobek
(matrix), např.
skelná vlákna
 Stěny
mikrotitračních
jamek
Sendvičová imunoanalýza: protilátky jsou vázány na analyt oboustranně
Pevná fáze Pevná fáze-Pl-Ag-Pl*
Pl – v nadbytku
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-25
Falešná negativita
Zábranou těmto jevům slouží různé techniky
 dvoustupňové uspořádání, aby interferující látky se mohly vymýt
 použití blokátorů, které obsadí vazebná místa na HAMA, ke snížení či eliminaci interference
Blokátory jsou jedinečné pro každou metodu (assay) a mohou to být např. detergenty, čištěné proteiny a
zvířecí séra.
Homogenní metody jsou ty metody, kdy před stanovením není nutno komplex antigen-protilátka oddělit
Heterogenní metody jsou metody, kdy je potřeba komplex antigen-protilátka před stanovením oddělit a
promýt.
Existují různé možnosti oddělení komplexu. Mezi klasické patří např.
 metoda dvojí protilátky: ke komplexu se přidá další protilátka (proti použité protilátce), která tvoří velký komplex
antigen-protilátka-protilátka, což jsou velké částice snadno oddělitelné (filtrací, centrifugací apod.)
 někdy stačí pouhá centrifugace
 oddělení pomocí různě koncentrovaných roztoků polyetylénglykolu (PEG): komplexy (= velké částice)
precipitují, menší částice zůstanou v roztoku
 oddělení pomocí iontoměničů
 použití molekulových sít
 imobilizace komplexu na skelných vláknech
Působení HAMA protilátek – falešná pozitivita
Pevná fáze HAMA protilátky
Působení HAMA protilátek – falešná negativita
Pevná fáze
HAMA protilátky blokují navázanou
protilátku
Působení HAMA protilátek – falešná negativita
Pevná fáze
HAMA protilátky blokují značenou
protilátku
Falešná pozitivita
HAMA protilátky se vážnou jak na protilátky
upoutané na pevné fázi (např. mikročástici), tak
na značenou protilátku, což se projevuje,
jakoby vznikl komplex z protilátek a analytu
přítomného v pacientském vzorku.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-26
 metody pevné fáze:
- protilátka je navázána na stěny polystyrenových zkumavek, antigen se naváže na tyto fixované protilátky,
nezreagovaný antigen se vylije s roztokem
- protilátka je navázána na polystyrenové kuličky (na zlaté částice, latexové aj.), komplex částice-protilátkaantigen
lze snadno oddělit centrifugací
- protilátkou jsou potaženy ferromagnetické kuličky - po zapnutí magentického pole se kuličky s navázanými
komplexy imobilizují na elektromagnetu
Homogenní a heterogenní imunoanalýza
Jednotlivé metody
Dále je pospáno několik zástupců jednotlivých skupin ligandových technik, jejichž přehled uvádí schéma:
Radioimunoanalýza (RIA)
Ke značení je užit radioizotop. Prvním vazebným testem bylo radioimunostanovení – RIA, popsané v roce
1959 Bersonem a Yalowou pro stanovení hladin inzulínu při použití lidských protilátek proti inzulínu.
Princip: Soutěžení dvou forem molekuly antigenu (neznačené ze vzorku a značené radioaktivním prvkem,
přidané do reakč ní směsi v konstantním množství) ve vazbě na specifickou protilátku. Molekuly se na
protilátku vážou v poměru svých koncentrací. Nezreagované komponenty se odstraní promytím.
Heterogenní kompetitivní analýza. Schéma uspořádání metody je totožné se schématem uvedeným na
straně 10-28: ELISA, I. Princip kompetitivního uspořádání.
Značení:
125
I (izotop jódu, -zářič, nejčastější použití); T (tritium, -zářič).
Dále popsané ligandové techniky
RIA
RIA
EIA
EMIT
ELISA
MEIA
FIA
FPIA
TRACE
CLIA
LOCI
CMIA
ECLIA
IRMA
Měření komplexu Pl-Ag
Komplex PF-Pl-Ag-Pl
*
PF-P
Ag
Pl
*
Homogenní metoda
Heterogenní metoda
Izolace a promytí
komplexu PF-Pl-Ag-Pl*
Reakční nádobka
Protilátka vázaná na
pevnou fázi (PF-Pl)
+
Vzorek (Ag)
+
Označená protilátka (Pl*
)
(Viz obr. Nekompetitivní sendvičová imunoanalýza)
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-27
Pro zvídavé studenty schéma obecného postupu:
1. Připraví se řada zkumavek se základními roztoky (pufrem,
roztokem protilátky, roztokem značeného antigenu – objemy a
koncentrace jsou ve všech zkumavkách stejné).
2. Vyčlení se zkumavky pro kalibraci (např. prvních pět – podle
počtu kalibračních vzorků). Do těchto zkumavek se přidá
kalibrační materiál – neznačený antigen – ve stoupající
koncentraci: v první zkumavce nejnižší koncentrace kalibrátoru
atd. až po poslední, kde je koncentrace standardu nejvyšší.
Kalibrace je nutná u každé série měření – vyplatí se proto
zpracovávat pokud možno velké série vzorků
3. Zbývající zkumavky jsou určeny pro vzorky – do těch se přidá
vhodně zředěný biologický materiál (sérum, moč), ve kterém se má
stanovit příslušný antigen.
4. Inkubace všech zkumavek (obvykle přes noc) – tvoří se komplex
antigen-protilátka: pokud jsou ve zkumavce obě formy antigenu
soutěží spolu o vazebné místo na protilátce a vážou se v poměru svých koncentrací
5. Kvantitativní oddělení komplexu antigen-protilátka od nezareagovaných antigenů, užívají se různé metody
6. Detekce = měření radioaktivity – je možný dvojí způsob:
a. měří se radioaktivita vzniklých (a oddělených) komplexů antigen-protilátka: v tomto případě se vzrůstající koncentrací
antigenu ve vzorku klesá naměřená radioaktivita (v komplexu antigen-protilátka je větší podíl neznačeného antigenu)
b. měří se radioaktivita podílů s nezreagovanými antigeny: se vzrůstající koncentrací antigenu radioaktivita vzrůstá (v podílu po
oddělení komplexu antigen-protilátka zůstává se vzrůstající koncentrací antigenu ve vzorku více antigenu značeného, protože
neznačený je v komplexu – srovnej ad 6. a.)
7. Vyhodnocení výsledků
Imunoradiometrická analýza (IRMA)
Schéma uspořádání metody odpovídá schématu ELISA II. Princip nekompetitivního sendvičového
uspořádání, uvedenému na straně 10-28. Na antigen v komplexu Ag-Pl navázaném na pevné fázi (např. na
stěnách reakční jamky) se naváže další protilátka, značená radiokativním izotopem. Po odmytí všech
nezreagovaných komponent odpovídá intenzita záření přítomnému antigenu. I v tomto případě se jedná o
heterogenní imunoanalýzu, tentokrát nekompetitivní.
RIA metody jsou postupně opouštěny. I když jsou relativně levné, nedávají nejpřesnější výsledky,
radioaktivní izotop má omezenou trvanlivost, metody vyžadují speciální přístroje a pracoviště musí být
vybaveno pro práci s radioizotopy
Enzymoimunoanalýza (EIA)
Princip: Do komplexu antigen-protilátka vstupují antigen nebo protilátka značené enzymem, kterým bývá
peroxidáza (POD) či alkalická fosfatáza (ALP), ale používají se i jiné enzymy. Množství stanovovaného
antigenu se určuje z výsledků reakce enzym + substrát = (barevný) produkt.
EMIT: Enzym immunoasssay technique
(EMIT; technika enzymového imunostanovení)
Princip: O vazebné místo na specifické protilátce soutěží molekuly antigenu z analyzovaného vzorku a
přidané molekuly antigenu značeného enzymem. Po skončené kompetici (soutěži) se přidá substrát, který
podléhá reakci katalyzované volnými nezreagovanými molekulami enzymu vázaného na antigen.
Enzymoimunochemické reakce u EMIT:
1. antigen + protilátka [antigen-protilátka] + substrát [neaktivní]
2. antigenE + protilátka [antigenE-protilátka] + substrát [neaktivní]
3. antigenE + substrát [aktivní]
Ze schématu vyplývá, že komplex [antigen-protilátka] nekatalyzuje reakci substrátu, rovněž tak nekatalyzuje
reakci enzymem značený antigen v komplexu [antigenE-protilátka]. Enzym navázaný na antigen (volný) tuto
reakci katalyzuje. Reakce je volena tak, že ze substrátu vzniká barevný produkt vhodný k fotometrii.
