Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-1
Kapitola 3 Analytická část vyšetření
Po preanalytické fázi je vzorek zpracovaný a připravený k vlastní analýze, ke konkrétnímu testování. Vzorek
vstupuje do analytické fáze laboratorního diagnostického procesu, kde bude měřen. V laboratoři klinické
biochemie to budou převážně chemické reakce, kterým bude testovaný vzorek podrobován a na jejichž
konci bude žádaný výsledek.
Měření v laboratoři klinické medicíny a vše co s tímto měřením souvisí bude předmětem této kapitoly.
3.1. Měřením se zabývá metrologie
Podstatou práce v analytické fázi je měření. Měřením se zabývá věda zvaná metrologie (neplést si
s meteorologií). Metrologie je (stále se vyvíjející) věda o měření a jeho aplikaci a přesně definuje celou řadu
metrologických pojmů. Od pracovníka s vyšším odborným vzděláním se očekává určitá orientace v dané
problematice, a proto se s některými metrologickými pojmy blíže seznámíme. Východiskem i oporou v této
činnosti nám bude poslední překlad (2008) Mezinárodního metrologického slovníku, tzv. VIM3, který je
k dispozici na stránkách Úřadu pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví. Definice převzaté
z tohoto slovníku budou označeny symbolem (VIM3). Většinou je najdete v Dodatku k této kapitole.
Měření je
 soubor činností, jejichž cílem je stanovit hodnotu měřené veličiny
 cesta, kterou se získá výsledek analýzy.
Toto sice nejsou definice, ale podstatu pojmu vysvětlují docela jasně.
Měření porovnává veličiny, případně zjišťuje počet analyzovaných složek (entit). Měření také popisuje
podmínky měření, postup měření a kalibrovaný měřicí systém. Měření předem předpokládá popis veličiny, a
to takový, aby určenému použití výsledku měření odpovídal. Tento aspekt bude dále probrán podrobněji.
Z fyziky víme, že veličina je fyzikální nebo chemická vlastnost jevu, tělesa nebo látky, která má velikost.
Tato velikost může být vyjádřena jako číslo a odkaz neboli reference, kterou může být např. měřicí jednotka
(3,4 mol/l).
Mezinárodní soustavu veličin (ISQ) tvoří soubor sedmi základních veličin, kterými jsou: délka, hmotnost,
čas, elektrický proud, termodynamická teplota, látkové množství a svítivost. Základní veličinou se rozumí ta
veličina, která v dané soustavě veličin nemůže být vyjádřena jinou veličinou, tudíž základní veličiny jsou
vzájemně nezávislé. Naproti tomu odvozená veličina je veličina v soustavě veličin definovaná pomocí
základních veličin této soustavy. Odvozenou veličinou je např. hmotnostní koncentrace, kdy se jedná o podíl
hmotnosti a objemu, přičemž objem je délka umocněná na třetí. Na další příklady jistě přijdete sami.
Na mezinárodní soustavě veličin ISQ, na jejích názvech, značkách, včetně řad předpon a jejich názvů a
značek, společně s pravidly pro jejich použití, je založena (1960) Mezinárodní soustava jednotek (SI).
Jednotkou, přesněji, měřicí jednotkou, se rozumí dohodou definovaná a přijatá reálná skalární veličina, se
kterou může být porovnávána jakákoliv jiná veličina stejného druhu (délka s délkou, hmotnost
s hmotností…) a toto porovnání se vyjadřuje jako číslo udávající podíl těchto veličin („kolikrát je jednotka
obsažena v naměřené veličině“). Reálnými skalárními veličinami byly ještě v nedávné minulosti části
lidského těla – palec, dlaň, loket, popřípadě věci denní potřeby – vědro, konev atd. Moderní doba používá
modernější prostředky, např. metr je definován „jako vzdálenost, kterou urazí světlo ve vakuu během
časového intervalu 1/299 792 458 sekundy (tj. světlo urazí ve vakuu za sekundu přesně 299 792 458
metrů)“
1
.V ČR jsou zákonnými měřicími jednotkami pouze jednotky uvedené v ČSN ISO 80000-1
1
21. října 1983, sedmnácté jednání o mírách a váhách( CGPM)
Laboratorní vyšetření
pre-
preanalytická
fáze
mimo laboratoř mimo laboratořv laboratoři
postanalytická
fáze
post-
postanalytická
fáze
preanalytická
fáze
analytická fáze
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-2
(z účinností od 1.8.2011, tato norma nahradila normu ISO 1000 z června 1997)) a jsou jednotkami SI
(Systéme International d’Unité). Soustava SI byla u nás zavedena v roce 1974 a povinnost používat ji platí
od roku 1980.
