Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Kapitola 22 DNA diagnostika lidských choro V pondělí 26. června 2000 bylo uskutečněno satelitní spojení mezi Bílým domem ve Washingtonu a Downing Street v Londýně, aby Bili Clinton a Toni Blair spolu se špičkami zúčastněných vědců oznámili světu, že byl uskutečněn největší objev století, a to přečtení celého lidského genomu. Předcházelo tomu desetiletí usilovné práce vědců prakticky celého světa, soustředěných převážně do dvou velkých, soupeřících skupin, které ovšem směřovaly k jednomu cíli a také jeho dosažení společně oznámily. Lidstvo si od detailního poznání genetické skladby člověka hodně slibuje. S geny je spojována řada chorob, od mozkových nádorů, přes nádory kostí, prsů, vaječníku, tlustého střeva, plic, leukémie, cukrovku, astma, hypertenzi, srdeční choroby, prionové choroby (nemoc šílených krav), klasické genetické choroby jako jsou talasemie či cystická fibróza, po Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu, mentální retardaci, schizofrenii a mnohé další. Změny v genech kódujících povrchové receptory T-buněk vedou ke snazšímu nebo naopak obtížnějšímu pronikání virů (např. HIV) do buněk, jiné změny v genech vedou k rozdílným schopnostem jedinců, některé změny v určitých genech mohou vést i k asociálnímu chování postiženého individua. Poslední výzkumy naznačují, že „zakódovány" jsou i mužský a ženský způsob chování a jednání i celková kognitivní (poznávací) schopnost, neboli obecná inteligence. Naskýtá se zde tedy široké pole působnosti jak na poli farmacie při hledání nových účinných léků, tak na poli molekulární biologie usilující o detekci příslušných genů, ale i o „nápravu" pozměněných genů, ať už ve smyslu vyléčení choroby či vylepšení jedince. V celém tomto procesu se uplatnily a uplatňují metody dále popsané v této Tonv Blair kapitole a další, zde neuváděné a jistě se uplatní i jiné, které na svůj vývoj teprve čekají. Lidstvo se díky těmto technikám a úsilí badatelů dostalo do „postdarwinovské" éry, kdy nebude muset čekat na přirozený vývoj a bude moci žádané vlastnosti a úpravy (lidského druhu) provádět samo. Zde ovšem nastupuje nutně otázka, zda je na tuto etapu vývoje dostatečně zralé. Věda, techniky a metodiky samy o sobě nejsou špatné, ale mohou být špatně použity. A zde je volné místo pro uplatnění etiky a morálky. Nová vědní odvětví, rozšiřující původní genomiku (nauku o genech), se týkají zejména analýzy funkce genů - funkční genomika a struktury příslušných proteinů - strukturnígenomika. V tomto „postgenomovém" období se posiluje význam proteomiky, která by měla zodpovědět otázky týkajících se významu a úlohy jednotlivých proteinů, čili, měla by vést k porozumění stovkám tisíců proteinů zakódovaných v lidských genech. Navíc, jak se ukazuje, není úloha genů tak fatální, jak by se na první pohled mohlo zdát. Příroda si umí (většinou) poradit i ve velmi svízelných situacích. Velmi důležitá je totiž i následná činnost po syntéze proteinu (posttranslační činnost, tj. jeho „úprava"). Významnou roli hrají zejména metylace, jak je zmíněno na str. 22-10, kterými může organismus podstatně změnit vlastnosti vyprodukované bílkoviny, případně ji zcela vyřadit z činnosti. 22.1. Nukleové kyseliny Crick s Watsonem publikovali svůj názor na strukturu deoxyribonukleové kyseliny (DNA, DeoxyriboNucleic Acid), původem z buněčného jádra, v sobotu 25. dubna 1953, v časopise Nature. Ukázalo se, že jejich názor byl správný a tato práce otevřela široké pole působnosti badatelům v oblasti, kterou je zvykem nazývat molekulární biologie. Během následujících let byly vyvinuty techniky, které umožnily poznat detailně strukturu DNA a RNA (RiboNucleic Acid, ribonukleová kyselina, další nukleová kyselina), poznat mechanismy přenosu genetické informace, regulace buněčné diferenciace a proliferace i odchylky v jejich funkci během nádorového bujení, mechanismy životních pochodů mikroorganismů, patologické procesy spojené s invazí infekčních mikroorganismů, umístění a složení genů i identifikaci genů odpovědných za genetické choroby. Tyto techniky bylo možno posléze přenést ze základního výzkumu a aplikovat je do běžné praxe v oborech jako jsou medicína či kriminalistika, ale také do zcela nového odvětví, zvaného genetické inženýrství, které umožňuje např. získávat v dostatečném množství proteiny, za běžných okolností se vyskytujících v minimálních množstvích a tudíž obtížně získatelných, i kombinace genů, které by se v přírodě pravděpodobně vůbec nikdy nevyskytly. Nové technologie těží informaci přímo z molekuly nukleové kyseliny. Pavel Nezbeda 22-1 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Podstatný pokrok zaznamenala zhruba před 35 léty technologie nejčastěji nazývaná technologií rekombinantní DNA; ta učinila z dříve velmi obtížně analyzovatelné DNA poměrně snadno analyzovatelnou makromolekulu a dává molekulárním biologům spoustu možností, např.: vyštěpit z určitého genomu oblast DNA, která obsahuje požadovaný gen, prakticky neomezeně namnožit tento gen v přesných kopiích, zjistit jeho nukleotidovou sekvenci, pozměnit izolovaný gen požadovaným způsobem, vrátit pozměněný gen zpátky do buněk a o zkoumat jeho funkci, nebo o začlenit ho do genomu rostliny nebo živočicha tak, aby se stal jeho funkční a dědičnou součásti. Gen je možno z genomu živé buňky i vyřadit a tak zjistit jeho funkci v buňce. Technologie rekombinantní DNA našla uplatnění i mimo vědecké a výzkumné laboratoře molekulárních biologů. V běžném životě je to např. ve formě teplotně stabilních proteáz získaných metodami genového inženýrství, které tvoří běžnou součást pracích prášků, v kriminalistice a forenzní medicíně při identifikaci osob, ve farmacii v produkci různých farmaceutických látek (inzulin, faktor VIII) apod. Zcela logicky si našla i své místo v medicíně, kde tyto metody, založené na analýze nukleových kyselin, umožňují lépe pochopit podstatu onemocnění a dávají lékaři do rukou výborný diagnostický i terapeutický prostředek. " I Nova technika zde našla uplatněni • v diagnostice virových, bakteriálních, mykotických a parazitárních onemocnění (detekce patogenů), • v prenatální a postnatální diagnostice dědičných chorob (detekce mutací), • v diagnostice nádorových chorob (genové exprese) a • v identifikaci (DNA typizaci) osob pro účely transplantační nebo forenzní (genotypizace). _ Pochopení dále popsaných technik předpokládá poznání základních vlastností nukleových kyselin. I když zmiňované je předmětem obecné biochemie, základní informace si uvedeme i v tomto textu. C-3' J OH OH HO ribóza O^ 22.2. Základní vlastnosti nukleových kyselin Nukleové kyseliny jsou molekuly, jejichž struktura a uspořádání v chromosomech určují genetické vlastnosti organismu.Technologie diagnostiky DNA a RNA byly umožněny poznáním základních vlastností nukleových kyselin. DAM je složitý biopolymer (přesněji: biokondenzáf) uspořádaný do dvoušroubovice. Základní organizační jednotkou je sekvence (= pořadí) purinových (A=adenin, G=guanin) a pyrimidinových (C=cytosin, T=thymin) bází, které jsou připojeny k cukru deoxyribose (v pozici C-1') a báze jsou spolu spojeny fosfodiesterovou vazbou mezi 3'- a 5'- pozicemi svých cukerných zbytků. Střídání deoxyribózových a fosfátových skupin tvoří páteř dvojité šroubovice. Tyto 3'-5'vazby určují také orientaci vlákna molekuly DNA. Na obrázku na straně 22-3 je ukázán princip stavby nukleosidů a nukleotidů, základních stavebních kamenů nukleových kyselin. Rovněž je naznačeno párování bází a jsou uvedeny čtyři nukleotidy. V DNA jsou vždy dvě vlákna přiložena k sobě v navzájem obráceném směru, jsou antiparalelní. Adenin a thymin a guanin s cytosinem tvoří navzájem páry, spojené vodíkovými můstky. Tyto páry bází se nazývají komplementární, obsah adeninu je stejný jako obsah thyminu a obsah guaninu je stejný jako obsah cytosinu (Chargaffovo pravidlo). Párování bází a podélné hydrofobní interakce drží dvě vlákna DNA pohromadě. Interakce C-G tvořená třemi vodíkovými můstky je pevnější než interakce A-T, tvořené pouze dvěma vodíkovými můstky (viz obrázek). Interakce lze zrušit zahříváním DNA, nebo změnou koncentrace solí, případně změnou pH, což vede k denaturaci a oddělení vláken. Při pozvolném návratu k původnímu stavu (např. pozvolném snižování teploty roztoku) se opět dvě komplementární vlákna DNA spojí uspořádaně. Míra párování nebo nepárování může být stanovena podle teploty potřebné k denaturaci/renaturaci: oblasti DNA s vyšším stupněm uspořádání bází vyžadují k denaturaci vyšší teplotu. (Tato reakce je základem hybridizace). Aby DNA zabrala v jádře buňky minimum místa, je pomocí mnoha proteinů, z nichž nejvýznamnější jsou bazické proteiny zvané histony, sbalena do kompaktní struktury. Takto se DNA o délce asi 1m pohodlně směstná do objemu několika krychlových mikrometrů. V RAM je místo thyminu uracil [U], místo deoxyribózy je ribóza a na rozdíl od DNA je jednovláknová. Pavel Nezbeda 22-2 OH OH » deoxyribóza adenin thymin Bez CH3- = uracil Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Principy stavby nukleových kyselin Princip stavby nukleosidů a nukleotidů Princip výstabvy řetězce: - cukr - fosfát - cukr - fosfát - OH fosfát + cukr + base = nukleotid 0=P^O-1 cukr + base = nukleosid Princip párování bází Pyrimidiny i puriny obsahují ionizovatelné funkční skupiny, takže se mohou vázat pomocí vodíkových vazeb, vodíkových můstků. Adenin (A) a thymin (T) jsou poutány dvěma vodíkovými můstky, cytozin (C) a guanin (G) jsou vázány třemi vodíkovými můstky. Vazba C-G (G-C) je pevnější než vazba A-T (T-A), resp. pro rozpojení vazeb C-G je třeba více energie (je zapotřebí vyšší teplota), než pro rozpojení vazeb A-T. Schémata iontových vazeb jsou na obrázcích. Gen a genom Určitá část molekuly DNA, sekvence nukleotidů popisující určitou vlastnost, se nazývá gen, soubor všech genů je genom. Celý genom člověka sestává z přibližně 30 - 35 tisíc genů, což představuje asi 3x109 párů bází. Ačkoliv každý druh i každý jedinec má v řetězci své nukleové kyseliny jedinečné, unikátní, tzv. cílové sekvence, které jej odlišují nejen od ostatních druhů, ale i od ostatních jedinců stejného druhu (podobně jako papilární linie na prstech rukou), přesto řada sekvencí (od virů a bakterií, přes rostliny a živočichy až po člověka) je totožná. Tak genom člověka a šimpanze je shodný z 98% a shoda dvou lidí je dokonce 99,9%. K odlišnosti dvou jedinců stačí 0,1% genomu (!). Nalezení charakteristických sekvencí nukleových kyselin v biologickém vzorku umožňuje identifikovat původního nositele: lze stanovovat viry, bakterie, kvasinky atd., diagnostikovat infekční choroby, určovat genetické poruchy plodu, genetické poruchy vedoucí k malignímu množení buněk a tkání (onkológie), lze snáze řešit paternitní a maternitní spory a identifikovat jedince (forenzní diagnostika v soudním lékařství atd.). Pavel Nezbeda 22-3 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Syntéza DNA Při předávání genomu dceřiné buňce při buněčném dělení, musí se DNA zdvojit, replikovat, složitým procesem za účasti