Intenzita výsledného zbarvení je úměrná koncentraci volného značeného antigenu. Se vzrůstající
koncentrací antigenu ve vzorku intenzita výsledného zbarvení vzrůstá. Závislost má obecně nelineární
charakter. Kalibrace se provádí se známými koncentracemi antigenu (je to podobné jako u RIA).
Rosalyn YalowSolomon Aaron Berson
Solomon Aaron Berson; Rosalyn Yalow
Nobelovu cenu získala dr. Yalow v roce 1977 za vývoj
RIA pro stanovení inzulínu (Berson byl v té době již po
smrti, zemřel v roce 1972 a Nobelova cena se posmrtně
neuděluje. Yalow zemřela v roce 2011.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-28
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assays
(ELISA; analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorpce)
I. Princip kompetitivního uspořádání: protilátka je pevně vázána na stěny zkumavky, enzym vázaný na
antigen neztrácí v komplexu [antigenE-protilátka] aktivitu. O vazebné místo na protilátce soutěží
značený antigen a antigen ze vzorku (neznačený). Zastoupení obou forem antigenu na protilátce
odpovídá jejich relativním koncentracím. Přebytek značeného antigenu (který nezreagoval) se vylije a
po přidání substrátu se změří intenzita zbarvení vytvořeného barevného produktu. Intenzita zbarvení je
úměrná množství navázaného značeného antigenu. Čím vyšší koncentrace stanovovaného antigenu
(ze vzorku), tím nižší intenzita zbarvení.
Pl + Ag + AgE Pl-Ag + Pl-AgE ..... + S (barevný) P
II. Princip nekompetitivního sendvičového uspořádání: na protilátku navázanou na stěnách reakční
nádobky (1) se naváže antigen ze vzorku (2). Po promytí se přidá protilátka značená enzymem, která se
naváže na komplex (3). Po dalším promytí se přidá substrát (4). Výsledná intenzita zbarvení je úměrná
koncentraci antigenu ze vzorku (4).
(1) (2) (3) (4) (5)
Pl Pl-Ag Pl-Ag-PlE Pl-Ag-PlE + S (barevný) P
Protilátka (Pl) Vazba antigenu (Ag) Po proprání přidána Po proprání přidán substrát (S); výsledkem reakce je
navázaná na na protilátku protilátka značená barevný produkt (P)
stěny nádobky enzymem (PlE)
Pracovní postup a kalibrace jsou podobné jako u RIA metod, pouze vyhodnocení je fotometrické. Tyto
metody jsou pro rutinní praxi vhodnější proto, že není potřeba speciálních zařízení a může se pracovat
v běžné laboratoři. Rovněž exspirační doba souprav je delší než u RIA.
EIA metody se většinou provádějí v mikroměřítku ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv.
mikrotitračních destiček. Toto provedení obvykle vyžaduje koupi speciálního fotometru (readeru) a
promývačky (washer), ušetřené náklady za makroprovedení jsou však mnohem větší, takže jednorázová
investice se vyplatí. V současnosti navíc existují automaty, které celý proces podstatně zjednodušují.
Jak RIA, tak EIA metody jsou svou podstatou omezeny na stanovení látek do určité minimální koncentrace.
Např. u EIA metod je nutná poměrně vysoká koncentrace enzymu (tudíž i komplexu se značeným
proteinem), aby se vytvořilo fotometrovatelné množství barevné látky. Nově objevené principy detekce
imunoanalytické metody zcitlivují až o několik řádů, takže lze stanovovat i látky doposud nestanovitelné.
Provedení však vyžaduje podstatně složitější techniku, tj. jednoúčelové automatické analyzátory. Na těchto
analyzátorech lze pochopitelně provádět i metody typu EIA.
MEIA: Microparticle Enzyme Immuno Assay
Jedná se o nekompetitivní imunoanalýzu se separací komplexu, s jednou protilátkou neznačenou, vázanou
na mikročástice a s jednou protilátkou značenou enzymem. Jde tedy o stanovení heterogenní, patřící mezi
EIA metody se sendvičovým uspořádáním. Pro snazší separaci komplexu jsou použity latexové
mikročástice. Separace probíhá na matrici (matrix) ze skelných vláken (speciální nádobka). Značicím
enzymem je alkalická fosfatáza (ALP). Substrátem pro enzym je 4-methylumbelliferylfosfát (MUP), který po
odštěpení fosfátu pomocí ALP poskytuje fluorescenční látku 4-methylumbelliferon (MU) jejíž fluorescence
(zářivý tok) se proměřuje. Použití fluorescenčního indikátoru metodu oproti běžné fotometrii zcitlivuje.
Poznámka: v tomto případě řešil výrobce přístroje oddělení komplexu [antigen-protilátka] filtrací přes skelné vlákno. Jiné řešení
přinášejí v tomto ohledu např. přístroje firmy DPC Immulite 2000 a Immulite 2500, kde se tento komplex odděluje
centrifugací.Nové přístroje firmy Abbott (Architect) přinášejí obměněnou techniku, a to s použitím magnetických částic (místo
skelného vlákna se užije magnetické pole )a protilátky značené patentovanou akridiniovou solí (viz dále „Chemiflex technologie“).
Protilátka navázaná na stěny nádoby + antigen
Ag + značený antigen AgE
Dva typy komplexů: Pl-Ag,Pl-AgE Přidání substrátu a tvorba produktu
Stručný souhrn jednotlivých kroků při analýze MEIA:
 Pacientský vzorek se stanovovaným antigenem se přidá k latexovým částicím s navázanými protilátkami
proti tomuto antigenu. Latexové částice se inkubují spolu s antigenem přítomným v pacientském vzorku.
Během inkubace dojde k vazbě antigenu na protilátky a k tvorbě komplexu antigen-protilátka.
 Reakční směs se přenese na matrix se skelnými vlákny.
 Přidá se protilátka s navázaným enzymem (ALP), tzv. konjugát. Dojde k vazbě značených protilátek na
komplex neznačená protilátka-antigen. Následuje promytí.
 Přidá se substrát. Pomocí enzymu (ALP) dojde k odštěpení fluorescenční látky (MU) a množství zářivé
energie je přímo úměrné množství antigenu přítomného ve vzorku.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-29
Schéma metody MEIA
Fluorimetrické metody (FIA)
Ke značení je užita fluorescenční sloučenina. FIA metody jsou citlivější než EIA metody. Příkladem je
FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay
Homogenní kompetitivní fluorescenční imunoanalýza s využitím polarizovaného světla. Antigen ze vzorku
(Ag) a přidaný antigen značený fluoresceinem (AgF) soutěží o vazebné místo na protilátce (Pl). Výsledkem
je směs komplexů Pl-Ag a Pl-AgF. Tyto komplexy budou ve směsi v poměru, v jakém byly původní antigeny.
Jinými slovy, čím více bylo antigenu v pacientském vzorku, tím více bude ve výsledné směsi komplexů
obsažena forma Pl-Ag a opačně. Reakce se provádí v jednom roztoku a nevyžaduje promývací krok pro
oddělení nenavázaných značených protilátek. Pro zjištění výsledku využívá FPIA tří principů: fluorescence,
rychlost rotace molekul v roztoku a polarizované světlo.
Flurorescence
Fluorescein navázaný na antigenu po ozáření světlem 490 nm emituje světlo o vlnové délce 520 nm, jehož
aktivita se měří. Fluorescenční záření ovšem emituje jak fluoresceinem značený antigen v komplexu, tak
značený antigen v roztoku. K vzájemnému rozlišení je využito rotace molekul a polarizovaného světla.
Rotace molekul
Malé molekuly rotují v roztoku mnohem rychleji než molekuly velké. Této skutečnosti je využito pro rozlišení
malých molekul představovaných v daném případě antigenem s fluoresceinem od molekul velkých, kterými
jsou zde komplexy antigenu s protilátkou. AgF rotuje v roztoku mnohem rychleji, než komplex Pl-AgF.
Polarizované světlo
Vlny polarizovaného světla kmitají pouze v jedné rovině. Osvítí-li se malé molekuly AgF tímto světlem,
záření absorbují a díky své rychlé rotaci emitují sekundární záření v rovině odlišné od roviny světla
excitačního, tj. emitují fluorescenční záření nepolarizované. Polarizačním filtrem, který je součástí
uspořádání metody, projde pouze malé množství světla, takže celkový světelný výtěžek bude malý,
fluorescenční signál bude malý. Naopak velké molekuly Pl-AgF díky své pomalé rotaci emitují fluorescenční
záření ve stejné rovině v jaké bylo absorbováno budicí záření, tedy výsledkem je emitované polarizované
světlo, které po průchodu polarizačním filtrem dopadne na detektor. Intenzita tohoto světla odpovídá obsahu
značené protilátky v komplexu. Protože se jedná o kompetitivní uspořádání platí, že čím nižší výtěžek
fluorescence, tím vyšší obsah (stanovovaného) antigenu v původním vzorku.