Následující tabulka ukazuje vztahy mezi základními veličinami a jejich jednotkami, názvy a zkratky jednotek:
Veličinou hodnou zájmu v klinické biochemii je
látkové množství. Základní jednotkou látkového
množství v soustavě SI je mol. Jednotky měření
používané v klinických laboratořích musí být
odvozeny od této základní jednotky, případně musí
vycházet ze soustavy SI, nebo být z ní odvozeny.
Za zmínku stojí ještě pojem měřená veličina,
anglicky measurand, tedy objekt, který je měřen.
Měřenou veličinu (např. koncentraci) v daném
vzorku je třeba specifikovat (např. koncentrace
čeho), tzn., je třeba popsat nositele veličiny (příklad:
koncentrace bilirubinu), případně i další okolnosti
(např. teplotu, měřeno při 37 °C, soustavu, v séru
apod. ). Změna hodnoty měřené veličiny, zejména
výrazná změna (oproti „normálu“), vede v klinické biochemii většinou k úsudku, že organismus není
v optimálním stavu, není zdráv.
„Nositelem veličiny“ při měření v klinické biochemii je analyt (komponenta, analyzovaná složka, někdy se
setkáme i s pojmem entita), nacházející se ve vzorku (biologického materiálu), pocházejícího z nějakého
systému.
Příkladem komponent mohou být atomy, molekuly, ionty,
radikály, makromolekuly, fyzikální tělesa (buňky, mikroby,
viry) atd., příklady systémů připadajících v úvahu ve
zdravotnické laboratoři jsou uvedeny v tabulce vpravo:
Vzorek je jedna nebo více reprezentativních částí
odebraných ze systému za účelem získání informací
o systému - ze zjištěných vlastností vzorku usuzujeme,
někdy oprávněně, někdy méně oprávněně, na vlastnosti
systému.
Výsledkem prvotního odebrání je primární vzorek.
V praktickém (laboratorním) životě je primárním
vzorkem odběrová nádobka (zkumavka), která je
přijatá laboratoří. Právě ta je myšlena, pokud se mluví o zpracovávání primárních vzorků a myslí se tím
skutečnost, že nedochází k žádnému rozpipetovávání přijatého vzorku, jeho alikvotaci (viz dál), přelévání do
dalších nádobek apod., ale přímo tato (prvotní) zkumavka, resp. její obsah, se zpracovává, tj., že se např.
vloží do analytické linky či měřicího systému.
Analytický vzorek je do laboratoře dodaná část vzorku, ze které se odebírají zkoušené (analyzované) části
pro jednotlivé analýzy. Jak je zřejmé z předchozího odstavce, analytickým vzorkem může být přímo vzorek
primární.
Analytický podíl je podíl čili část materiálu, který je odebraný z analytického vzorku a s nímž se provádí
aktuální měření nebo pozorování. Nazývá se také alikvot (aliquot).
Příklad použití: jedna část – alikvot – je určena pro biochemický analyzátor, druhá pro imunochemický analyzátor,
další je určena pro elektroforetické dělení apod.
Základní veličina
Základní jednotky SI
Název Značka
délka metr m
hmotnost kilogram kg
čas sekunda s
elektrický proud ampér A
termodynamická
teplota
kelvin K
látkové množství mol mol
svítivost kandela cd
Zkratka Systém (anglicky) Systém (česky)
B- blood krev
S- serum sérum
P- plasma plazma
U- urine moč
Sf- spinal fluid
mozkomíšní mok/
likvor
Af- amnial fluid plodová voda
F- faeces stolice
Pt- patient pacient
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-3
Legenda k tabulce: První řádek
tabulky pod nadpisy ukazuje, že
měřenou (odvozenou) veličinou je
látková koncentrace, analyzovanou
složkou v daném systému (v séru)
jsou elektrolyty, konkrétním
analytem je sérový kation Na
+
,
jednotkou (mírou stanovované
veličiny) je mol/l. Jinými slovy, měří
se látková koncentrace konkrétního
elektrolytu v konkrétním systému
v mol/l. Některé, snad na první
pohled nejasné, vztahy určitých
(odvozených) jednotek k molu
vysvitnou z jejich definice – typickým
příkladem je katal na litr (kat/l), kde
stačí si prostudovat definici katalu
v kapitole 12 na str. 12-6.