specifických proteinů a enzymů. Rodičovská dvoušroubovice se rozdělí a ke každému rodičovskému vláknu je syntetizováno dceřiné vlákno enzymem polymeráza III, který z rodičovské templátové [template = šablona, matrice, vzor] kyseliny odečítá pořadí nukleotidů a podle toho přiřazuje správné nukleotidy (podle zásad párování bází) do dceřiné části molekuly. Tento způsob zmnožení DNA se nazývá semikonzervativní způsob replikace. Do dceřiných buněk takto přejdou molekuly DNA, z nichž každá obsahuje jedno vlákno rodičovské a jedno vlákno nově syntetizované dceřiné molekuly DNA. Replikace DNA vedoucí řetězec ■ kontinuální replikace | Okazakiho fragmenty j j diskontinuální replikace: vždy 150-250 nukleotidů otálející /váznoudí /opožďující se řetězec » celkový směr replikace rodičovský řetězec DNA nově se syntetizující řetězec DNA Řetězce DNA tedy vykazují určitou polaritu, danou směrem syntézy = ligáza spojující Okazakiho fragmenty Rozvinutí a oddělení řetězců zajišťuje enzym helikáza. K zahájení vlastní syntézy DNA je potřeba krátká RNA (o10-200 nukleotidech) zvaná primer [výslovnost = prajme], kterou syntetizuje enzym primáza, a která je později z DNA odstraněna nukleázou a nahrazena odpovídajícím úsekem DNA pomocí opravné polymerázy. Růst obou řetězců probíhá současně, a to směrem 5'-* 3', čili ve směru fosfodiesterové vazby od 5. uhlíku deoxyribózy předchozího nukleotidu ke 3. uhlíku deoxyribózy následujícího nukleotidu. DNA polymeráza, odpovědná za růst řetězce, dokáže totiž navazovat pouze na alkoholickou skupinu na třetím uhlíku, a proto také potřebuje již zmíněný primer, který tuto skupinu nabídne. Zatímco na tzv. vedoucím řetězci probíhá syntéza bez problémů kontinuálně, na druhém, otálejícím řetězci, probíhá syntéza diskontinuálně, protože se po úsecích vždy zpolymeruje 150 - 250 nukleotidových fragmentů, tzv. Okazakiho fragmentů (stále ve směru 5'-» 3'; viz obrázek dole). Fragmenty jsou spojovány pomocí enzymu ligázy. Celá situace na otálejícím řetězci je o to složitější, že syntéza každého fragmentu musí být nastartována separátním primerem, který je ve chvíli, kdy DNA polymeráza dosyntetizuje řetězec až k němu odbourán nukleázou, opravná polymeráza doplní vzniklou mezeru nukleotidy a nakonec je fragment připojen k předcházejícímu fragmentu ligázou. Tyto podrobnosti na obrázku nejsou uvedeny. Pavel Nezbeda 22-4 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Pro zvídavé studenty, replikace DNA, podrobnější obrázek (Zdroj: Wikipedie) KepiiKace UNA; zde u eunaryot, aie situace je poaoona i u proaaryot DNA Pnmáza Helikáza Enzym, při pohybu podél DNA rozvíjí dvoušroubovicové struktury, k tomu využívá energii z hydrolýzy ATP Topoizomeráza Enzym ze skupiny izomeráz, umožňuje měnit terciární strukturu DNA (tzv. supercoiling či superhelix), tj. nadšroubovicové vinutí, což je dodatečné vinutí již vytvořené dvoušroubovice (primární a sekundární struktura tímto enzymem ovlivněny nejsou). Topoizomeráza dohlíží při replikaci DNA na to, aby se v replikační vidlici při rozmotávání vlákna DNA pomocí helikáz zbývající vlákno příliš neutáhlo (natolik, že by již nešlo rozmotat). SSB proteiny (single-strain binding proteins), vazebné proteiny pro jednoduché řetězce, zabraňují odděleným vláknům znovu se spojit Primáza Enzym, vytvářející úseky RNA dlouhé přibližně deset nukleotidů, které se párují s templátovým řetězcem (slouží jako primer) a poskytují svůj 3'- konec jako začátek pro DNA-polymerázu, která umí pouze připojovat nové nukleotidy k již spárovaným nukleotidům, ale nedokáže začít syntetizovat nové vlákno. DNA-polymeráza Enzym syntetizující nové vlákno DNA podle původního řetězce, katalyzuje připojování nukleotidů na 3'- konec rostoucího řetězce, kdy je vytvářena fosfodiesterová vazba mezi skupinou 3'- OH řetězce a 5'- fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu (k zahájení syntézy nespárovaných nukleotidů vyžaduje primázu). Ligáza Enzym spojující Okazakiho fragmenty. Tzv. ústřední dogma molekulární biologie vychází z modelu znázorněného vpravo: • Genetická informace je uložena v jádře v DNA ve formě genů, sekvencí nukleotidů, úseků DNA, které se po vhodném impulzu (a rozvinutí DNA) procesem obdobným výše popsané replikaci DNA, kopírují do RNA, která přechází do cytoplazmy. • ZRNA jsou odstraněny nekódující sekvence (tzv. sestřih) a • na ribozomech je přečtena vložená informace o skladbě proteinu a jsou syntetizovány příslušné proteiny (exprese čili vyjádření genu). Pavel Nezbeda 22-5 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Pavel Nezbeda 22-6 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob RNA Vyjádření (exprese) genetické informace se realizuje v prvním stupni syntézou mRNA a dále syntézou bílkoviny (enzymu, protilátky, strukturního proteinu, apod.). Ve zkratce probíhá tento děj tak, že se příslušné místo na DNA (gen) templátového řetězce (tj. toho, který nenese přímou informaci o struktuře bílkoviny, přímou informaci nese kódující řetězec) okopíruje do RNA (mRNA, messenger RNA, mediátorová RNA), což je jednovláknová nukleová kyselina „konstruovaná" podle stejných zásad jako vlákna DNA s tím rozdílem, jak již bylo uvedeno, že místo cukru deoxyribózy je v RNA ribóza a místo thyminu je v RNA báze uracil. Kopírování se děje prakticky stejně, jako replikace DNA: k příslušnému místu na DNA se komplementárně vytvoří (nasyntetizuje) RNA, která se posléze odpojí. Principy párování jsou stejné (adenin-uracil, cytozin-guanin). Tuto „pracovní kopii", která představuje stavební plán bílkoviny, tj. pořadí aminokyselin v molekule proteinu, dokáže aparát proteosyntézy v buňce přečíst a podle ní „sestrojit" příslušnou bílkovinnou makromolekulu. Důležitou okolností je, že mRNA než opustí jádro je „sestřižena" (nick), tzn., že jsou z ní odstraněny část řetězce rna, která obsahuje, na rozdíl od tzv. introny (úseky nenesoucí genetickou informaci), mezery a dna, ribózu a uracil, molekula je jednovláknová promotory (místa, kde začíná syntéza DNA), tedy je kratší než původní úsek DNA a obsahuje pouze potřebné kopie genů. 22.2.1. Polymorfismus DNA Výraz polymorfismus pochází z řeckých polys, mnohý a morte, tvar. Znamená tvarovou pestrost, mnohotvárnost, různotvarost. Polymorfismus DNA odkazuje na vzájemnou odlišnost DNA uvnitř druhu. Polymorfismus DNA může být délkový a sekvenční. Názvy naznačují, že se bude jednat o různorodost v délce konkrétního úseku homologní DNA či o změnu v pořadí nukleotidů v konkrétním úseku DNA, především v genu. Polymorfní gen je gen, který se v lidské populaci vyskytuje ve více formách, tzv. alelách. Produktem polymorfních genů jsou i polymorfní proteiny. Lze tedy analyzovat jak proteiny, tak nukleovou kyselinu (viz dále sekvenční polymorfismus). Genetické vyšetření je však citlivější, rozliší jemnější rozdíly, má větší informační hodnotu a je méně závislé na stáří a kvalitě vzorku, než vyšetření proteinů. S rozvojem molekulárně genetických praktik se postupně (od zhruba poloviny 80. let) přechází od analýzy proteinů na analýzu DNA. Polymorfní však mohou být i úseky DNA nekódující proteiny, proto tento typ polymorfismu je detekovatelný pouze na úrovni DNA (viz VNTR). Délkový polymorfismus Délkový polymorfismu může mít svůj původ v opakování krátkých motivů (sekvencí nukleotidů), které těsně nasedají k sobě, tzv. VNTR (variable number of tandem repeats - variabilní počet tandemových opakování). Tato opakování lze nalézt v různých místech lidského genomu, typicky v nekódujících místech (introny, mezerníky). Počet opakování bývá 4 - 40, typický počet nukleotidů v motivu bývá uváděn 2-50 párů bází. Poznámka: Podrobnosti je třeba hledat v předmětu genetika. Obecně se rozlišují klasická satelitní DNA, mini- a mikrosatelitní DNA, rozlišené počtem bází v sekvenci. Mikrosatelity obsahují 2-10 párů bází, které se opakují, minisatelity jsou delší, obsahují 20 - 100 párů bází. Termínu „mikrosatelity" odpovídají i používané termíny „Short Tandem Repeat (STR)" a „Simple Sequence Repeat (SSR)". VNTR jsou mezi mikro- a minisatelity. Sekvenční Náhrada jednoho nukleotidu jiným v přesně určené sekvenci DNA VNTR Variabilní počet tandemových opakování Bodová mutace a j. mechanismy Změna restričkního místa bodovou mutací, delecí, inzercí... Pavel Nezbeda 22-7 Klinická biochemie Kapitola 22. dna diagnostika lidských chorob VNTR zřejmě vznikly díky chybám při rekombinaci nebo replikaci DNA. Existuje vysoká pravděpodobnost, že jedinec získá, díky variabilitě těchto sekvencí v populaci, různé VNTR oblasti od každého z rodičů, a že dvě nepříbuzné osoby nebudou mít tyto oblasti stejné. Je tedy soubor krátkých tandemových repeticí pro jedince (kromě jednovaječných dvojčat) unikátní. Na tomto polymorfismu jsou založeny některé metody genetické individuální identifikace (tzv. profilování DNA), využitelné např. v kriminalistice. Variabilní tandemové repetice lze • odštěpit pomocí restričkních enzymů (srovnej dále RFLP na str. 22-9 a 22-11) nebo • amplifikovat polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). V obou případech pak následuje gelová elektroforéza, po které většinou následuje Southernův přenos (Southern blotting), jehož součástí je hybňdizace se sondou (.wzstr.22-13). Sonda s fragmentem hybridizuje, pokud je délka fragmentu se sondou komplementární. Tak se zjistí délka fragmentu. Délkový polymorfismus restrikčních míst způsobený VNTR I | I II II II II II II I | I I |......... I | I I = reštrikční místo I I = tandemová repetice I I = cílový segment detekovatelný sondou Alely obsahují v okolí cílové oblasti tandemové repetice v různém počtu, v jednom případě je to šest repeticí, v druhém případě pouze čtyři. Po štěpení příslušnou endonukleázou bude v druhém případě ziištěn kratší fragment (do elektroforéze a vizualizaci pomocí sondv). Příklad využití délkového polymorfismu v kriminalistice Současně používaným lokusem v kriminalistice je lokus známý jako TH01, který obsahuje opakování bází T-C-A-T. Tento lokus existuje ve více variantách, alelách, známo je jich nejméně 20. V tomto myšlenkovém pokusu uvažujeme variantu TH01. Na následujícím schématu jsou uvedeni čtyři jedinci, A,B,C a D s různým počtem opakování tohoto lokusu: jedinec A zdědil od jednoho svého rodiče deset opakování TH01, od druhého tři opakování tohoto lokusu; jedinec B zdědil pět a dvě opakování, jedinec C sedm a tři a jedinec D deset a dvě opakování TH01. Opakující se sekvence TCAT (tj. lokusu TH01) je na schématu znázorněna obdélníčkem. VNTR TH01 jedinců A, B, C, D i-li-li-li-li-1 C I-1 I-1 C IL 1 11-1 C I-II-II-II-II-1 I-1 I-II-II-II-II-1 I-1 I-1 I-1 A10/3 B5/2 C7/3 D10/2 (opakující se) sekvence nukleotidů TCAT (lokus TH01) Vzorky od těchto jedinců a vzorek kriminalistického zájmu se podrobí PCR, případně působení restrikčních enzymů (viz dále) a vzniklá směs se rozdělí pomocí gelové elektroforézy. Současně se elektroforeticky rozdělí i alelový standard, který obsahuje různé délky (opakování) požadovaných sekvenci. Po vizualizaci elektroforeogramu se z rozložení jednotlivých frakcí vyloučí podezřelí, případně