Mikročástice potažené protilátkou proti
analytu/antigenu jsou inkubovány spolu se vzorkem a
tvoří se reakční směs
Část reakční směsi je přenesena na „matrix“ ze skelných
vláken
V dalším kroku je přidán „konjugát“, tj. roztok
s protilátkami proti analytu/antigenu značnými
alkalickou fosfatázou. Vytvoří se komplex
s mikročásticemi s navázaným analytem („sendvič“).
Následuje přidání substrátu MUP (4-methylumbelliferyl
fosfát). Enzym ALP odštěpí ze substrátu fosforečnou
skupinu, zbylý MU (4-methylumbelliferyl) je
fluorescenční látkou. Měří se fluorescenční tok, jehož
intenzita je přímo úměrná koncentraci analytu ve
vzorku.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-30
Obrázky jsou převzaty
z edukačního
materiálu fy ABBOTT
TRACE: Time Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE technologie)
Firma Thermo Scientific využila vědekého bádání JeanMarie
Lehna (viz kapitola 9, str. 9-9) v oboru kryptandů a
podobných látek, za které obdržel Nobelovu cenu. TRACE je
anagramem relativně dlouhého názvu Time Resolved
Amplified Cryptate Emission, což snad lze přeložit jako
časově rozložená zesílená kryptátová emise. Jedná se zde o
vyslání signálu emitovaného z imunokomplexu po časové
prodlevě způsobené nezářivým přenosem energie z donoru
na akceptor. Po ozáření laserem excituje donor (kryptát
europia) navázaný na první protilátku dlouhotrvající záření,
které může vyvolat krátkodobé záření akceptoru (XL665)
navázaného na druhou protilátku, a to pouze tehdy, je-li donor akceptoru nablízku, tj. v imunokomplexu.
Fluorescenční signál akceptoru, který je měřen, je úměrný koncentraci antigenu. Kromě fluorescenčního
záření je dalším diskriminačním kritériem časová prodleva při přenosu energie. Schéma vpravo nahoře
snad bude srozumitelnější než popis. Technologie je využita v přístroji B.R.A.H.M.S. KRYPTOR compact
PLUS.
Pomalá rotace komplexu protilátka-značený antigen a z toho vyplývající vysoký
výtěžek fluorescence rotace komplexu
Rychlá rotace značeného analytu a z toho vyplývající nízký výtěžek fluorescence
B.R.A.H.M.S. KRYPTOR compact PLUS Jean-Marie Lehn
Přenos energie
Donor
(kryptát)
Antigen ve vzorku
Akceptor
(XL665)
Fluorescenční
signál
TRACE - schéma
Záření
LASERu
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-31
Luminiscenční metody
Ke značení je užita látka schopná za určitých okolností emitovat světlo.
 Chemiluminiscenční metody (CLIA): emise světla je výsledkem chemiluminiscenční reakce při
oxidaci vhodných látek – intenzita světla je úměrná množství značeného proteinu v komplexu
 Bioluminiscenční metody: emise světla je aktivována specifickým enzymem, jakým je např.
luciferáza; bioluminiscenční metody využívají tento systém
 ECL (elektrochemiluminiscence): vysoce reaktivní látky, které emitují světlo, se tvoří/generují ze
stabilních prekurzorů na povrchu elektrody
Příklady chemiluminiscenčních technologií
LOCI: Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (Technologie LOCI
™
)
používaná v analyzátorech Siemens Dimension
®
, zvyšuje úroveň citlivosti chemiluminiscenčního signálu.
LOCI
®
technologie používá dva typy syntetických mikročástic :
 citlivou částici (sensibead), která je potažena streptavidinem a obsahuje fotocitlivou látku a
 chemickou částici (chemibead), která je potažena protilátkou specifickou pro metodu a také
obsahuje fotocitlivou látku.
Do reakčního prostředí je přidán ještě třetí reagent ve formě biotinylované protilátky specifické pro metodu
(biotinylovaný receptor). Reaktanty se vážnou s analytem za tvorby imunokomplexů vázaných s částicí.
Ozáření tohoto komplexu světlem o vlnové délce 680 nm uvolňuje z citlivé částice (sensibead) singletový
kyslík, který difunduje do navázané chemické částice (chemibead) a spouští chemiluminiscenci. Blokovací
vrstva kolem každé částice minimalizuje možnost nespecifické vazby. Schéma reakce je na obrázku, video
je možno shlednout zde. Za výhodu metody se považuje vynechání promývacího kroku.
LOCI – vyslov [lousáj]
chemi
bead
LOCI™
signál
sensi
bead
specifická protilátka
biotin
1
O2
1
O2
1
O2
1
O2
1
O2
1
O21
O2
1
O2
1
O2
1
O2
1
O2
1
O2
biotinylovaný receptor
analyt
částicový imunokomplex
stimulace světlem 680 nm
produkce 1
O2
chemiluminiscence
streptavidin
specifická
protilátka
LOCI
®
technologie
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-32
Pro zvídavé studenty
Chemibeads, jsou latexové kuličky (200 nm) obsahující olefinovou sůl, která reaguje se singletovým kyslíkem za tvorby
1
O2 aduktu, který se rozkládá a generuje chemiluminiscenční signál. Kuličky obsahují také akceptor fluorescenční
energie, který mění emisní záření na 612 nm. Blokující vrstva kolem kuličky izoluje značku a minimalizuje potenciální
nespecifické vazby. V sandwichovém formátu jsou záchytné protilátky vázány na povrch chemibead.
Sensibeads, jsou latexové kuličky (200 nm) obsahující fotosenzitivní sůl, která absorbuje světlo o vlnové délce 680 nm
a generuje singletový kyslík (
1
O2). Blokující vrstva kolem kuličky izoluje značku a minimalizuje potenciální nespecifické
vazby. Streptavidin, navázaný na povrch částice, se váže s biotinylovaným receptorovým reagentem. To přivádí zdroj
singletového kyslíku(sensibead) do blízkosti receptoru singletového kyslíku (chemibead), čímž se vytvoří párový
imunokoplex z částic, aby se mohl generovat LOCI™ signál.
Biotinylované receptory, jsou reagencie specifické pro analyt, typicky se jedná o biotinylované protilátky. Slouží jako
část mostu mezi chemibead a sensibead v párovém imunokomplexu z mikročástic.
Biotinylace
Biotin se nazývá také vitamín H, koenzym R či vitamín B7).
Je to koenzym karboxyláz a zúčastňuje se syntézy mastných kyselin a aminokyselin izoleucineu a valinu. Rovněž se
účastní v glukoneogenesi
Biotinylací se rozumí vnesení biotinylových skupin do molekul, resp., je to proces při kterém se biotin kovalentně
naváže na protein, nukleovou kyselinu nebo další molekuly. Biotinylace může probíhat chemicky nebo
enzymaticky.Vzhledem k tomu, že biotin má malou molekulu, nenarušuje biotinylace přirozené funkce biotinylované
molekuly.
Biotin se extrémně silně váže na streptavidin a avidin.
Streptavidin je protein o velikosti 60 kDa, který byl purifikován z bakterie Streptomyces avidinii. Je to homotetramer,
který má vysokou afinitu k biotinu (vitamin B7). Vazba biotinu na streptavidin patří mezi nejsilnější nekovalentní
interakce jaké jsou v přírodě známy.
Streptavidin se extenzivně používá v molekulární biologii a bionanotechnologiích, protože streptavidinový-biotinový
komplex je velmi odolný vůči organickým rozpouštědlům, denaturačním činidlům, detergentům, proteolytickým
enzymům, extrémním teplotám a pH.
Avidin je bílkovina separovaná z vaječného bílku, je to rovněž známá látka vázající se s biotinem. Má přibližně 30%
sekvenční identitu se streptavidinem, ale sekundární, terciární a kvartérní struktury má se streptavidinem téměř
identické. Má vyšší afinitu k biotinu, ale nižší, pokud je již na biotin navázaná jiná molekula, proto je streptavidin
lepším vazebným činitelem pro biotin než avidin.