určí pachatel. Pavel Nezbeda 22-8 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Elektroforéza tandemových opakování AS KV B Wide Mini-Sub Cell GT Ukázka elektroforetické vany pro elektroforézu v agarosovém gelu firmy Bio-Rad AS = alelový standard KV = kriminalistický vzorek A, B, C, D = čtyři podezřelí Červená barva ukazuje shodu podezřelého C s kriminalistickým vzorkem PowerPac Universal Power Supply Univerzální zdroj k elektroforetické vaně, fy Bio-Rad Délkový polymorfismus může mít svůj původ i v bodové mutaci, jejímž následkem je změna restríkčního místa v DNA, a výsledkem jsou nestejně dlouhé štěpy u různých (jednodruhových) DNA při použití stejné endonukleázy. Podstata tohoto druhu délkového polymorfismu spočívá v posunu restrikčního místa, takže kromě bodové mutace připadají v úvahu jako příčiny změny restrikčního místa i další mechanismy, např. inzerce, delece, translokace a inverze. V tomto případě se hovoří o délkovém polymorfismu restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP, srovnej též na str 22-11). Délkový polymorfismus restrikčních míst způsobený změnou restrikčního místa Segment detekovatelný sondou C Na horním schematickém obrázku úseku DNA (alela A) sou naznačena tři restričkní místa 1, 2 a 3. Spodní obrázek (alela a) reštrikční místo 2 postrádá, došlo zde k mutaci. Výsledek působení restrikčního enzymu bude u obou alel různý.V případě rodičů s těmito genotypy AA, aa, Aa (všechny možné kombinace), genotyp potomků může být: AA, Aa, aA, aa (všechny možné kombinace). Elektroforetický obrazec může vypadat např. takto (vlevo možní rodiče, vpravo možní potomci): Sekvenční polymorfismus Sekvenční polymorfismus spočívá v náhradě jednoho nukleotidu jiným v přesně určené sekvenci DNA, případně ve vyřazení nukleotidu z této sekvence, nebo naopak vmezeření nukleotidu do této sekvence. Příkladem jsou krevní skupiny, alely v HLA systému, isoenzymy, apod. A*24032 AAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAG A*2418 AAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCATG AGGCGGAGCAG V uvedeném příkladu je zobrazen krátký úsek DNA dvou HLA alel (HLA-A*24032 a HLA-A*2418), kde je zvýrazněno místo v sekvenci, lišící se v jednom nukleotidu (T-A). Metodika vyšetřování tohoto typu polymorfismu může vycházet jak z exprese genu (viz uvedený příklad), tak z genetické analýzy (jak bylo uvedeno na začátku tohoto odstavce). Pavel Nezbeda 22-9 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Single nucleotide polymorphism (SNP) je jednoduchý sekvenční polymorfismus, kde jednotkou typizace není alela, ale nukleotid na přesné pozici v chromozomu. V současné době má využití „tandemový" SNP při zjišťování trisomií plodu z krve těhotné ženy. 22.3. Principy práce s nukleovými kyselinami 22.3.1. Izolace a čištění (purifikace) nukleových kyselin Zdrojem pro izolaci DNA bývají, podle zamýšleného účelu, jádra leukocytu z krevních vzorků, buňky ústní sliznice nebo vlasové kořínky, mohou to být i spermie apod. Krevní vzorky je nutno nejpozději do 3 hodin zmrazit a skladovat při teplotě -70 °C. Při izolaci DNA je třeba rozbít membrány (buněčnou, jadernou), nejčastěji použitím detergentů a převést DNA do roztoku. Oddělí se lipidy, proteiny a ostatní složky buněčného obsahu a DNA se získá precipitací (např. alkoholem, izopropanolem aj.). Celý proces je kombinací laboratorních postupů, jako je hemolýza, centrifugace, homogenizace a použití různých detergentů. Podobně RNA se získává z rozbitých buněk ultracentrifugací, extrakcí, případně precipitací (např. alkoholem, izopropanolem aj.). Čistota získaných preparátů se kontroluje spektrofotometrií při dvou vlnových délkách: 260 nm (absorbují nukleové kyseliny) a 280 nm (absorbují kontaminující proteiny). Při malých množstvích nukleových kyselin se používá fluorimetrie s ethidiumbromidem. Kontrola celistvosti získané DNA se provádí elektroforézou na agarózovém gelu. 22.3.2. Použití restrikčních enzymů Endonukleázy, také nazývané reštrikční enzymy, štěpí DNA mezi určitými sekvencemi uvnitř molekuly.. Endonukleáza Štěpená sekvence Výsledné štěpy Zdroj (mikrob) Bam HI i G G AT C C C CTAG G í G G AT C C C C T AG G Bacillus amyloliquefaciens H Hpal I GTTAAC CAATTG í GTT AAC CAA TTG Haemophilus parainfluenzae Eco Rl I G AATTC CTTAAG í G AATTC C T T A A G Escherichia coli RY13 Hhal I GCGC CG CG í G CG C C G C G Haemophilus haemolyticus Haelll I GGCC CCGG í GG CC CC GG Haemophilus aegyptius Alul i AG CT TCGA t AG CT TC G A Arthrobacter luteus Notl I GCGGCCGC CGCCGGCG t GC GGCCGC CGCCGG CG Nocardia otitidis Hindlll I AAGCTT TTCGAA í A AG C TT T T C G A A Haemophilus inphluenzae Taq I i TCGA A G C T í TC G A AG CT Thermus aquaticus YTI Směr čtení horního vlákna: 5'-> 3' HPal, Haelll, Alul, Taql: tvoří štěpy s tzv. tupými konci Směr čtení spodního vlákna: 3'<- 5 Hi, Eco Rl, Hhal, Notl, Hindlll: tvoří se štěpy s tzv. přesahujícími konci Poznámka: pro „přesahující konce" se používá i pojem „lepivé konce". Pavel Nezbeda 22-10 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Hydrolyzují fosfodiesterové vazby v nukleových kyselinách. Tvoří součást enzymového vybavení bakterií. Jimi se bakterie brání proti cizorodým DNA, které náhodně pronikly do jejich vnitřního prostředí. Jsou pojmenovávány podle bakterií, z nichž byly izolovány: Eco Rl je z Escherichia coli, Bam Hl je z Bacillus amyloliquefaciens (první písmeno označuje rod, další dvě písmena druh, může následovat označení kmene a římská číslovka označující pořadí objevu). Každý enzym rozeznává specifickou sekvenci dvouvláknové DNA dlouhou 4-7 párů bází a štěpí ji na různě dlouhé úseky, fragmenty, podle individuálního pořadí nukleotidů a rozpoznané sekvence. Štěpy lze izolovat (identifikovat a analyzovat) elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Díky skutečnosti, že štěpení probíhá vždy na charakteristických místech DNA, lze sestavit tzv. reštrikční mapy a rozlišovat různé DNA, protože počet i délka fragmentů jsou pro daného jedince specifické. Mnohé ze specifických sekvencí patří mezi tzv. palindromické sekvence (palindrom je slovo nebo výraz, které se čte stejně zepředu i pozpátku a dává stejný smysl, např. radar, kajak, krk, nepochopen, 999 apod.). Palindromické sekvence v DNA jsou dvojího typu: • zrcadlová sekvence, např. GTAATG, tato sekvence se čte s obou stran stejně na jednom řetězci DNA (jednovláknová DNA), anebo to jsou • komplementární sekvence, které se čtou stejně z obou stran, ale každá na jiném řetězci DNA (dvouvláknová DNA). Tyto sekvence jsou známější a mají větší biologický význam, než zrcadlové sekvence, protože reštrikční enzymy se obvykle vážou jako homodimery (komplex tvořený dvěma, obvykle nekovalentně vázanými makromolekulami, v daném případě endonukleázami), dochází tak k odštěpení nukleotidových párů. Příklady komplementárních sekvencí jsou uvedeny v tabulce na předcházející straně. K dělení fragmentů DNA se používá gelová eíektroforéza, která tyto fragmenty rozdělí podle velikosti. Dělení fragmentů DNA gelovou elektroforézou 5% 10% 15% 4-20% Větší fragmenty 3,000 ;1,500 1,000 , xo- 300 0.000 1.500 1,000 .Min 1,500 Menší fragmenty Horní část Směr dělení Dolní část Na obrázku jsou ukázány polyakrylamidové gely o různé koncentraci (5%, 10%, 15% a tzv. gradientovy gel o koncentraci 4-20%, umožňující dělení fragmentů nukleových kyselin o velikostech od 50 do 1 750 nukleotidových párů. Současně je naznačen způsob dělení jednotlivých fragmentů. (Propagační materiál fy Bio-Rad). Vizualizaci fragmentů je možno provést vazbou fluorescenční látky na DNA (fluorescence fragmentů v U V světle, podobná technika je užita např. v tzv. FISH technice, viz obr na str. 22-13), případně začleněním radioaktivně značených nukleotidů do DNA - např. radionuklidu 32P, který se zavede ještě před štěpením do DNA ve formě fosfátu (srovnej s tabulkou na str 22-39, polynukleotidová kináza). Tento p-zářič lze detekovat např. pomocí autoradiografie (po přiložení fotografického filmu na povrch gelu v něm dochází k expozici způsobené zářením a po vyvolání se objeví obrazce poloh jednotlivých fragmentů, viz. obrázek na str. 22-16). Firma Bio-Rad také používá speciální barvivo DNA, Fast Blast™ (což je ukázáno na vedlejším obrázku vpravo). Nej obvyklejším postupem vizualizace fragmentů je, jak již bylo zmíněno, Southern blotting, který využívá různé typy vizualizace, např. hybridizační sondy. 7 x 10 cm ReadyAgarose* gel runs in the Mini-sub" cell GT cell Pavel Nezbeda 22-11 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Kombinacemi štěpení různými endonukleázami se získají různé fragmenty a výsledkem jejich porovnání jsou, jak již bylo také zmíněno, tzv. reštrikční mapy. Jejich pomocí je možno od sebe odlišit blízce příbuzné. Reštrikční enzymy sehrály zásadní roli v mapování genomu, v poznávání genového polymorfismu atd. Metoda charakterizace DNA s využitím štěpení homologních molekul DNA endonukleázami na fragmenty, kdy jednotlivé alely jsou charakterizovány velikostí získaných štěpů, je známa jako RFLP (vyslovováno „rif-lip", restriction fragment length polymorphism - délkový polymorfismus restrikčních fragmentů, resp. polymorfismus délek restrikčních fragmentů). Metoda RFLP, využívající reštrikční enzymy, patřila mezi důležité nástroje mapování genomu, lokalizace genů zodpovědných za genetické choroby, určení rizika chorob i paternitních testů. Navíc, byla to první, relativně levná, široce používaná metoda DNA typizace ve smyslu genetických otisků prstů (DNA profilování, DNA testování), která našla své uplatnění zejména ve forenzní (soudní) vědě, kde byla nápomocná při identifikací jedinců pomocí jejich DNA profilů. S rozvojem oboru, zejména technik sekvenování DNA, byly v současnosti zavedeny do praxe lepší metody pro daný účel. Fragmenty, získané cíleným štěpením restrikčními enzymy, lze využít dále při tvorbě chimérních neboli rekombinantních DNA a při klonování. Celkový počet použitelných endonukleáz je asi 1500. Několik příkladů spolu se zdrojem, štěpenou sekvencí a výslednými štěpy je uvedeno v tabulce na str. 22-10. Vedle restrikčních enzymů se nacházejí v bakterii i místně specifické DNA-metylázy, které metylací chrání DNA před napadením vlastními endonukleázami. V některých případech je naopak metylace pro štěpení endonukleázami nezbytná. Znalost restrikčních endonukleáz citlivých na metylaci se uplatňuje v diagnostických studiích u řady onemocnění. 22.3.3. Chimérní DNA, klonování a rekombinantní proteiny Štěpy, získané pomocí restrikčních endonukleáz je možno navzájem (cíleně) spojovat různým způsobem, např. s několikrát se opakující sekvencí. Vznikají tak umělé molekuly, které se nazývají chimérní [chimaira, ř. - ve starořeckých bájích obluda s částmi těla Iva, draka, kozy], případně rekombinantní molekuly. Do molekuly lze vnést také konkrétní reštrikční místo, jehož pomocí je možno následný fragment snadno izolovat a použít k dalším účelům. Testují se možnosti využití chimérních a plazmidových DNA k léčbě nádorů (tvorba vakcín). Přípravu velkého množství identických molekul DNA umožňuje klonování. Za pomoci endonukleáz a DNA-ligáz (enzymů spojujících fragmenty DNA, viz tabulka v dodatku na str. 22-38) je v tzv. klonujícím vektoru vytvořena chimérní (či rekombinantní) DNA, do které je včleněn fragment DNA, který je předmětem zájmu. (Paul Berg, Nobelova cena za chemii v roce 1980). Klonující vektory jsou • plasmidy bakterií (plasmid je malá kruhová dvouvláknová DNA, která má některé vlastnosti velmi vhodné pro vnášení cizích úseků DNA do své molekuly); plasmid není součástí bakteriálního chromozomu a je schopen replikace nezávisle na něm; existuje mnoho druhů plasmidů, některé z nich jsou schopné iniciovat bakteriální konjugaci a přenos DNA (viz dále v textu) • kosmidy (plasmidy, do kterých mohou být vneseny velké fragmenty DNA) • lineární molekuly DNAfágů (fágy obsahují obvykle lineární molekulu DNA, do níž může být vložena cizí DNA, na různých místech štěpitelnou restrikčními enzymy). Po zpětném vložení vektoru (procesem zvaným transformace) do hostitelské buňky (tj. bakterie), se s použitím jejích regulačních systémů DNA replikuje, včetně vložené cizorodé části. Tato technika umožňuje přípravu velkého počtu identických molekul DNA, které pak mohou být charakterizovány nebo použity pro další cíle (např. pro výrobu hybridizačních sond). Jak bylo uvedeno, takovýto postup se obecně nazývá klonování. Klon je velká populace identických molekul, bakterií nebo buněk, které mají společného předka. Pokud rekombinantní DNA představuje kompletní gen a jsou-li zajištěny i ostatní nutné podmínky pro syntézu proteinů (ideální případ), je syntetizován (rekombinantní) protein, který může být následně použit např. jako antigén vimunoanalýze. Proteinem může ale být i inzulin, faktor VIII apod. (genové inženýrství). Pavel Nezbeda 22-12 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Přenos genů u bakteriíje možný trojím způsobem 1. konjugací 2. transformací 3. transdukcí. Bakteriální konjugací mohou být přenášeny geny pouze u bakterií, které obsahují plasmid se schopností iniciovat konjugaci a přenos DNA (např. E.coli obsahuje tzv. F-plasmid, tj. fertility plasmid). Bakteriální konjugace je pochod, kdy dojde k zachycení bakterie druhou bakterií pomocí přívěsku (pohlavnípilus) a vytvoření cytoplasmatického můstku, kterým je přenesena do druhé buňky kopie plasmidu. Při tomto přenosu existuje DNA ve své normální formě, tj. ve vazbě s proteiny a nikdy neopouští své přirozené prostředí. U některých bakterií (E.coli) je to hlavní způsob přenosu genů. Transformace je mechanismus přenosu DNA upřednostňovaný některými bakteriálními druhy, jakým je např. půdní bakterie Bacillus subtilis. Při tomto způsobu přenosu genetické informace bakterie zachytí fragmenty DNA pocházející z jiných mrtvých a rozbitých bakterií a přenese je přes svou buněčnou membránu dovnitř buňky. Fragment bývá velmi často rekombinací začleněn do genomu bakterie a stává se jeho součástí. Výsledkem může být taková radikální změna, že výsledný efekt dává dojem „transformace" jednoho bakteriálního kmenu v jiný - odtud název pochodu. Při tomto ději se přenáší holá DNA, bez proteinů a mimo své přirozené prostředí. Transformace našla velké uplatnění v laboratorní praxi. Transdukce je způsob přenosu genetické informace zprostředkovaný bakteriálními viry, bakteriofágy. Fág injektuje svou DNA do bakteriální buňky a tzv. místně specifickou rekombinací začlení svou DNA do bakteriálního chromozomu. Za vhodných podmínek „vyštípne" svou DNA z rekombinantního chromozomu a za využití syntetického aparátu bakterie se pomnoží. Vyštípnutí se někdy děje nepřesně a součástí DNA fága se stane i část genomu bakterie, která je takto přenášena a množena dál. Shrnuto: pomocí molekulárních technik (technologie rekombinantní DNA) lze syntetizující aparát prokaryontů (organismů s buňkami s neostře ohraničeným jádrem, tj. bakterií, např. E.coli) přinutit produkovat rekombinantní proteiny. Vektory produkující rekombinantní proteiny se nazývají expresivní vektory. Tato technika může být využita i k průmyslové výrobě specifických proteinů. DVA VÝZNAMNÉ NUKLEOTIDY (s cukrem ribózou) OH OH O ADENOSINTRIFOSFÁT (ATP) CYKLICKÝ ADENOSINMONOFOSFÁT (cAMP) Pavel Nezbeda 22-13 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob 22.4. Technologie (hybridizačních) sond 22.4.1. Hybridizační sondy Hybridizační sondy jsou krátké úseky nukleových kyselin označené radionuklidem, chemiluminoforem, haptenem, antigenem nebo enzymem, které jsou schopny se specificky vázat (hybridizovat) ke komplementárním sekvencím řetězce nukleové kyseliny, jíž může být jak DNA, tak RNA. Hybridizační sondy slouží k vyhledávání charakteristických sekvencí nukleových kyselin např. virů, bakterií, plísní apod. Specializovaná pracoviště si mohou potřebné sondy vyrábět sama (syntetické oligonukleotidy), mnohé sondy jsou ovšem komerčně dostupné. 22.4.2. Metody založené na technologii hybridizačních sond Řetězce DNA jsou drženy pohromadě vodíkovými můstky, což jsou relativně slabé vazby, rozrušitelné např. změnou teploty (zahřátím na přibližně 90 °C) nebo drastickou změnou pH. Výsledkem takových činností jsou dvě oddělená vlákna, čili denaturace DNA. Pomalým odstraněním příčin denaturace dojde k renaturaci neboli hybridizaci nukleové kyseliny - vlákna se znovu spojí a dvouřetězcová struktura se obnoví. Je třeba si uvědomit, že hybridizovat mohou mezi sebou libovolné jednořetězcové molekuly nukleových kyselin (DNA/RNA, RNA/RNA, RNA/DNA), samozřejmě pouze v případě, že obsahují komplementární nukleotidové sekvence. Skutečnost, že tvorba dvouřetězcových molekul je podmíněná komplementární nukleotidovou sekvencí, umožňuje detekci specifických nukleotidových sekvencí v DNA i RNA. K tomu se právě využívají hybridizační sondy se známou sekvencí nukleotidů. V technologii hybridizačních sond je výsledkem hybridizace hybrid, tj. dvouvláknová molekula nukleové kyseliny, složená z jednoho vlákna testované nukleové kyseliny a z jednoho vlákna nukleové kyseliny představovaného (hybridizační) sondou. Jak bylo uvedeno, jednovláknové molekuly mohou být DNA nebo RNA a výsledkem mohou být hybridy DNA-DNA, DNA-RNA nebo RNA-RNA. Nejsou-li jednovláknové molekuly komplementární, hybrid se nevytvoří. Tvorba hybridu je tudíž důkazem přítomnosti hledané sekvence. Hybridizace se provádí • in situ [in situ = na původním místě, ve své poloze], . na pevných nosičích (membrány z nitrátu celulózy nebo z nylonu) a proces zviditelnění a odlišení od ostatních molekul vyžaduje ještě další analytické techniky. Souhrn těchto technik se nazývá přenos. V odborné literatuře se často vyskytuje název „blotování" (blotting). Známé techniky jsou dot, blota slot hybridizace, Southernův přenos, hybridizace RNA (northern blotting) a další • sendvičová . ve volném roztoku. Technika FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Je technika používaná k detekci sekvencí DNA v chromozomech nebo RNA sekvencí v buňkách při studiu telomer savčích chromosomů, v lékařské diagnostice např. k rozlišení tuberkulózních a netuberkulózních mykobakterií aj. Sondy jsou značené fluoresceinem a možné výsledky testování jsou vidět na obrázku. Metody značení sond jsou různé. FISH technika je kombinací klasické mikroskopie s moderní technikou hybridizačních sond. Průkaz ribozomální RNA (rRNA) bakterií FISH s PNA sondou. Detekce různých částí genomu. Vlevo byl použit zelený filtr, vpravo byl použit duální filtr. O PNA sondách viz dále v textu. Amplikony genu c-myc (červeně) a teritoria chromozómu 8 (zeleně) u buněk HT29 (DNA modře) - zdroj Pavel Nezbeda 22-14 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Dot /blot /slot hybridizace Hybridizace na membránách, určená pro detekci nukleové kyseliny upevněné na membráně. Detekce se provádí pomocí značené sondy. Názvy jsou odvozeny od tvaru jednotlivých vzorků nanesených na membránu: dot- velmi pravidelný okrouhlý tvar, slot- velmi pravidelný protáhlý tvar, blot- ručně nanesený vzorek více méně náhodného tvaru Video viz např.: httD://www.vectorlabs.com/tutorials.diSDlav.asD?id=15 Princip: DNA se extrahuje ze vzorku, denaturuje a naváže se buď adsorpčními silami na nitrocelulózovou či nylonovou membránu nebo kovalentními vazbami na papír aktivovaný m-nitrobenzyloxymethyl bromidem (srovnej též kapitola 10, sřr.10-18). K přenosu na pevný nosič se využívá i vakuum nebo elektrický proud (electroblotting), je-li pochod sám o sobě pomalý. Nenavázané nukleové kyseliny a proteiny se vymyjí a pevná fáze (papír, nitrocelulóza) se inkubuje se sondou značenu enzymem, radionuklidem apod. Po dalším promyťí a inkubací se substrátem, resp. s využitím jiné vizualizační techniky, se v případě, že hledaná nukleová kyselina je přítomna ve vzorku, objeví barevné body. Pokud byl použit radioaktivní marker, exponuje se autoradiogram. Tuto techniku lze použít i pro štěpy nukleových kyselin získaných restrikčními enzymy. (Dot-, slot- blotting lze použít i pro imobilizaci proteinu a jeho průkaz pomocí značené protilátky). c c c c G" c (i Dot- [tečka] Slot- [štěrbina, škvíra ] Sendvičová (sandwich) metoda Princip: Používají se dvě sondy: sonda navázaná na pevnou fázi a označená sonda. Analyzovaná nukleová kyselina se nejprve naváže na fixovanou sondu a následně reaguje s označenou sondou. Hodnota měřeného signálu (z označené sondy) je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. Southernův přenos (Southern blotting) Southernův přenos (a příbuzné techniky viz kapitola 10, str. 10-18) vypovídá jak o přítomnosti, tak o velikosti nukleové kyseliny hybridizující s použitou sondou, protože vlastní fixaci předchází separační technika, nejčastěji gelová elektroforéza, která rozdělí molekuly podle velikosti. Princip Southernova přenosu: DNA z jaderných tkání je pomocí endonukleáz rozdělena na fragmenty, které sice mohou mít různou délku, ale vždy začínají a končí stejnou bází (např. T na začátku a A na konci při použití Hpa I, viz tabulka Endonukleázy na str.22-9). Tyto fragmenty se rozdělí podle délky svého řetězce gelovou elektroforézou, přenesou se na nitrocelulózový proužek a nechají se hybridizovat spolu s označenou sondou. Zvolená DNA sonda je komplementární s cílovým fragmentem, tzn., že např. sonda G ATA se páruje s cílovým fragmentem C T AT. Vizualizace ethidiumbromidem je na obrázku, na str. 22-19 Southernův přenos -G T T A A C -...........