Vazba biotinu na zmíněné látky je rychlá a vysoce specifická, proto jsou tyto interakce využívány v mnoha
biotechnologických oblastech k izolaci biotinylovaných molekul. Tyto izolace je možné provádět v různých
prostředích, díky tomu, že vazba se streptavidinem a avidinem odolává extrémním teplotám, extrémnímu pH a
proteolýze.
Na protein, který je předmětem zájmu, lze navázat několik molekul biotinu a tedy i několik molekul avidinu či
streptavidinu, což vede ke zvýšení citlivosti detekce daného proteinu.
Na biotin navázaný např. na komplex vazebný protein-analyt lze dále navázat avidin/streptavidin značený enzymem,
radioizotopem, fluorescenční látkou, kovem či jinak. Takto dojde k navázání detekčního prvku („nálepky“) a citlivost
metody se zvýší (metoda s biotin/avidinovým komplexem má např. asi 1000x vyšší citlivost než RIA).
Dva (různě pojaté) vzorce biotinu
S
N
H
NHOH O
H
H
O
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-33
CMIA: Chemluminescent Magnetic Immunoassay (ChemiFlex
®
technologie)
používaná v analyzátorech Abbott Architect. Jako „nálepka“ slouží patentovaný akridiniový derivát.
technika se nazývá chemiluminiscenční magnetické imunostanovení (Chemiluminescent Magnetic
Immunoassay) – CMIA.
V tomto případě jsou mikročástice (fero)magnetické, takže promývací krok (odstranění nezreagovaných
konjugátů) je usnadněn vytvořením magnetického pole (zachytí se pouze magnetické částice,
nezreagované součásti se vymyjí). Jedná se o nekompetitivní sandwichovou techniku (viz str. 10-24), kde
množství měřeného signálu je přímo úměrné množství analytu přítomného ve vzorku. Použitá
chemiluminiscenční „nálepka“ (akridiniový derivát) produkuje silnou světelnou emisi, tudíž metoda vykazuje i
vyokou citlivost. Chemiluminiscenční látka produkuje světlo, je-li kombinována s trigger reagencií (z angl.
trigger = spoušť, spouštěcí mechanismus; spustit, aktivovat,vyvolat vzbudit; odpálit).
ECL, ECLIA: Elektrochemiluminiscence
Zde se využívá přeměny vysoce stabilního prekurzoru na povrchu elektrody na vysoce reaktivní prvek.
Vysoce reaktivní prvky reagují navzájem za tvorby světelného záblesku.
ELECSYS (automat od firmy ROCHE, dříve Boehringer Mannheim GmbH) využívá jako prekurzory
tripropylamin (TPA) a komplex ruthenium(II)-tri(bipyridyl)[Ru(bpy)2+]. TPA slouží k zabezpečení
elektrodového děje, vlastní chemiluminiscenční „nálepkou“ je rutheniový komplex. Konečný
chemiluminiscenční produkt se tvoří během detekce. Spíše než chemicky je chemiluminiscenční reakce
iniciována elektricky, vložením napětí na roztok se vzorkem. Reakce je přesně kontrolovaná, protože se
nemusí přidávat dodatečné reagens a není nutno míchat roztokem. Metoda je poněkud komplikovanější a
náročnější na přístrojové vybavení, ale přináší zvýšení citlivosti a specifity stanovení.
CHEMIFLEX™ - jednotlivé kroky
V první fázi dojde k vazbě
antigenu ze vzorku
s protilátkou na
paramagnetické částici.
Uspořádání může být i
opačné, navázán může být i
virus.
Následuje promytí a přidání peroxidu vodíku
(pre-trigger), který zabrání předčasné emisi
světla a odštěpí akridiniové barvivo
z konjugátu. Poté je přidán hydroxid sodný
(trigger) a vzájemným působením peroxidu a
louhu na akridinium dojde k oxidaci
chemiluminiscenční látky za tvorby Nmethylakridonu
a emise světla.
Následuje přitažení částice
magnetem a odmytí
nezreagovaných komponent.
Vodovodní
kohoutek
znázorňující
promytí
Magnet
Stav po přidání akridiniového
konjugátu
Magnetická
mikročástice
potažená
protilátkami
proti analytu
+
Analyt ve
vzorku
+ + Pre-
Trigger
Trigger
Konjugát protilátky
proti analytu
s anvázaným
patentovaným
derivátem akridinia
H2O2/NaOH
CHEMIFLEX™ - „účastníci reakce“ Patentované
barvivo
obsahuje
sulfopropylovou
skupinu, která
zajišťuje
rozpustnost ve
vodě
a
patentovaná
sulfonamidová
skupina zajišťuje
stabilitu
reagencie.
N
+
S
O
O
O
-
ON
R
SO2Ar
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-34
(z materiálů fy Roche)
Schéma průběhu reakce s využitím elektroluminiscence
Schéma využití luciferinu a luciferázy
h= světelné kvantum; max = 537 nm
PPi = odštěpený difosforečnan
Elektrochemiluminiscence
Ru
Ru
Ru
Biotynylovaná
monoklonální
protilátka
proti analytu
Analyt ve vzorku
Ruthenylovaná
monoklonální
protilátka proti
analytu
Streptavidinem
značené mikročástice
Měření komplexu
Vložení napětí
ATP AMP + PPi
Luciferin + O2 Oxiluciferin + CO2 + h
Luciferáza, Mg
2+
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-35
Multiplexové technologie
Současné provedení několika testů v „jedné zkumavce“ se nazývá multiplex, multiplexing. Dále jsou
popsány principy technologií využívající mikročástice (xMAP Technologie) a mikroarraye (čipy, biočipy).
xMAP technologie
xMAP technologie je produkem firmy Luminex, jejímž hlavním sídlem je Austin v Texasu.
xMAP technologie používá polystyrenové mikročástice (beads, microspheres) o velikosti 5,6 m, které jsou
napuštěny červeným a infračerveným fluoroforem. Různý poměr obou barviv umožňuje získat až 100
různých odstínů, tedy až 100 různých mikročástic. Každá tato částice je spektrálně unikátní, je jednoznačně
rozeznatelná, což umožňuje současné provedení (multiplexing) až 100 různých testů v jednom reakčním
objemu. Mikrosféra má dvojí funkci, slouží jako pevná fáze i jako idenfifikátor.
Provedení je možné na
mikrodestičkách (ELISA) či zcela
automatizované s využitím průtokového
cytometru.
Průtokový cytometr detekuje jednotlivé mikročástice. Každá částice nese v podstatě dva kódy, tj. svou
vlastní barvu, která identifikuje analyt (druh) a fluorescenční signál fykoerithrinu, fotosyntetického barviva
(reportér, reportérová molekula) vázaného prostřednictvím streptavidinu na příslušného vazebného partnera
(množství analytu).
Vlastní detekce je umožněna použitím duálního laseru. Zelený laser (532 nm; „assay“ laser) se používá
k excitaci PE-barviva (PE = PhycoErythrin, fykoerithrin). Červený laser (635 nm) se používá k excitaci
barviva uvnitř mikrosféry .
Detektory jsou čtyři a identifikují mikrosféry (analyt) a PE-fluorescenci (kvantita).
Firma Bio-Rad využila tuto technologii v automatickém analyzátoru BioPlex 2200.
Schématické znázornění vybarvení
mikrosféry (vlevo) a (vpravo) potažení
mikrosféry vazebným partnerem
Využití technologie je velmi flexibilní: na obrázku jsou znázorněny možnosti
pro imunoeseje, metody stanovení nukleových kyselin, enzymů a metody
na bázi vazby receptor-ligand. Na obrázku je také vidět, značení druhé
protilátky (konjugátu), hybridizační sondy a ligandu. U enzymového
stanovení je to značený substrát, resp. substrátový analog.
Zelený laser
Červený laser
Mikročástice
Cesta toku částic
Detektory
analytu
Detektory
částic
Barva 2
Barva 1
Scater, který rozlišuje mezi
jednotlivými a agregovanými
mikrosférami
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-36
Mikroarraye a biočipy
Proteomika a genomika přinášejí do praxe laboratorních pracovníků miniaturizaci a nové pojmy jako biočip,
mikroarray a podobně. O tématu je také pojednáno v kapitole 19, na str. 19-26, zde je stručná zmínka o
přínosu z oblasti proteomiky.