-GTTAAC- T T štěpení DNA restrikčním enzymem (v daném případě Hpa I) gelová ELFO rozdělení fragmentů podle velikosti přeneseni na proužek nitrocelulózy přidání značené sondy: hybridizace I inkubace se substrátem: zviditelnění Pavel Nezbeda 22-15 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Často se jako sondy vybírají oligonukleotidy se známou sekvencí 15-25 bází. Oligonukleotid (CAC)5 má největší individualizační potenciál u lidí, protože (CAC)5 „otisky prstů" (fingerprints) jsou různé u všech lidských jedinců, kromě homozygotních dvojčat. Příbuzné techniky jsou - northernový přenos (pro RNA) a - westernový přenos (pro proteiny) - southwesternový přenos (srovnej též kapitola 13, str. 13 -18). Poznámka: Jak již bylo uvedeno v kapitole 13 na str. 13-18, jsou názvy northernový a westernový slovními hříčkami, neboť southern blotting, nazvaný po svém strůjci Edwin Mellor Southernovi v překladu znamená jižní, zmiňované techniky pak severní, západní a jihozápadní(přenos, blotting). Southernův přenos s radioaktivně značenou sondou rozštěpená DNA nylonová membrána agarózový gel alkalický roztok nylonov* membrána s DNA _r -— t,oiv:!c» autor aciiografi« PNA sondy V roce 1991 byl učiněn zajímavý objev: polymerní molekula N-(2-aminoetyl)-glycinpolyamidu může nést purinové a pyrimidinové báze, které se mohou párovat podobně jako v DNA, a to dokonce s ještě vyšší afinitou. Porovnání obou molekul a chimérní molekula PNA-DNA jsou uvedeny na obrázku. Oligomery PNA jsou svými vlastnostmi vhodné pro použití jako hybridizační sondy v různých typech molekulárně biologických laboratorních technik. Chimérní molekula PNA-DNA (zcela vlevo) a molekuly PNA a DNA NH J$f) I NH r'^F PNA chimérní molekula f \ "0 0—, DNA O-p" ■o o— Pavel Nezbeda 22-16 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Shrnutí - obecný postup při hybridizaci Denaturace analyzované nukleové kyseliny, aby poskytla jednovláknovou sekvenci nukleové kyseliny (působením alkálií či zahříváním, viz též odstavec 20.5.1.), případně ještě působení restrikčních enzymů Výběr sondy s odpovídající cílovou sekvencí. Sondy mohou být - syntetické (oligonukleotidy), - klonované (rekombinanty), nebo to mohou být - označené jednovláknové genomické sekvence T Aplikace vhodné techniky, tj. - hybridizace na membránách (dot, blot, slot, Southernovo blotování apod.), - sendvičová hybridizace, - hybridizace ve volném roztoku a následná separace hybridů od volné sondy např. pomocí hvdroxv(l)apatitu. L biometro Zařízení pro dot-blotting pomocí vakua Bližší podrobnosti viz na www.biometra.com C™ plabwirh Qů^ulls wr -5 lemperature control cur m m Řídicí teplotní křivka přístroje Termocykler Porter Na obrázcích na další straně jsou ukázány malé přístroje MyCycler Thermal Cycler a MJ Mini Thermal Cycler firmy Bio-Rad. Na obrázku na str. 9-21 je schéma přístroje LightCycIer® firmy Roche. Pavel Nezbeda 22-20 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob MyCycler Thermal Cycler a MJ Mini Thermal Cycler firmy Bio-Rad MJ Mini Thermal Cyclef MyCycler Thermal Cycler Oddělení a identifikace cílové sekvence nukleové kyseliny se provádí buď elektroforeticky s následným vybarvením frakcí, nebo se k jejímu oddělení z reakční směsi využívají biotinylované primery s avidinovým můstkem a hybridizační sondy. Poté následuje dělení elektroforézou nebo techniky sendvičové ELISA. Primery mohou být značeny radionuklidem, fluoroforem i jinak a k detekci se využívá autoradiografie nebo fluorimetrie. Hybridizační sondy slouží často jak k oddělení hledané látky, tak k potvrzení (konfirmaci) její identity. Často užívanou technikou pro identifikaci produktů PCR je gelová elektroforéza, a to na gelech agarózy (obvykle 2% gel) nebo polyakrylamidu (4-6% gel). V řadě případů lze produkt oddělit gelovou elektroforézou a zviditelnit vybarvením zón stříbrem (výsledkem jsou červené zóny) nebo ethidiumbromidem (zóny v UV světle fluoreskují). Ukázka výsledku gelové elektroforézy (vlevo) a vizualizace ethidium bromidem po agaroforéze (vpravo) s s t 1 - Ethidium bromide stained agarose gel 264 bp Vizualizace ethidium bromidem Real time PCR, řetězová polymerázová reakce v reálném čase PCR v reálném čase umožňuje bezprostřední kvantifikaci buď pomocí barviv (používají se tzv. interkalační barviva, tj. např. ethidium Termín interkalace označuje proces při němž je molekula nebo ion (host) umísťován do hostitelské mřížky. Struktura hostitelské části zůstává v komplexu host-hostitel neboli v interkalační sloučenině (interkalátu) stejná nebo pouze mírně odlišná od původního hostitele. Probíhající interkalace bývá chemicky nebo termálně reverzibilní. Často jsou používány pro interkalační reakce i jiné pojmy jako inzerce, inkluze, nebo topotaktická reakce, ale všechny spadají do výše uvedené definice. Interkalační chemie tak patří k jedné z oblastí supramolekulární (česky někdy též nadmolekulární) chemie. htto://www.uoce.cz/fcht/slchol/vvzkum/interkalacni.html interkalót Pavel Nezbeda 22-21 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob bromid), kdy se barvivo dostane mezi dvě vlákna DNA a v této formě intenzivně fluoreskuje (viz obrázek na předchozí straně), kdežto mimo tato vlákna je fluorescence barviva mizivá. Další způsob je pomocí fluorescenčně značených oligonuleotidových sond, které hybridizují určitou cílovou sekvenci uvnitř amplifikované oblasti a při této činnosti zvyšují svou fluorescenční aktivitu. Je to umožněno tím, že kromě fluorescenční látky je na sondu navázána další molekula, tzv. quencher (zhášecí molekula), která, pokud je v blízkosti fluorescenčního barviva, potlačuje jeho fluorescenci/aktivitu. Po hybridizaci, tj. rozvinutí původně svinuté molekuly, se quencher od barviva oddálí a tím mu umožní se projevit. Vše je zřejmé z následujících obrázků: Probe sequence H exam e r st e m PoLymethytone spacer Fluerophorft ».9. FAM Quencher e.g. DABCYL Oligonukleotidová sonda značená fluoroforem Vysvětlivky: probe = sonda stem = stonek, stopka,nožka spacer = rozpěrka, vymezovač, distanční vložka e.g. = např. (FAM a DABCYL jsou konkrétní látky) beacon (obr. vpravo) = maják, světelná báje target = cíl Fig, 2 Target + Molecular Beacon Hybrid ' 1 Fluoraphore Quencher Princip funkce oligonukleotidové sondy Mnohonásobná čili multiplexní real time PCR Výraz multiplexní vyjadřuje skutečnost, že je v jedné kyvetě současně amplifikováno několik odlišných úseků DNA. Používá se několik párů primem s odlišnou specifitou. Smyslem je současná detekce několika úseků nukleových kyselin, např. současná detekce více druhů mikroorganismů, společná detekce cílového genu apod. Tato forma PCR šetří čas a náklady na analýzu. Detekce je možná využitím oligonukletidových sond příslušných konkrétní amplifikované oblasti, přičemž každá příslušná sonda je označena jiným fluoroforem a fluorofory se vzájemně liší emisními spektry. Jednotlivé emise jsou odečítány v příslušných „kanálech" a platí teze „jeden kanál - jeden cíl (target)". Toto paradigma (vzor, příklad, model, určitý vzor vztahů, vzorec myšlení) je překonáno novými technikami, o nichž bude zmínka v Dodatku. Multiplexové analýzy se již osvědčily v medicínské praxi (např. během pandemie chřipky způsobené v roce 2009 virem H1N1, při genotypizaci BCR-Abl u leukémie dospělých a při detekci příčinných/kauzálních patogenů sepse). Multiplexové analýzy však přinášejí i některé problémy a jsou určitým způsobem omezeny. Problémem jsou např. nespecifické amplifikace. PCR je vysoce citlivá metoda náchylná k přenosu (carry over) rozmnožených cílových sekvencí z jednoho vzorku do druhého, pracuje se proto v oddělených prostorách (příprava vzorku, vlastní PCR a identifikace cílové sekvence nukleové kyseliny), ve flow-boxech, s různým personálem. Místnosti i přístroje jsou průběžně sterilizovaný gama-zářením, UV-zářením příp. chemickými prostředky. Existují i jiné prostředky na potlačení kontaminace, např. záměna aktivovaného thyminu v reakční směsi za aktivovaný uridin, což spolu s enzymem uracil-N-glykosylázou znemožňuje replikaci „nesprávné" nukleové kyseliny s kyselinou obsahující uridin. Metoda (PCR) dovoluje namnožit a analyzovat (úseky) DNA z jediné buňky, z vlasového váčku nebo spermatu. Z toho je zjevné její využití v soudním lékařství. Řetězová reakce se také používá • k detekci infekčních agens • v prenatální genetické diagnostice • k detekci alelického polymorfismu (amplifikace u metod RFLP, VNTR, STR, viz odstavec 22.4.) • k přesnému určení typu tkáně pro transplantaci • ke studiu evoluce s použitím DNA z archeologických nálezů • v základním výzkumu • další oblasti jejího využití se jistě ještě objeví. Pavel Nezbeda 22-22 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Schéma přístroje LightCycIer® firmy Roche (se čtyřmi „kanály" pro jednotlivá světla) Air heating and cooling for rapid temperature ramping Carousel with capacity for 32 samples Stepper motor to position samples over optics Thermal chamber Fan Sealed 20 uL sample capillary with superior surface-to-volume ratio Maintenance-free LED light source Photohybrids Microvolume fluorimeter with Rodenstock quality optics Stepper motor to position fluorimete Slovník k obrázku: Heating coil = topná spirála Stepper motor to position sampes over optics = krokový motor k posunu vzorků nad optiku Thermal chamber = vyhřívaná komůrka Fan = větrák Photohybrids = fotonásobiče Maintenace-free LED light source = bezúdržbový LED zdroj světla Microvolume fluorimetr = mikroobjemovýfluorimetr Stepper motor to position fluorimeter = krokový motor pro nastavenífluorimetru Sealed 20 u.1 sample capillary with superior surface-to-volume ratio = utěsněná 20 /J vzorková kapilára s vynikajícím poměrem povrch/objem Carousel with capacity for 32 samples = karusel s kapacitou pro 32 vzorků. Air rating and cooling for rapid temperature ramping = ohřívací a chladicí vzduch k rychlému nastavení teploty Existuje řada modifikací PCR: „nested" PCR, [nested = vnořená smyčka, vnořený cyklus], kdy templátem je produkt reakce předcházející asymetrická PCR (umožňuje syntézu jenom z jednoho vlákna z dvojice vláken DNA SSPR (single strandproducing reaction = reakce produkující jednotlivé/jednoduché řetězce) již zmíněná multiplexová reakce používaná k testování mnoha delecí a bodových mutací v jedné amplifikační reakci analýza heteroduplexů používaná k detekci mutací genetických onemocnění AS-PCR (alelově specifická PCR) pro detekci bodových mutací a malých delecí ARMS (amplifikační refrakční mutační systém) - varianta AS-PCR se stejným použitím PSM (PCR - mediated site directed mutagenesis, zprostředkovaná řízená mutagenese během PCRJ, metoda pro identifikaci specifických alel umělou změnou sekvence (dojde k vytvoření nového nebo zániku původního restrikčního místa pro endonukleázu) během PCR RACE, metoda rychlé amplifikace cDNA konců pomocí PCR a některé jiné. Podrobnosti o těchto a jiných metodách viz např. na adrese http://www.lf2.cuni.cz/Proiektv/prusa-dna/newlook/defa6.htm Pavel Nezbeda 22-23 38 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Řetězová ligázová reakce (LCR, LAR) a ligázová detekční reakce (LDR) Řetězová ligázová reakce je alternativní amplifikační technikou k PCR. Je určená k detekci stopových množství DNA o známé sekvenci. Původně byla (v roce 1980) popsána jako ligázová amplifikační reakce (LAR). Je to amplifikační metoda určená především pro automatizaci. Může se kombinovat s PCR či jinými metodami a může být přímo použita k detekci bodových mutací (LDR). Hlavní charakteristiky LCR ve srovnání s PCR jsou: • PCR používá dva primery, aby získala tři části informace - přítomnost cílové sekvence - délka sekvence - sekvence mezi primery • LCR používá čtyři primery, aby získala dvě části informace - přítomnost sousedící cílové oblasti - perfektní komplementaritu primem na jejich vazebných stranách Princip: LCR vychází z replikace DNA in vivo, tj. jak probíhá v živém organismu, konkrétně z principu otálejícího řetězce (wzobr.na str. 22-5.). K pokrytí cílové sekvence DNA se použijí dva sousedící páry primem. Každý z těchto primem je komplementární k jednomu vláknu DNA. Po navázání primem na vlákno DNA a dosyntetizování asi 10 nukleotidů ve směru 3'—>5'(vyplnění mezery mezi primery) spojí ligáza přítomná v reakční směsi vždy druhý primerz obou párů primem s prvním. Spojené páry primem tvoří základ pro další replikaci, což vede k exponenciálnímu nárůstu cílové sekvence. Na obrázku je znázorněna první fáze LCR, kdy z původních dvou vláken DNA vznikají čtyři vlákna. Řetězová ligázová reakce ligáza z reakční směsi ligáza z reakční směsi A-denaturace dvojvlákna DNA, pokrytí cílové sekvence dvěma primery B-vyplnění mezery mezi primery (max. 10 nukleotidů) a spojení druhého primem s prvním příměrem Aby ligáza mohla spojit sousedící primery, je potřeba, aby na místě spojení primem bylo dokonalé párování bází. Tato reakce je vhodná k detekci okamžitých množství DNA, tj. virů a bakterií. Podmínka dokonalého párování bází v místě spojení primem ligázou, pro úspěšné proběhnutí LCR, může být využita pro detekci bodových mutací (LDR). V tomto případě se v oddělených reakčních směsích používají primery s „divokou" tj. přirozenou a „mutantní" sekvencí. Mutantní sekvence primem se může párovat pouze s mutantní sekvencí testované DNA a divoká sekvence primem se může vázat pouze s divokou sekvencí testované DNA. V rutinní praxi se primery spojují pomocí „můstku" (jako je biotin a podobné látky) s fluorescenčními barvivy, takže navázaný produkt může být elegantně detekován. Poznámka: MUDr. Emil Pavlík, z jehož článků uveřejněných v časopise Labor Actuell fy Roche bylo v této práci také čerpáno, řadí LAR do amplifikačních technik hybridizačních sond: Molekulárně biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku - část 6, MUDr. Emil Pavlík, Univerzita Karlova, 1. LF UK, Ústav pro lékařskou mikrobiologii Praha; viz též poznámka I na str. 22-32. Faktem je, že takto se dá namnožit cílová sekvence pro hybridizační sondu. Reverzně transkripční řetězová polymerázová reakce (RT-PCR) PCR amplifikuje DNA, přitom řada virů má pouze RNA a PCR v předložené podobě nelze použít. Pro přímý průkaz virů byla vyvinuta RT-PCR, která využívá vlastností enzymu reverzní transkriptázy získané z retrovirů: tento enzym „umí" přepsat RNA do DNA, označované cDNA (copyDNA). Je to polymeráza závislá na RNA a použije-li se mRNA (viz str. 22-7) jako sonda, je možné přepsat (kopírovat, copy) mRNA Pavel Nezbeda 22-24 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob do dvouvláknové cDNA. Po tomto přepisu následuje PCR. Reverzní transkriptáza je využita i v jiných technikách, např. v dále popsaných NASBA/3SR aj. Transkripčně-amplifikační systém (TAS, Transcription-based Amplification System) TAS je metoda vyvinutá pro detekci charakteristické oblasti RNA viru HIV-1. V první fázi reakce se pomocí reverzní transkriptázy syntetizuje podle virové RNA komplementární řetězec DNA (cDNA), který pak slouží jako templát pro syntézu (transkripci, přepis) RNA, což je umožněno RNA polymerázou z bakteriofága. Bylo popsáno, že tato technika umožňuje zjistit jednu infikovanou buňku v populaci 106 neinfikovaných buněk. Self-sustained sequence replication (NASBA, 3SR) • NASBA = Nucleic Acid Sequence Based Amplification • 3SR = Self-sustained sequence Replication (sebepodporující, autopodporující, sekvenční replikace) Jedná se v principu o stejné techniky pocházející ze dvou nezávislých zdrojů. V podstatě jde o přírodní replikačníproces retrovirů realizovaný in vitro. Je to metoda určená především k amplifikaci RNA, ale dá se použít i pro amplifikaci DNA. Jak je vidět z následujícího obrázku (viz^dále odkazy na tento obrázek vpravo vedle něho), akce se zúčastňují tři enzymy, a to O reverzní transkriptáza,\/T7 RNA polymeráza a ZA RNáza H. Schéma NASBA/3SR 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 RNA původni 5" ONA RNA puvodni r DMA RNA původní DNA primár B htvhhjwh m ^ ^ ___ PM DNA 5 RNA původní j- DNA 5 RNA původní DNA I DNA DNA DNA o. I_I TT FfWiůEflr RNA \S\j^ DNA o Revorini lr;irvjkri|j lasa T7 RNA polymerátů sekvence T7 promotér RNAsa H Krok 1 a 2: Cílová RNA (červená vlnovka) je reverzní transkriptázou s využitím primem A přepisována do cDNA (černá vlnovka) Krok 3: Další enzym, RNáza H, současně deštruuje původní (cílovou) RNA (rozpadlá červená vlnovka) Kroky 4,5 a 6: Reverzní transkriptáza, která má polymerázovou aktivitu, syntetizuje, s využitím primem B (krátká černá vlnovka vlevo dole u č. 4), komplementární vlákno k DNA . Kroky 7 a 8: Tato DNA má cílovou sekvenci RNA, ze které třetí enzym, T7 RNA polymeráza může (s T7 promotérem) syntetizovat mnoho nových kopií RNA. Kroky 9 až 13: Tyto nové kopie jsou opět převedeny na cDNA atd. Takto může dojít během 2-3 hodin k nárůstu 1012 (bilionkrát zvětšené množství startovního materiálu, tj. RNA, což je cílem této techniky. TMA (Transcription Mediated Amplification). Jedná se o amplifikaci ribozomální RNA (rRNA) optimalizovaným postupem 3SR zvaným TMA. Detekce produktu se provádí chemiluminiscenčně. TMA je produktem firmy Gen Probe Inc., San Diego, California USA, která dodává soupravy na tomto principu pro stanovení mykobakterií a chlamydií. Metoda je rychlá a robustní, proti PCR poněkud dražší. Pavel Nezbeda 22-25 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob SDA (Strain Displacement Amplification) Metoda vyvinutá pro stanovení Mycobacterium tuberculosis je založena na dvou klíčových skutečnostech: • schopnosti restrikčních enzymů (endonukleáz, viz tabulka na str. 22-9) vyštípnout z DNA specifickou cílovou sekvenci (target) • schopnosti DNA-polymeráz tuto vyštípnutou oblast dosyntetizovat (opravit). Překlad názvu metody do češtiny, snad amplifikace s odstraňováním řetězce. V této technice se amplifikuje pouze jedno vlákno. Ve vlastní reakci je třeba obejít skutečnost, že endonukleáza obvykle tvoří dvouřetězcové štěpy DNA (v tomto případě by ovšem nevznikla matrice pro novotvořený řetězec, bylo by nutno dvoušroubovice denaturovat, jako na počátku reakce). Řeší se to tak, že při syntéze nového řetězce se do směsi přidají nukleotidy substituované v poloze 5' sírou, takže vzniká alfa-thio-substituovaný nukleotid, který endonukleáza neumí přečíst a z vytvořené dvoušroubovice odštípne pouze jeden řetězec (bez thio-nukleotidu). Principiální schéma k pochopení reakce je uvedeno na následujícím obrázku. Základní reakční schéma SDA --G-T-T-G-A-C rozpoznávací sekvence 3'- konec primem cíl, target —-G-T-T-G---CAsAiC prodloužení 3 - konce cílové DNA A -T- Hinc II --G-.TT , --CHAsAsĽ 7% hemifosforothionátová rozpoznávací část >-G-T-T-G*A-'-C- AsAsC-T- C-Ü- I Hinc II —-G-T-T GsA-C---C-fATfttp-T-O- ■-O-T-T-OsA-C---C|AiAsr-TG- prodloužení primer u odštípnutí pomocí Hinc II polymerizované a odstraněné vlákno Jednovláknový (cílový, target) fragment DNA a primer se hybridizují na svých komplementárních 3'- koncích. Oba konce 5'- přesahují, konec primeru nese rozpoznávací sekvenci (GTTGAC) pro endonukleázu Hinc II. DNA polymeráza I prodlužuje 3'- konec primeru i 3'- konec cílového fragmentu DNA (tj. dochází k replikaci DNA), přičemž jsou v reakční směsi přítomny 2-deoxynukleosid-5'-trifosfáty (dCTP, dGTP aTTP) a deoxy-adenosin 5-[a-thiojtrifosfát (dATP[aS]), takže výsledný dvojitý řetězec obsahuje v nově vytvořené rozpoznávací části pro endonukleázu thiosloučeninu (As), tzv. hemifosforothionáto-vou rozpoznávací část. Tato struktura nemůže být endonukleázou Hinc II rozpoznána a je proto odštípnut (nick) a odstraněn nechráněný řetězec primeru. Spodní řetězec (na obrázku představovaný tenčí linkou) s As zůstává netknutý. Zbylá horní část původního primeru je opět DNA polymerázou dosyntetizována (od 3'- konce v místě střihu), takže vzniká, kromě celého fragmentu, regenerovaná rozpoznávací část. Vazba 5'-G-sA- 3' (v sekvenci -G-T-T-G-sA-C-) nevadí aktivitě endonukleázy, takže horní řetězce (na obrázku silnější linie) může být znovu odstřihnut a odstraněn.Takto se opakovaně tvoří nové a nové jednovláknové target fragmenty. Amplifikace je lineární. odštípnutí pomocí Hinc II polymerizované a odstraněné vlákno Pavel Nezbeda 22-26 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Schéma postupu SDA s dvouvláknovým fragmentem a dvěma primery T1 T1 TZ nasednutí primerú j£ P1 paiytnerace P2 |)oíyft;eoce 4 displicement Na obrázku vlevo je znázorněna stejná technika, jak právě probraná na předchozí straně, tentokrát s dvouvláknovým fragmentem a dvěma primery. Endonukleáza vyštípne z DNA vyšetřovaného materiálu cílovou sekvenci ve formě dvojitého úseku DNA (T1-T2). Tu je potřeba denaturovat, aby došlo k rozdělení dvoušroubovice na dvě jednotlivá vlákna (T1 a T2). Poté se přidají primery (P1 a P2) a aktivované nukleotidy, z nichž jeden je thio-derivát (obsahuje v poloze 5'síru místo kyslíku) a DNA polymeráza I, která „umí" dosyntetizovávat řetězec primem od 3' konce. Primery tedy postupně narůstají od 3' konce až na cílovou délku (polymerace). Pak dojde endonukleázou k odštěpení řetězce a nové polymeraci od 3'- konce původního primem. Řetězec tvořený z primem P1 je antiparalelní k T1, tzn. má stejnou sekvenci jako T2, tedy je matricí pro P2. Obráceně řetězec syntetizovaný z primem P2 je antiparalelní k T2, tedy má stejnou strukturu jako T1, tudíž je matricí pro P1. Celý proces má takto exponenciální charakter (exponenciální amplifikace). 22.5.2. Amplifikace hybridizační sondy Q-beta replikázová amplifikace Tato diagnostická technika využívá enzym Q-beta replikázu, enzym, který replikuje genomovou RNA bakteríofága Q-beta. Q-beta replikázová amplifikace tagmenlu Uru* HA oJb Genomová RNA bakteriofága Q-beta tvoří párováním bází specifickou sekundární strukturu, připomínající trojlístek. Tato struktura je pro Q-beta replikázu specifická, vzorky sekundárních struktur RNA jiných organismů nejsou pro Q-beta replikázu substrátem. Tento enzym však dokáže „tolerovat" krátké úseky vnesené do RNA bakteriofága (tzv. inzerce), které mohou sloužit jako hybridizační sondy pro cílovou (target) nukleovou kyselinu (např. z určitého infekčního agens). Pavel Nezbeda 22-27 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Postup (viz obrázek na předchozí straně): 7. V RNA bakteriofága je vložena krátká inzerce (srovnej s odstavcem 22.3.3. Chimérní DNA... na str. 22-12), specifická sekvence - hybridizační sonda, na kterou se naváže (hybridizuje), pokud je přítomna, cílová nukleová kyselina. Na obrázku: vlevo dole:^^ target NA. 2. V dalším kroku se přidá enzym RNáza III, který rozloží nehybridizované sondy a jejich zbytky se vymyjí. Hybridizované sondy jsou netknuté. Na obrázku: vlevo a vlevo nahoře: přidání RNázy III, a dále nahoře: odmytí fragmentů nehybridizovaných sond. 3. Po odstranění zbytků nehybridizovaných sond zůstanou hybridizované sondy, tj. sondy s navázanou cílovou nukleovou kyselinou, ale je jich málo. Proto se přidá Q-beta replikáza, jejímž účinkem dojde k amplifikaci (pouze) hybridizovaných sond, které se následně zviditelní, což lze provádět různými způsoby. Jedná se o selektivní amplifikaci těch sond, které hybridizovaly s cílovou nukleovou kyselinou. Na obrázku: vpravof^^ přidání Q-beta replikázy. 