13 Assay Microspheres
1 dsDNA
2 Chromatin
3 Ribosomal P
4 SS-A (52 kD)*
5 SS-A (60 kD)*
6 SS-B
7 Sm
8 Sm/RNP
9 RNP (A)*
10 RNP{ (68)*
11 Scl-70
12 Jo-1
13 Centromere B
Příklad uspořádání s 25
mikrosférami (25 různých
odstínů), na které mohou být
navázány unikátní anigeny ke
stanovení protilátek. Některé
mikrosféry mohou sloužit ke
kontrolním účelům (viz ANA
kit).
Konkrétní provedení pro ANA
test (ANA Screen Kit)L současné
stanovení 13 antinukleárních
protilátek pomocí specifických
antigenů)
Je použito celkem 16 mikrosfér:
13 testovacích a 3 QC.
Obsazení mikrosfér v tzv. ANA screen Kit
1 – 13: testovací mikrosféry (Assay Microspheres,
seznam metod, resp. antigenů, jež jsou lokalizovány
na konkrétních mikrosférách)
A, B, C: QC mikrosféry
o A: SVB – sféra určená k verifikaci séra,
o B: SB – sféra s vnitřním standardem
o C: RBB – sféra pro blank reagencie.
(jediná) reagencie použitá pro
stanovení těchto analytů
Poznámka: Minimální počet měření 150 pro každý analyt oproti klasickému jednomu měření v imunoanalýze značně posiluje kvalitu výsledku.
Nasávání
do
detektoru Průtoková
kyveta
Mikrosféry
p
Mikrosféry se jednotlivě
pohybují v řadě za sebou
průtokovým cytometrm
Každý analyt má vyčleněno minimálně
150 mikrosfér, tj. minimálně 150
výsledků na jeden analyt, 100 000
měření za minutu.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-37
Biočip, mikroarray, je představován malou destičkou (např. o rozměrech 9 x
9 mm; fa Randox, viz obrázek vlevo), na které jsou navázány buď protilátky
(pokud se v biologickém vzorku pátrá po antigenu), nebo opačně antigeny
(pokud se v biologickém materiálu pátrá po protilátce). Celá destička
připomíná počítačový „chip“, odtud název „biočip“ případně „mikroarray“, tj.
mřížka miniaturních rozměrů. Po navázání příslušného protipólu, inkubaci a
promytí následuje vizualizace výsledku, podobná metodám EIA. Na malé
ploše je možno vedle sebe navázat několik typů protilátek/antigenů a vytvořit
tak přímo panel určitých markerů (koronárních, tumorových, kostního
metabolismu aj.). Lze tak pacientovi současně stanovit několik analytů ve
stejném čase a na malém prostoru (další typ multiplexové analýzy).
V současnosti se tyto metody pomalu ale jistě začínají prosazovat, i když
ceny prozatím nejsou optimální. Dá se ale předpokládat snížení ceny s jejich
nasazením do terénu ve větším měřítku. Dokladem těchto trendů je např. i
řada analyzátorů Evidence fy Randox
Skutečná výroba mikročipů probíhá jinak, i když uvedená představa může být užitečná. Postup výroby
mikročipu z oblasti DNA technologií je zmíněn v kapitole 19, na str.19-29. Nutno dodat, že např. řada
analyzátorů Evidence fy Randox umožňuje jak proteinovou analýzu, tzn. stanovení antigenu pomocí
protilátky navázané na příslušné místo mikročipu, či stanovení protilátky pomocí antigenu navázaného na
příslušné místo mikročipu, kompetitivní i sandwichovou imunoanalýzu tak i SNP(single nucleotide
polymorphism) genotypizaci, tzn. měření variací polymorfismu způsobeného změnou/mutací jednoho
nukleotidového páru na specifickém lokusu, stanovení genové exprese (RNA expresi), detekci patogenů a
detekci mutací (bližší podrobnosti v kapitole 19), vše, jak bylo uvedeno, v multiplexovém spořádání.
Jako názornou pomůcku pojmu „array“ si
můžeme představit ELISA destičku s vizualizací
proběhlých reakcí při pohledu shora, jak je
naznačeno na uvedených obrázcích. Každá
destička představuje v podstatě mřížku
tvořenou různobarevnými body, které
odpovídají jednotlivým jamkám/cisternám
s navázanými protilátkami/antigeny a
s výslednou reakcí jednotlivých vzorků. Směrem
vpravo, postupným zmenšováním obrázku
dospějeme, alespoň myšlenkově, k
„mikrodestičce“, čili jakémusi „čipu“.
Biočip fy Randox pro sandvičovou imunoanalýzu (sandwich immunoassay) – schéma uspořádání
Protilátka značená
enzymem (konjugát)
Oddělené testovací
zóny
Sendvičová imunoanalýza
Analyt v pacientském
vzorku
Protilátka navázaná
na povrch biočipu
biočip
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-38
Na stránkách www.bio-rad.com a www.randox.com je možno najít další i edukační materiál o nových
přístrojích a metodách z této oblasti.
http://www.slideshare.net/medicoshoy/antinuclear-antibodies-by-bioplex-2200
Algoritmus stanovení na proteinovém biočipu v poloautomatu
Evidence
®
Investigator
PromytíPromytí
Přidání reagencie generující signál
Nosič biočipů
připravený k použití
InkubacePřidání reagencie / vzorku
Zaznamení obrazu
z CCD prvků a výdej
vícenásobných
(multiple) výsledků
Plně automatický analyzátor Evolution fy
Randox využívající technologii biočipových
polí (Biochip Array Technology).
Spodní obrázek (tamvý přístroj)
představuje poslední vývojovou verzi
analyzátoru Evolution.
(Euromedlab, Paříž, 2015)
Tento přístroj umožňuje testování
v oblastech
 klinické imunochemie
 forenzní a klinické toxikologie
 výzkumu
 kontroly potravin
 kontroly zbytkových drog
Poměrně rozsáhlou nabídků testů (arrayí
pro daný účel), lze nalézt na adrese:
http://www.randox.com/evidence-evolution-test-
menu.php
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-39
Se zajímavým přístupem k problematice přišli vědci z Univerzity v Cambridgi: tenká vrstva
křemene je pokryta protilátkou; ke krystalu se přidá virus, který se naváže na protilátku;
zavede se vysokofrekvenční proud a krystal osciluje, přičemž zmítá komplexem virus
(antigen)-protilátka; při vhodné frekvenci dojde k odtržení viru a je slyšet charakteristický
zvuk; aby došlo k roztržení tohoto komplexu, je třeba vystavit komplex síle, která je přibližně
desetimilionkrát větší než je zemská přitažlivost; to odpovídá frekvenci 1,4.10
7
kmitů za
sekundu; metodou se nezjišťují protilátky, ale přímo (pomocí specifických protilátek) virus;
metoda má ještě asi 3 roky do komerčního využití; společnost, která se zabývá komerčním
využitím této metody se nazývá AKUBIO a byla založena přímo k tomuto účelu; stručně
řečeno - metoda umožňuje slyšet přítomnost viru (event. bakterií) ve vzorku (krve).
(Scientific American, české vydání, březen 2002, str. 11 – 12)
13.3. Zákalové reakce
Principem je tvorba zákalů vysrážením části plasmatických bílkovin některými činidly (thymol, ale i voda),
umožněná změnou stability plasmatických bílkovin za patologických stavů. Z řady zákalových reakcí se
nejdéle udržela (zvl. na pracovištích s infekčními klinikami) thymolová zákalová reakce (TZR), ale velmi
pravděpodobně se ani ta, už dnes nikde neprovádí.
Činidlem je nasycený vodný roztok thymolu v pufru (TRIS + kyselina jablečná), případně nasycený
alkoholický koncentrát thymolu (PLIVA-Lachema Diagnostika).
Za tvorby zákalu reagujía globuliny (je to tedy reakce pouze s uvedenými frakcemi bílkovinného
spektra plazmatických bílkovin), cholesterol a fosfolipidy, zhruba ve stejném poměru; zákal je ovlivněn
mnoha faktory (Hb, bilirubin, lipidy; teplotou, pH, iontovou silou apod.)
Standard: Suspenze síranu barnatého v kyselině sírové a chloridu barnatého
připravená za přesně definovaných podmínek (objem, koncentrace, teplota, čas).
Výsledek udávaly tzv. Shankovy a Hoaglandovy jednotky: S-H, většinou
v rozsahu 0 – 20, vyšší hodnoty se uváděly „> 20“]
Klinické poznámky:
Pozitivita reakce vypovídá o změnách ve složení plazmatických bílkovin při nemocech jater, ledvin, kostní dřeně, plic,
bakteriální endokarditidě, aj
OH
CH3 CH3
Užitečné internetové adresy:
Přehled imunoanalytických metod např. na adresách:
http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/BAM/old/Imunometody.pdf
http://che1.lf1.cuni.cz/html/imuno.pdf
Elektroforetické techniky:
http://www.sci.muni.cz/LMFR/proteomika2005/Bi8202_2005_ELFO.pdf
http://sweb.cz/biochemie/x/metody/elektroforeza.htm
http://www.pmfhk.cz/Prednasky/separacni_metody.pdf
Obsáhlý atlas proteinové elektroforézy
http://www.google.cz/url?url=http://www.pathology.ecu.edu/Public/faculty/epbookpict.pdf&rct=j&sa=X&ei=lAXsT7XDLI
WW-wa2w-
20BQ&ved=0CHUQ2wQ4KA&q=elektrofor%C3%A9za+b%C3%ADlkovin&usg=AFQjCNHkhcBZMwUcg367T0qnjt1F
PCLuLw
Biočipové technologie:
http://www.randox.com/Biochip%20Immunoassays.php
Imunochemický a biochemický analyzátor:
http://www.drg-diagnostics.de/65-1-Equipment+DRGHYBRiDXL.html
Thymol
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-40
13.4. Stručné shrnutí kapitoly
 V lidském těle se nachází značný počet různých druhů a forem proteinů, které se liší jak ve
funkcích, tak ve významu pro organismus. Z hlediska klinické biochemie jsou zvláště zajímavé
bílkoviny krevní plazmy.
 Asi 50% bílkovinného obsahu plazmy tvoří albumin, asi 20% IgG a dalších 20% víceméně
1-antitrypsin, C3 a haptoglobin. Zbývajících 10%
obsahu tvoří Lp(a) a ApoA1 (největší podíl), ApoB (o něco méně) a menší množství faktor H,
cerulopasmin, C4, komplement faktor B, C8, C9, C1q a prealbumin.
 Bílkoviny krevní plasmy udržují onkotický tlak, transportují řadu látek, chrání organismus před
infekcí, zajišťují hemokoagulaci a fibrinolýzu, fungují jako enzymy a inhibitory enzymů, některé
disponují i některými speciálními funkcemi, např. ochranou před volnými radikály.
 Nízká hladina plazmatických bílkovin, hypoproteinémie, svědčí o špatném nutričním stavu pacienta,
nedostatečné tvorbě bílkovin (albumin u těžkých hepatopatií), ztrátě bílkovin močí (albumin při
nefrotickém syndromu), nebo o převodnění pacienta.
o Hypoglobulinémie, nedostatek imunoglobulinů, fyziologicky u novorozenců, vrozené
dysgamablobulinémie či agamaglobulinémie s poruchami buněčné imunity, resp. s těžkými
poruchami bakteriálními infekcemi
 Hyperproteinémie může nastat při dehydrataci jedince a při zvýšení koncentrace jedné nebo
několika málo bílkovin, např. u monoklonální či polyklonální hepyrimunoglobulinémie.
o Hyperimunoglobulinémie,
 polyklonální, s protilátkami různých typů,
 monoklonální, s imunoglobuliny s těžkými řetězci jednoho typu a lehkými řetězci
jednoho antigenního typu, produkty jednoho kmene proliferujících buněk blymfocytové
řady
 primární, autonomní transformace a proliferace plazmatických buněk,
 sekundární, mají původ v autoimunních, infekčních, metabolických a
toxických onemocněních.
 Kvantitativně se bílkoviny stanovují
o V séru jako tzv. celková bílkovina, nejčastěji biuretovou reakcí. Referenční metodou je
stanovení podle Kjedahla.
o V moči jako celková bílkovina fotometricky s pyrogalolovou červení nebo turbidimetricky
benzetoniumchloridem.
o Jednotlivé bílkoviny v séru i v moči imunochemicky, pomocí specifické protilátky.
 Kvalitativně v moči denaturací kyselinou sulfosalicylovou, případně diagnostickým proužkem na
principu proteinové chyby acidobazického indikátoru.
 Elektroforéza v agarózovém gelu nebo na foliích z acetátcelulózy, rozděluje plazmatické bílkoviny
do frakcí, podle jejich mobility v homogenním, stejnosměrném elektrickém poli, v prostředí
příslušného pufru. Frakcí je většinou 5 – 6, tzn. frakce albuminu, homogenní frakce s jedním typem
bílkoviny a frakce globulinů, označované a1, a2, b1, (b2) a g.
 Výsledný obrazec po vizualizaci, tj.intenzita a sytost vybarvení a velikost jednotlivých frakcí
poskytuje tzv. elektroforetické typy. Z tohoto elektroforetického typu, lze usuzovat na stav
organismu, či na určitou chorobu: akutní zánět, chronický zánět, chronickou hepatopatii, nefrotický
syndrom, malnutrici, monoklonální hyperimunoglublinémii, některé vzácnější nálezy, např.
bisalbuminémii.
 Imunochemické metody jsou založeny na principu reakce mezi antigenem a specifickou protilátkou.
Jsou to vysoce citlivé a specifické metody vhodné k průkazu i stanovení jednotlivých bílkovin krevní
plazmy.
o Antigen je vysokomolekulární látka schopná vyvolat tvorbu protilátek.
o Epitop je část molekuly antigenu, která se váže ve vazebném místě protilátky.
o Hapten je nízkomolekulární látka, která nemůže vyvolat tvorbu protilátek, ale která
s protilátkami může reagovat.
o Protilátky, imunoglobuliny, jsou bílkoviny, které specificky reagují s antigenem. Mají danou
strukturu složenou z těžkých a lehkých řetězců, dělí se do pěti tříd. Samy mohou působit
antigenně a vyvolat proti sobě tvorbu protilátek.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-41
o Antiséra jsou séra s obsahem specifických protilátek proti příslušnému antigenu. Bývají
 Monovalentní, s jednou protilátkou proti konkrétní bílkoviny
 Polyvalentní, s protilátkami proti mnoha bílkovinám.
 Protilátky mohou být
o Monoklonální, z jednoho klonu buněk, s uniformní strukturou bez variant, s jednou třídou
řetězců H a jedním typem řetězců L, vysoce specifické pro jeden epitop na multivalentním
antigenu.
o Polyvalentní, z více klonů buněk, směs reagující se stejným antigenem, ale s různými
epitopy.
 Výsledkem reakce mezi antigenem a protilátkou může být zákal, vazba beze změny koloidního
stavu, aglutinace a precipitace.
 Imunoprecipitační reakce může obecně probíhat v gelovém prostředí nebo v roztoku. Na
imunoprecipitační reakci probíhající v gelovém prostředí, imunodifúzi, je založena celá řada metod,
kvalitativních (dvojitá radiální imunodifúze, imunoelektroforéza, protisměrná imunoelektroforéza) i
kvantitativních (jednoduchá radiální imunodifůze, elektroimunodifúze, tandemová technika, křížová
imunoelektroforéza). A další.
 Imunochemické metody provozované na biochemických analyzátorech běžně využívají
imunoprecipitační reakci v roztoku. Tato reakce má svá úskalí, která názorně popisuje
Heldebergerova křivka.
 Heldebergerova křivka je graf závislosti hodnoty signálu (turbidance) na vzrůstající koncentraci
antigenu, při konstantní koncentraci protilátky. Tato křivka se ohýbá (hook efekt), tzn., že pro různé
koncentrace antigenu (nízkou a vysokou) existuje jedna hodnota signálu. V praxi může dojít
k mylnému vyhodnocení reakce jako negativní, při vysoce pozitivní koncentraci antigenu. Obranou
proti tomuto omylu je např. vyhodnocení stability vytvořeného precipitátu, tj. vyhodnocení tzv.
prozonu, či prozon efektu: při nadbytku antigenu se výsledný precipitát rozpouští, což analyzátor
zaznamená jako pokles hodnoty signálu v čase.
 Turbidimetrické imunochemické metody používají pro stabilizaci precipitátu (suspenze) v roztoku
polyetylénglykol (PEG). Metod jsou
o PETIA, zesílení turbidance pomocí mikročástic
o PETINIA, zeslabení turbidance inhibicí tvorby komplexu
o PENIA, nefelometrické stanovení zákalu jehož tvorba byla zesílena mikročásticemi.
 Principem ligandových technik je opět reakce antigenu s protilátkou. Jeden z reagující dvojice je
značen (radioizotopem, enzymem, fluorescenční látkou, chemiluminiscenční látkou), druhý z dvojice
je vázán na pevnou fázi (stěnu jamky, stenu zkumavky, mikročástici).