22.5.3. Amplifikace signálu bDNA-branched DNA assay (Multiple Sandwich Assay) Název se dá přeložit přibližně jako stanovení s rozvětvenou DNA, resp. vícenásobná sendvičová analýza. Je to technika k zesílení/amplifikaci detekčního signálu. Metoda je založena na vazbě syntetických, rozvětvených molekul DNA na cílovou nukleovou kyselinu. Enzymové konjugáty navázané na tyto větvené molekuly způsobí silnou amplifikaci signálu. Metoda je nezávislá na primem, cílová nukleová kyselina se nereplikuje. Branched DNA assay Izolace nukleové kyseliny lýza infekčního agens vyšetřovaný vzorek do lyzačniho roztoku degradace RNas Ze vzorku se izoluje DNA/RNA, která se denaturuje. Na dvě cílové sekvence nukleové kyseliny (target, cílová nukleová kyselina) se navážou (hybridizují) dvě komplementární záchytné hybridizační sondy (CP, capture probes), které jsou imobilizovány/navázány v jamce polystyrénové mikrodestičky. Současně se na dva jiné specifické úseky cílové nukleové kyseliny navážou (hybridizují) další dvě komplementární (detekční) sondy, nazývané extendery (EP, extender probes), které mají na svém konci navázány extenze/prodloužení, na která se v dalším kroku naváže (hybridizuje) nosič rozvětvené DNA, tzv. PreAmplifier (PA, předzesilovač). Další krok je amplifikační: na PreAmplifier se naváže větvená DNA, tzv. větvený zesilovací multimer (VZM). V dalším kroku se na větvené úseky zesilovacího multimeru (větvené DNA) hybridizuje značné množství oligonukleotidů značených alkalickou fosfatázou, tzv. Label Probes (LP). Takto lze na každou molekulu zachycené cílové nukleové kyseliny navázat až 3000 molekul enzymu (ALP). Přidá se (dioxetanový) substrát a měří se chemiluminiscence. Celý proces probíhá simultánně. Tato složitá technika se dá shrnout přibližně takto: sondy navázané v mikrodestičce zachytí cílovou nukleovou kyselinu a po promytí a odstranění nenavázaných nukleových kyselin a jiných Pavel Nezbeda 22-28 Hybridizace hledané nukleové kyseliny se záchytnou sondou a extendery ľ v. Hybridizace Pre-Amplifieru vrt iftikrůdestičků Hybridizace větveného zesilovacího multimeru Hybridizace značených sond Generace chemiluminiscenčního signálu Přidáni substrátu dioxetanu Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob látek se hybridizační technikou naváže v několika krocích větvená DNA, na kterou lze v dalším kroku navázat velké množství syntetických oligonukleotidů značených enzymem (ALP). Toto velké množství enzymu navázaného na jednu molekulu cílové nukleové kyseliny, umožňuje i při malém záchytu těchto kyselin generaci silného signálu, v tomto případě silnou, dobře detekovatelnou chemiluminiscenci. Technika je vhodná pro sledování antivirové léčby hepatitíd B a C a infekcí HIV a CMV (cytomegalovirus). Obdobnou technikou je technika „Christmas tree" (vánoční stromek). Složené sondy (Compound Probes) Na komplementární místo cílové nukleové kyseliny se naváže primární sonda. Tato sonda obsahuje v druhé části molekuly sekvence vhodné k hybridizaci sekundárních sond, které obsahují tzv. reportér, tj. skupinu iniciující na vhodném substrátu detekční reakci. Sekundární sondy mohou vytvářet různě košaté formy (viz Christmas tree výš), případně jednoduché cirkulární struktury. V obou případech dojde k výraznému zesílení signálu. 22.6. Sekvenování nukleových kyselin V 70. až 80. létech minulého století byly objeveny metody, které umožňují poznat pořadí/sekvenci nukleotidů v DNA. V současné době jsou tyto postupy zcela automatizovány, ale princip vychází ze dvou původních metod • enzymová metoda podle Sangera (s použitím T7 DNA polymerázy) • chemická metoda pole Maxama a Gilberta. Enzymová metoda využívá k určení sekvence nukleotidů dideoxynukleotidy, které po včlenění do řetězce zastaví další růst vlákna, který probíhá na izolované matrici (klasickým způsobem prodlužováním primem navázaném na jednovláknové DNA). Pro každý dideoxynukleotid zvláštní sekvenační reakce (celkem 4 reakce). V místě, ve kterém se včlení dideoxynukleotid se reakce zastaví, takže vzniká směs různě velkých fragmentů. Fragmenty se dělí vsekvenačním denaturačním gelu (polyakrylamidový gel s močovinou), který má rozlišovací dělicí schopnost jedné báze. Primer je značen radioizotopem, což se projeví na _ . autoradiogramu tmavým pásem. Sekvence od čela elektroforeogramu ke I startu je komplementární 5'-» 3'sekvencí k matrici/templátu. Moderní modifikace této metody probíhá vtermocykleru, všechny 4 reakce probíhají současně, značení je prováděno fluoresceinem, detekce je laserová (detekce 4 různých fluorescenčních barev), vseje řízeno počítačem a plně automatizováno. probíhá ddAMP Poznámka: jak je patrné ze vzorce dideoxyadenosinmonofosfátu (ddAMP), jako zástupce dideoxydovaných nukleotidů, ztrátou OH skupiny v poloze 3' pozbyl nukleotid schopnost vazby s fosfátovou skupinou v pozici 5' nemůže se tedy tvořit fosfodiesterová vazba a syntéza řetězce se ukončí. Stručné schéma metody je uvedeno na obrázku na následující straně. Chemická metoda je založena na specifické chemické degradaci (na konci označeného) řetězce/fragmentu DNA chemickým činidlem, které specificky narušuje vazby u určitého nukleotidu. Konečná fáze je obdobná metodě Sangerově - elektroforéza na sekvenačním gelu a vizualizace výsledku. PITI Ion PGM™ Sequencer Ion Proton™ Sequencer Dva moderní sekvenátory „příští generace" firmy Life Technologies Video na adrese: https://www.youtube.com/watch?v= WYBzbxlfuKs&feature=player embedded Kurz on-line o modernícj metodách sekvenování lze nalézt zde [stránka European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, součásti European Molecular Biology Laboratory (EMBL),] Pavel Nezbeda 22-29 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Enzymová metoda sekvenování DNA GCATATGTCAGTCCAG CGTATACAGTCAGGTC I 5 dvouřetězcová DNA G CAT J označený primer CGTATACAGTCAG GTC I 5 jed nořetězcová DNA +ddATP + DNA polymeráza 1 + nadbytek d A TP dTTP dCTP dGTP + ddTTP + DNA polymeráza +ddGTP + DNA GCAT A GCAT ATGTCA GCAT AT GCAT ATGT GCA j ATG GCA ATGTCAG | GCAT ATGTCAGTCCA I GCAT ATGTCAGT I GCAT I ATGTCAGTCCA GCAT j G A C C T G A C T G T A +ddCTP + DNA polymeráza GCAT I ATGTC j ATGTC GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTCAGTC 3 ▲ Pavel Nezbeda 22-30 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob 22.7. Biosenzory, mikročipy a mikroarraye Pojem čip (z anglického chip = kousek) je známý z elektroniky, především z počítačových technologií. V této souvislosti představuje čip polovodičovou součástku, integrovaný obvod, tj. vzájemně pospojované diody, odpory, tranzistory a další elektronické prvky na základní destičce umístěné v plastikovém obalu. V současné době je technologie výroby těchto součástek na takové úrovni, že jednotlivé čipy obsahují desítky milionů zmiňovaných jednotlivých (tzv. diskrétních) součástek. V elektronice se tak zmenšily nároky na prostor a spotřebu energie. Biočipy svou skladbou připomínají počítačové procesory/čipy. Výroba biočipů je kombinací klasických polovodičových výrobních technik, chemie pevné fáze, tzv. kombinatorní chemie, molekulární biologie a moderní robotiky. Biosenzory či biočipy jsou často nazývány také mikročipy, mikroarraye, mikrosoubory apod. (viz dál v textu a též kapitola 10, str. 10-29). Biosenzory založené na DNA se nazývají DNA čipy, genové čipy. Ming Zhou z National Research Council Canada definuje biočipy/biosenzory takto: Biosensor\e kompaktní analytické zařízení, které obsahuje biologicky aktivní snímací prvek spojený s fyzikálně chemickým snímačem. Základním principem je selektivní přeměna biologického nebo biochemického děje na detekovatelný signál bez předběžné separace vícesložkových vzorků. Lze rozlišovat biosenzory elektrochemické, optické, akustické a jiné, s různým využitím v praxi. (Ming Zhou Micro- and Nano-Structured Biosensors, Institute tor National Measurement Standards, National Research Council Canada, MRS&DCAN, September 30, 2004 dostupné na adrese http://www. cmcmicrosvstems. ca/news/events/mrdcan2004/hiahlights/zhouDresentation04. pdf Biočip je soubor miniaturizovaných zkušebních plošek (mikroarrayí, z anglického array = pole, sada; mikroarray se může přeložit i jako mikrosoubof) uspořádaných na pevném substrátu; umožňuje provedení mnoha testů (i různých) současně, s cílem dosáhnout vyššího průchodu a rychlosti. Většinou není povrchová plocha větší než nehet. Podobně jako počítačový čip, který umožňuje provedení milionů matematických operací za sekundu, může biočip provést během několika sekund tisíce biologických reakcí, jako je např. dekódování genů. Biočip podle Ming Zhou Biologicky aktivní signál Fyzikálně-chemický I snímací prvek snímač Přeměna biologického děje na fyzikálně chemický signál Biologický či biochemický děj I signál Měřidlo T Data DNA čip\e navržen k tomu, aby na místě „zamrazil" struktury mnoha krátkých vláken DNA (sond). V principu slouží jako určitý druh „testovací nádobky" pro reálné chemické vzorky. Genové čipy se navrhují pro • detekci specifických genů (stanovení přítomnosti genu či jeho sekvence) • měření exprese genů ve vzorcích tkání (tj. přepis sekvence genů do informační RNA - mRNA následný překlad informace z mRNA do bílkoviny) Schématické znázornění výroby tzv. GeneChip Microarray firmy -n- Mi Wator 2S-rner< Uflhl (deprclectfoti) V.TTTMask ... i i i i i mi ► OHDHOOO I i I I I I ODO f G A T C G ČÁ ŤÁ T A G C T G T T CCG GeneCriip* Microarray Repeat i i i i i TTC C CH i i I i I I i TTOOO _I Na obrázku je schematicky znázorněna výroba GeneChip Microarray, který využívá tzv. inverzní sondy (na trh přišla tato diagnostická technika v září 1997). Povrch nosné křemíkové destičky (na obrázku wafer = oplatka, hostie) se připraví litografickým procesem na vazbu oligonukleotidů DNA (sondy), které kopírují určité úseky genů, které jsou cíleně předmětem zájmu (např. rodově nebo druhově specifické sekvence v případě mikrobiologické diagnostiky). Proces vazby oligonukleotidů (obvyklá délka je 25 nukleotidů) se opakuje, až je celá destička zaplněna. Na jednu array se vměstná přes 1,3 milionů požadovaných kombinací. Podle potřeby je možno každou destičku (o/er) rozřezat na desítky až stovky individuálních čipů (arrayí). Na čip se kápne vzorek s obsahem jednovláknové DNA (ssDNA) označené barvivem. Během hybridizace dojde k navázání na specifickou sondu lokalizovanou na určitém místě biočipu a vytvoření charakteristického obrazce. Pavel Nezbeda 22-31 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Barevné označení jednotlivých nukleotidů (při použití tzv. inverzních sond) 10000 Probes Genonric DNA Gap-Fill Inversion Amplify and label Hybridize To array 0 f f ü Laserový skener