 Ligandové techniky se dělí podle
o značení (nálepky, label) na RIA, EIA, FIA, CLIA atd.,
o uspořádání na kompetitivní a nekompetitivní,
o nutnosti oddělit vytvořený komplex antigen-protilátka na heterogenní a homogenní.
 HAMA protilátky mohou způsobit falešnou negativitu i pozitivitu testu (sendvičová analýza)
 Multipexové technologie umožňují provedení několika testů v „jedné zkumavce“.
 Moderním zástupcem multipelxových technologií je např. xMAP technologie. Principem jsou
obecně ligandové techniky, kdy ligandem může být protilátka, nukleová kyselina, enzym, nebo
dvojici tvoří receptor a ligand. Provedení je na mikrodestičkách nebo plně automatizované
s využitím průtokového cytometru.
 Dalším principem multiplexových technologií je využití mikroarrayí, či čipů (biočipů). Biočip je malá
destička s navázanými protilátkami (případně antigeny), čip tak připomíná „soubor metod“, protože
lze současně stanovit několik metod, čili panel např. tumorových markerů.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-42
13.5. Stručné opakování z obecné biochemie
Peptidická vazba (speciální případ vazby amidické)- vazba mezi aminoskupinou jedné aminokyseliny a
karboxylovou skupinou druhé aminokyseliny: vzniká amid = peptid
R1-CH-CO-OH + HN-CH-CO-OH R1-CH-CO-NH-CH-CO-OH + H2O
    
NH2 H R2 NH2 R2
dipeptid
Peptidy – amidy kyselin, acylaminokyseliny (glycylglycin, glycylalanin, alanylglycin atd.); do 10
aminokyselin– dipeptid, tripeptid, ......, nonapeptid, dekapeptid
Oligopeptidy - nad 10 aminokyselin
Polypeptidy - větší množství aminokyselin (neostrá hranice)
Proteiny (makropeptidy, bílkoviny) – nad 100 aminokyselin
Přirozeně se vyskytující peptidy:
 Glutathion (-glutamylcysteylglycin): zúčastňuje se redoxních
pochodů
 Peptidové hormony:
- pankreatu (insulin, glukagon)
- hypothalamu (thyoliberin)
- hypofýzy (ACTH, ocytocin, vasopresin)
 Antibiotika: penicilin, gramicidin, azaserin, chloramfenikol,
aktinomycin, valinomycin
 Jedy: falloidin (7 aminokyselin), amanitin – jedy z hub
Bílkoviny (z řeckého  = zaujímám první místo): 100 až několik tisíc aminokyselin
 Jednoduché bílkoviny
- skleroproteiny: (fibrilární bílkoviny),:nerozpustné, vláknitá struktura, podpůrné a strukturní látky
(kolagen, keratin, elastin)
- sféroproteiny (globulární bílkoviny): rozpustné ve vodě či solných roztocích, kulovité molekuly, dělí
se na histony, albuminy a globuliny
 Složené (konjugované) bílkoviny
- metaloproteiny
- fosfoproteiny
- lipoproteiny
- nukleoproteiny
- glykoproteiny
- chromoproteiny
Primární struktura = pořadí (sekvence) aminokyselin v bílkovinném řetězci, je dána geneticky
Sekundární struktura = způsob uspořádání bílkovinného řetězce
- struktura skládaného listu
- -šroubovice (-helix)
- mnoho proteinů obsahuje obě tyto struktury
Terciární struktura = způsob uspořádání řetězce v prostoru
Kvartérní struktura = způsob složení molekuly z bílkovinných podjednotek
(srovnej např. se strukturou hemoglobinu)
Poznámka: Sekundární, terciární a kvartérní struktura se někdy zahrnují pod pojem konformace řetězců
Vazby, které drží konformaci řetězců
 vodíkové můstky (nejdůležitější vedlejší valence): např. CO HN
 disulfidická vazba (nejdůležitější hlavní valence): cys – S – S – cys
 iontové vazby (např. histidinové zbytky mohou tvořit komplex se zinkem [Zn
2+
], který stabilizuje
dvojitou molekulu aj.)
 hydrofobní vazby (uvnitř molekul)
Fyzikální a chemické vlastnosti proteinových molekul
O
NH2
CH3
O
NH
CH3
OH
O
NH2
ONH
OH
O
NH2
NH2
ONH
NH
O
NH
OH
Fenylalanylglycin
Lysyltryptofanylglycin
Alanylalanin
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-43
Bílkoviny tvoří pravé roztoky (monodispersní), tj. v roztoku jsou přítomny jednotlivé molekuly – velikost
molekul však odpovídá velikosti agregátů molekul koloidů – některé vlastnosti roztoků bílkovin jsou proto
shodné s vlastnostmi polydispersních roztoků (koloidních roztoků) anorganických či organických látek.
Sol – název pro roztok globulárních bílkovin o normální viskozitě
Gel – název pro gelovité roztoky o velké viskozitě, či pro rosoly: vláknité a niťovité makromolekuly jsou
navzájem zesíťovány a v meziprostorách je voda
Denaturace – strukturní změny v molekule bílkoviny, při nichž dochází ke ztrátě biologických vlastností,
snižuje se rozpustnost a mění se chemické a fyzikální vlastnosti
Příprava čistých bílkovin a zkoumání jejich čistoty
Příprava
Nejstarší separační metodou bílkovin je zřejmě srážení, které může probíhat nevratně (ireverzibilně) či
vratně. Při reverzibilním srážení lze nepoškozené bílkoviny znovu převést do roztoku a dále je zkoumat.
Nevratné srážení slouží k odstranění balastních bílkovin.
Srážení
- ireversibilně za denaturace (kyselina trichloroctová, chloristá, octan uranylu)
- reversibilně neutrálními solemi (síran amonný, síran sodný, síran hořečnatý) nebo organickými
rozpouštědly (alkohol, aceton)
Výbornou dělicí technikou je i chromatografie, především chromatografie vylučovací (na molekulových
sítech), případně kombinovaná s elektroforézou (izoelektrická fokusace apod.) a moderní HPLC (High
Performance Liquid Chromatography; viz též kapitola 19, str. 19-11).
Po objevu polyakrylamidového gelu jako výborného nosiče pro různé typy elektroforetického dělení, se
zařadila mezi klasické separační metody bílkovin v biologickém materiálu dvourozměrná polyakrylamidová
elektroforéza.
K detekci rozdělených bílkovin se používají citlivé barvicí a fluorescenční metody.
Moderní metody jsou složitější. K detekci a kvantifikaci proteinů slouží Automatizovaná tandémově
hmotnostní spektrometrie za použití ICAT reagencií (Isotope Coded Affinity Tags – izotopy značené afinitní
tagy; tag = nálepka, značka, visačka, ocásek, poutko, označení). Stručný popis (v angličtině) této metody
lze nalézt např. na adrese: http://dir.niehs.nih.gov/proteomics/emerg2.htm. Stručné schéma hmotnostního
spektrometru je v kapitole 8..
Dalším systémem umožňujícím detekci, kvantifikaci a navíc i sekvenaci (určení pořadí aminokyselin v
peptidu) vybraných peptidů je hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/
ionization quadrupole time-of flight mass spectrometry - ionizace laserem za přítomnosti matrice [MALDI]
v kombinaci s detektorem doby letu [TOF]). Stručný popis metody (v češtině) je možno nalézt na adrese
http://www.vesmir.cz/clanky/clanek/id/1008.
Zkoumání čistoty bílkovin
je možné za použití např. těchto metod: chromatografie, elektroforetické metody,sérologické metody aj.
Chromatografické metody
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-44
Poprvé popsal principy (adsorpční) chromatografie ruský vědec M.S.Cvět roku 1905, kdy zkoumal a dělil barvy květů
(!). Protože dostával krásné barevné skvrny, nazval metodu chromatografie (v řečtině chróma znamená barva a grafein
znamená psát).
Fyzikálně-chemicky se jedná o
postupné ustavování fázových rovnováh součástí analyzované směsi mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze,
které jsou relativně vůči sobě v pohybu
(obecně: jedna fáze je stacionární – bez pohybu, např. oxid hlinitý, celulóza, druhá je mobilní – kapalina či plyn).
Podle charakteru mobilní fáze se dělí chromatografie na chromatografii
 kapalinovou a
 plynovou.
Podle uspořádání lze rozlišovat chromatografii
 sloupcovou čili kolonovou
 papírovou
 na tenké vrstvě.
Dalším rozlišením je rozdělení podle dělicího principu.
Dělicími principy jsou
 koeficient rozpustnosti (rozdělovací chromatografie)
 koeficient adsorpce (adsorpční chromatografie)
 velikost molekuly (vylučovací či permeační chromatografie, též zvaná chromatografie na
molekulových sítech, či gelová chromatografie)
 výměna iontů (iontově výměnná či ionexová chromatografie)
 vazba na ligandy - malé molekuly vázající se na určitý protein (afinitní chromatografie; typ adsorpční
chromatografie).
Podle podmínek provedení se rozeznává chromatografie
 izokratická (za konstantních podmínek)
 gradientová (mění se např. iontová síla, pH nebo složení elučního/vymývacího pufru).
Za zmínku stojí ještě separační chromatografie, využívaná i v průmyslovém měřítku pro (kvantitativní)
přípravu různých látek.
Výčet metod není úplný.
Některé pojmy ze spektrofotometrie
Absorbance: ,
tzn., absorbance je definována jako logaritmus podílu intenzity světla do roztoku vstupujícího a intenzity
světla z roztoku vystupujícího.
Turbidance: ,
kde r = střední poloměr částic,  = vlnová délka primárního záření, k = konstanta závislá na měřicím uspořádání, c =
koncentrace látky, d = vzdálenost od pozorovatele,  = turbiditní koeficient pro koncentraci “c“ v molech/l a pro danou
teplotu. Průběh je lineární pouze pro velmi zředěné roztoky a v omezeném rozsahu.
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-45
13.6. Kontrolní otázky
1. Jaký význam mají bílkoviny krevní plazmy?
2. Jaké jsou metody stanovení celkových bílkovin? Liší se nějak jejich použití z hlediska
zpracovávaného systému (typu vzorku)? Jak? Dokázali byste vybrat vhodnou metodu podle
zpracovávaného materiálu?
3. Která metoda je referenční pro stanovení celkových bílkovin, jak se jmenuje, jaký je její princip?
4. Dokážete si uvědomit co alespoň přibližně znamená nález s koncentracemi celkových bílkovin mimo
referenční meze? Jak se tyto stavy nazývají?
5. Co je to elektroforéza, jak se rozděluje, co je principem? Jak se dělí bílkoviny krevní plazmy/krevního
séra při rutinní elektroforéze (např. na agarosovém gelu)?
6. Jste schopni stručně definovat pojem „elektroforetický typ“? K čemu slouží?
7. Víte které bílkoviny se nacházejí v jednotlivých frakcích a jaké mají vlastnosti?
8. Jaký je princip imunochemických metod? Jaká je jejich základní kladná vlastnost?
9. Dokážete definovat pojmy „protilátka“, „antigen“, „epitop“, „hapten“. Je vám jasný rozdíl mezi
„monovalentním“ a „polyvalentním antisérem“, mezi „monoklonální“ a „polyklonální protilátkou“?
10. Jaká prostředí se používají pro imunochemická stanovení na principu imunoprecipitační reakce?
11. Rozumíte Heldebergerově křivce? Co vyjadřuje? Dokážete popsat jednotlivé oblasti a podat k tomu
komentář? Co je to kritický bod? Co to znamená pro laboratorní praxi a jak se vyrovnat s touto
vlastností imunochemických metod?
12. Dokážete vystihnout podstatu jednotlivých imunochemických metod (v gelovém prostředí)
popsaných v tomto textu? K čemu byste tyto metody použili? V jakém vztahu k těmto metodám (z
hlediska indikace vyšetření) je elektroforéza zmíněná v otázce č. 5?
13. Víte proč některé metody obsahují ve svém názvu pojmy „western“ „southern“ apod.? Má to vztah ke
světovým stranám?
14. Chápete rozdíl mezi metodami „PETIA“ a „PETINIA“? Co je to za metody?
15. Jaký typ metod jsme si popsali pod pojmem „vazebné testy“? Chápete rozdíl mez „soutěživým“ a
„nesoutěživým“ uspořádáním? Jaký je rozdíl mez „heterogenní“ a „homogenní“ metodou?
16. Jaký je rozdíl v použití fluorescenční látky v metodě MEIA a FPIA? Obě používají fluorescenci,
přesto se každá jmenuje jinak. Proč?
17. Jaký je význam mikročástic v těchto testech? Proč „magnetické“ částice?
18. Na jakém principu je založena CLIA? Pochopili jste průběh LOCI?
19. Co je to TRACE technologie?
20. Jak funguje CHEMIFLEX?
21. Co jsou to multiplexové technologie?
22. Pochopili jste xMAP technologii?
23. Jak chápete pojem „biočip“, „biomikroarray“ apod.?
24. Zopakujte si, co jsou to vlastně bílkoviny, jaké mají vlastnosti atd.
25. Dokážete stručně a jasně definovat pojem „absorbance“?
Klinická biochemie Kapitola 13. Bílkoviny
Pavel Nezbeda 13-46
OBSAH:
Kapitola 13 Bílkoviny ................................................................................................................................... 13-1
13.1. Bílkoviny krevní plazmy.................................................................................................................. 13-1
13.1.1. Význam bílkovin krevní plazmy.............................................................................................. 13-1
13.1.2. Metody stanovení celkových bílkovin .................................................................................... 13-2
Stanovení celkových bílkovin podle Kjeldahla ........................................................................... 13-2
Fotometrické stanovení bílkovin podle Folina ............................................................................ 13-3
Stanovení bílkovin biuretovým činidlem ..................................................................................... 13-3
Stanovení bílkovin přímou fotometrií při 280 nm........................................................................ 13-3
Turbidimetrické stanovení bílkovin............................................................................................. 13-3
Stanovení bílkovin s využitím vazby barviva na bílkoviny.......................................................... 13-3
13.1.3. Klinické poznámky .................................................................................................................. 13-3
13.1.4. Elektroforéza bílkovin.............................................................................................................. 13-4
13.1.5. Jednotlivé bílkoviny krevní plazmy.......................................................................................... 13-7
13.2. Imunochemické metody stanovení bílkovin ................................................................................. 13-11
13.2.1. Úvod...................................................................................................................................... 13-11
13.2.2.Imunoprecipitační reakce v gelovém prostředí...................................................................... 13-15
Metody založené na dvojité imunodifúzi (kvalitativní metody)..................................................... 13-15
Metody založené na jednoduché imunodifúzi (kvantitativní metody) ........................................... 13-15
Stručné popisy jednotlivých metod ............................................................................................... 13-16
Dvojitá radiální imunodifúze podle Ouchterlonyho................................................................... 13-16
Imunoelektroforéza................................................................................................................... 13-17
Imunofixace .............................................................................................................................. 13-17
Western blotting (přenos) ......................................................................................................... 13-18
Protisměrná imunoelektroforéza .............................................................................................. 13-19
Jednoduchá radiální imunodifúze ........................................................................................... 13-19
Elektroimunodifúze................................................................................................................... 13-20
Dvojrozměrná čili tzv. křížová neboli překračující imunoelektroforéza .................................... 13-20
13.2.3.Imunoprecipitační reakce v roztoku ....................................................................................... 13-20
Turbidimetrie................................................................................................................................. 13-21
PETIA............................................................................................................................................ 13-21
PETINIA........................................................................................................................................ 13-22
13.2.4. Vazebné testy (ligandové techniky) ...................................................................................... 13-22
Jednotlivé metody ............................................................................................................................. 13-26
Radioimunoanalýza (RIA)............................................................................................................. 13-26
Enzymoimunoanalýza (EIA) ......................................................................................................... 13-27
EMIT: Enzym immunoasssay technique .................................................................................. 13-27
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assays ....................................................................... 13-28
MEIA: Microparticle Enzyme Immuno Assay ........................................................................... 13-28
Fluorimetrické metody (FIA) ......................................................................................................... 13-29
FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay ...................................................................... 13-29
TRACE: Time Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE technologie).......................... 13-30
Luminiscenční metody.................................................................................................................. 13-31
LOCI: Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (Technologie LOCI™) ...................... 13-31
CMIA: Chemluminescent Magnetic Immunoassay (ChemiFlex® technologie) ....................... 13-33
ECL, ECLIA: Elektrochemiluminiscence ................................................................................. 13-33
Multiplexové technologie .............................................................................................................. 13-35
xMAP technologie .................................................................................................................... 13-35
Mikroarraye a biočipy ............................................................................................................... 13-36
13.3. Zákalové reakce ........................................................................................................................... 13-39
13.4. Stručné shrnutí kapitoly................................................................. Chyba! Záložka není definována.
13.5. Stručné opakování z obecné biochemie ...................................................................................... 13-42
13.6. Kontrolní otázky............................................................................................................................ 13-45