odečítá charakteristický obraz (laser iniciuje fluorescenční záření), který je možno uložit v elektronické podobě a dále zpracovávat. Výsledek ukazuje, jestli vzorek obsahuje sekvence zakotvené na čipu. Čtyřbarevný obraz při použití tzv. inverzních sond (Affymetrix GeneChip® Tag Array) Barvy v mikroarrayi: Zelená představuje kontrolní DNA získanou z normální tkáně a hybridizovanou s cílovou DNA. Červená je DNA ze vzorku, získaná z nemocné tkáně a hybridizovaná s cílovou DNA. Žlutaje kombinací DNA kontrolní a DNA ze vzorku, které byly stejným dílem hybridizovány k cílové DNA. Černá představuje oblasti, kde k cílové DNA nebyly hybridizovány ani kontrolní DNA ani DNA ze vzorku. Každý bod na čipu je spojen se zvláštním genem. Každá barva představuje bud' zdravou (kontrolní) nebo nemocnou (ze vzorku) tkáň. Podle typu použitého čipu, vypoví umístění a intenzita barvy, zda je přítomen gen nebo jeho mutace buď v kontrole nebo ve vzorku. Rovněž poskytne odhad o expresi hladiny genu/ů ve vzorku a v kontrole. Dvoubarevný obraz DNA mikroarray se zafixovanými syntetickými sondami (probes). Výsledná „mřížka" (srovnej obrázek vpravo) může hybridizovat např. s cílovými sekvencemi získanými z experimentálních vzorků za účelem zjištění hladiny exprese specifických mRNA ve vzorku. Pavel Nezbeda 22-32 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Měření genové exprese pomocí DNA mikroarray Control Sample m AAA/V A/WV l Experimental Sample mRNA extraction Reverse Transcription, flourescent labeling Combine equal amounts and hybridize I (f i é ě v > Zdroj: httD://bitesizebio.com/articles/introduction-to-dna-microarravs/ Měření genové exprese pomocí DNA mikroarray (příklad postupu, který může být i odlišný): • V prvním stupni se izoluje mRNA, která je předmětem zájmu, jeden vzorek je kontrolní (např. od zdravého jedince), druhý je experimentální (např. od nemocného jedince). • Reverzní transkripcí se mRNA amplifikuje a převede na cDNA. Při tomto procesu se do DNA inkorporuje fluorescenční barvivo (nukleotid s navázaným barvivem). • cDNA se aplikuje na mikroarray, hybridizuje se syntetickými sondami. • Skenování mikroarray a kvantifikace signálu (po vybuzení fluorescence laserem). Síla signálu závisí na množství cílového vzorku navázaného na sondy v příslušném místě. (Celý postup zahrnuje řadu promývání k odstranění nenavázaných sekvencí) Hybridizaci lze detekovat i jinými způsoby. Příkladem může být bioelektronická detekce eSensoru fy Motorola, která je založena na využití redox potenciálů derivátů ferrocenylu. Tyto čipy jsou vyráběny technologií tištěných spojů. Na nosnou destičku se umístí zlaté elektrody, na které navazuje vrstva (SAM = self-assembled monolayer) obsahující záchytné DNA sondy, které na sebe vážou, pomocí vodíkových můstků, sekvence analyzované nukleové kyseliny. Na imobilizované (zachycené) DNA se na komplementární sekvenci hybridizuje signální sonda obsahující některý z derivátů ferrocenylu. SAM zprostředkovává přenos elektronů mezi imobilizovanými ferrocenylderiváty a zlatou elektrodou. Vše je uspořádáno tak, že žádné jiné potenciály přítomných sloučenin neovlivňují zlatou elektrodu a dochází tak k vysoce selektivní detekci specifických sekvencí amplikonů. DNA má také zvláštní elektrické vlastnosti - může pracovat jako malinký elektrický drát, přitom se DNA chová jako polovodič. Odtud plyne další možnost využití DNA čipů - v počítačovém průmyslu lze nahradit křemík touto kyselinou a vyrábět čipy o velikosti molekuly (nanotechnologie). (K hlubšímu studiu doporučuji výše uvedenou citaci autor Ming Zhoue a dále uvedené citace MUDr. Emila Pavlíka, CSc, v Labor Aktuell [LA]; dále napr. Stephen H. Friend a Roland B. Stughton, Kouzla mikrosouborů, Scientific American CZ, 34-41, únor 2002 (zde se lze dočíst i o proteinových čipech); přehledně lze hledat i v encyklopedii Wikipedia -anglická mutace - např: http://en.wikipedia.org/wiki/Biochip) Průkopníkem na poli technologií biočipových mřížek - arrayí je firma RANDOX, jejíž analyzátory řady Evidence (Evidence, Evidence Evolution, Evidene Investigator, Evidence Multistat) umožňují širokou paletu testů z oblasti proteinů (viz kapitola 10 Bílkoviny), léků a drog (viz kapitola 17 Toxikologie) i DNA a RNA analýz v multiplexovém provedení. Z posledně jmenované oblasti analyzátory umožňují • SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) genotypizaci • stanovení genové exprese • detekci patogenů • detekci mutací. SNP genotypizace Speciální primer umí odlišit sekvence, které se liší pouze v jedné bázi. Produkty amplifikace odpovídají cílové oblasti DNA z tkání, ústního výtěru nebo krve. Amplifikované úseky hybridizují na biočipovou mřížku (biochip array) s prostorově zřetězenými sondami komplementárními k cílovým amplikonům. Každá pozice na mřížce odpovídá specifickému SNP genotypu, takže mřížka je schopna jak multiplexního stanovení tak určení stupně podobnosti alel (zygosity) ve vzorku. Exprese genů Interpretace úrovně exprese genů může přinést cenné informace o fyziologickém zdraví buněk či souvisejících orgánů příslušného jedince v daném čase. Fa Randox disponuje mnoha arrayemi umožňujícími kvantitativní RNA expresi, které mohou vylepšit klinická rozhodnutí a výběr terapie, což dále vede k perzonalizované péči o každého pacienta. Detekce patogenů Vzorkem mohou být sputum, moč, výtěry atd. Cílová oblast vyextrahované DNA je amplifikována v jednoduché reakci a následně hybridizována na biočipovou mřížku s 23 sondami specifickými pro jednotlivé patogeny. Tento rychlý proces umožňuje současně stanovit primární i koexistující infekce, často u asymptomatických pacientů. Lze užít mnoho různých panelů. Detekce mutací Princip je podobný s výše popsanou SNP genotypizaci. Mřížka obsahuje prostorově zřetězené sondy se specifickými kombinacemi mutací, na které hybridizují amplikony z předchozích PCR. Každé místo na mřížce odpovídá konkrétní sondě, takže je možno relativně rychle (reakce trvá 3 hodiny) současně stanovit vícečetné mutace v jednom vzorku. Pavel Nezbeda 22-33 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob 22.8. Dodatky 22.8.1. Nové technologie v multiplexové kvantitativní real time PCR Nové technologie, se kterými přišla fa Seegene, Inc. z korejského Soulu, jsou současně i novými pojmy: • TOCE®: Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension • DPO™: Dual-Priming Oligonucleotides • cyclic-CMTA: cyclic-Catcher Melting Temperature Analysis • Pitchers a Catchers Tyto pojmy alespoň stručně vysvětlíme v následujícím textu. Technologie DPO™ DPO™ je firmou Seegene patentovaný cílově-specifický (target-specific) primer, který zajišťuje vysoce specifickou amplifikaci cílové oblasti. DPO primeryjsou strukturálně odlišné od konvenčních primem. Jsou tvořeny dvěma různými hybridizujícími oblastmi oddělenými unikátním polydeoxyinosinovým linkerem. A polydccxyinosinc Linker Koncová část-5' Koncová část-3' (Stabilizátor) (Determinátor) Díky této struktuře je kontrolováno dvoukrokové navázání DPO primem, přičemž jako první se váže oblast 5'- konce, stabilizátoru. Prodlužování primem je řízeno specifičtější hybridizující částí 3', determinátorem. Toto patentované uspořádání vylepšuje cílovou (target) specificitu a je zvláště vhodné pro multiplexové uspořádání. Poly(l) Linker 5' iiiiiiiiij. vinni Slabá vodíková vazba —""^ Vzrůst hybridizační teploty na 50 - 65 °C j—Stabllfw J* j—uccermin Struktura připomínající bublinu UetErmincr TtTOtflt» Krokl: první priming reakce ■S1 J lillllllllll ŕlA^jällsijľ ■i litr Krok2: druhá priming reakce Zpřesnění vazby DPO primem na cílovou oblast (annealing) je zřejmé z následujících obrázcích. Část následujícího obrázku věnovaná vizualizaci jasně ukazuje „čistou" hybridizaci DPO primem ve srovnání s výsledky hybridizace konvenčních primem. Pavel Nezbeda 22-34 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Perfect match at i'-end at 5'-exJ Ih 111 i 11 r i i Minii iMM^aV Extension extension Ho extension Extension No extension Template Template M 1 2 i Conventional DPO™ Vizualizace výsledků Perfektní navázání obou částí primeru - primer se prodlužuje Neshoda na 3'- konci; primer se neprodlužuje Neshoda na 5'- konci; primer se neprodlužuje B No extension Non-target site 5' Ačkoliv se delší 5'- segment navázal na „necílovou" oblast, krátký segment odolává nespecifickému prodlužování No extension Non-target site Samotná krátká 3'- oblast se nedokáže při teplotě hybridizace navázat Pavel Nezbeda 22-35 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Pitcher a Catcher Názvy Pitcher a Catcher jsou převzaty z baseballové terminologie a vzhledem k funkcím, které uvedené látky vdané reakci vykonávají, dá se říci, že trefně. Pitcher a Catcher realizují unikátní generaci signálu v reálném čase. Pitcher je jednovláknový oligonukleotid složený z označené části (Tagging portion) přilehlé k cílové části (Targeting portion), která specificky hybridizuje s oblastí zájmu na nukleové kyselině. Označená část Pitcheru má unikátní sekvenci a nehybridizuje se žádnou cílovou oblastí. Catcher je dvojitě označený jednovláknový umělý templát složený ze záchytné části (Capturing portion), která je komplementární k Tagging portion „nadhazovače", Pitcheru, přilehlé ktemplátové části (Templatingportion). Na začátku PCR se DPO™ primery a Pitcher hybridizují na specifická místa cílové oblasti. Během každého cyklu PCR, prodlužování protisměrného DPO™ primem, které je uskutečňováno Taq polymerázou s 5'- nukleázovou aktivitou, vede k odbourání navázaného Pitcheru a uvolnění Tagging portion. Uvolněná Tagging portion hybridizuje s Capturing portion „chytače", Catcheru. Prodloužení (extenze) Tagging portion vede k tvorbě „dvojitého chytače", Duplex Catcher, a fyzicky oddělí zhášecí molekulu (quencher) od fluoroforu, což vede ke generaci světelného signálu. Vše je zřejmé ze schématu TOCE technologie na následující straně. V této reakci 5'- nukleázová aktivita specificky odbourá Pitcher navázaný na cílovou oblast a to tak, že označená část je uvolněna. Uvolněná označená část hybridizuje se záchytnou oblastí (capturing portion) Catcheru. Následná tvorba dvojitého Catcheru (Duplex Catcher) vede k oddálení zhášecí molekuly (quencher) a ke generaci signálu. Baseball pitcher - nadhazovač Baseball catcher - chytač Kombinace těchto dvou molekul, DPO primem a CCMTA (cyklická analýza teploty tání Catcheru) tvoří podstatu technologie TOCE, tj. v podstatě homogenní vysoce multiplexní real time kvantitativní PCR technologie. Překlad do češtiny zní krkolomně, proto ještě jednou v angličtině - Homogenous high multiple real-time quantitative PCR technology. Pavel Nezbeda 22-36 Klinická biochemie Kapitola 22. DNA diagnostika lidských chorob Technologie TOCE® A, Annealing of DPO" & P t the r DPO'1 Tagging portion * *. f Targeting portion mmM 3 Pinter Target DPO'' Capturing portion Teniplatirg portion í Catcher The DPO'" primers and the Pitcher hybridize specifically to target sequences. The tagging portion of rhe etcher is deigned not to hybridize to tti* target seqwn