K řazení veličin stejného druhu podle velikosti se používá uspořádaný soubor hodnot veličiny u veličin
daného druhu, zvaný stupnice hodnot veličiny, nebo krátce, měřicí stupnice (VIM3).
Rozeznávají se tři typy stupnic:
 poměrná (relativní) kvantitativní stupnice
 nominální (jmenovitá) stupnice
 ordinální (pořadová) stupnice
a. Poměrná kvantitativní stupnice se získá pomocí vzorků, u kterých je známý obsah měřené veličiny.
Tyto vzorky se nazývají měřicí standardy nebo etalony či kalibrátory. Výsledky měření u neznámých
vzorků se srovnávají či poměřují (proto poměrná) s touto stupnicí.
Sestrojení této stupnice je kalibrací měření (viz odst.3.3.). V poslední době se velmi často proces
kalibrace odehrává přímo u výrobce (výrobci dodávají uzavřené systémy, tj. přístroj (analyzátor),
reagencie, kalibrátory, kontrolní vzorky, případně přímo i kalibrační křivky, které se instalují do
analytického systému pomocí čárového kódu.
b. Nominální stupnice se používá ke klasifikaci měřené veličiny při kvalitativních měřeních, při kvalitativní
analýze (tato měření se označují též jako pozorování).Pozorování je druh vyšetření, které vede
k vyjadřování výsledků na nominální stupnici nebo na ordinální stupnici. Hodnoty veličin jsou
označovány slovně nebo dohodnutými symboly.
Příklady nominálních stupnic
Vyšetření/pozorování Nominální stupnice
Dusitany (nitrity) v moči (přítomnost) negativní/pozitivní
Krevní skupina (typ) A1+, A1 Rh(D)pozitivní
Výsledek měření laboratoře v EHK akceptovatelný/neakceptovatelný
Nominální = jmenovitý, formální, týkající se jmen, vyjádřený v penězích; nominální hodnota – hodnota udaná na
bankovce, cenném papíru…
c. Ordinální stupnice (stupnice podle pořadí priority hodnot) představuje velikost hodnot veličiny, ale bez
přesného matematického vyjádření. Vyšetřování, které vede k výsledkům na ordinální škále, se
označuje jako semikvantitativní analýza.
Ordinare (l.) = řadit
Příklad ordinální stupnice
Vyšetření/pozorování Ordinální stupnice
U-celková bílkovina (přítomnost) negativní; +1; +2;+3; +4
Přehled jednotek důležitých z hlediska klinické biochemie a
některých probraných pojmů
Měřená veličina Jednotka Analyt
Látková koncentrace elektrolytů mol/l S-Na
+
Hmotnostní koncentrace proteinů g/l S-IgG
Katalytická koncentrace enzymů kat/l S-AST
Arbitrární koncentrace
proteohormonů
U/l S-TSH
Látková změna při vylučování
elektrolytu
mol/d U-Cacelk
Hmotnostní změna při vylučování
proteinu
g/d U-proteiny
Objemová změna u glomerulární
filtrace
l/s S,U-kreatinin
Početní koncentrace elementů n/l U-leukocyty
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-4
Měření není možné bez měřidla, případně bez měřicího systému. Měřidlo, čili měřicí přístroj, je zařízení,
jehož konstrukce vychází z principu měření, a které se používá k měření buď samotné, nebo ve spojení
s dalšími přídavnými zařízeními. Měřicím systémem je sestava jednoho nebo více měřidel, případně i
dalších zařízení, sloužící ke konkrétnímu měření.
Příklad složení měřicího systému: měřicí přístroj či přístroje - ostatní technická zařízení - postup měření – reagencie –
kalibrátor - referenční čili kontrolní materiály.
Měřicí princip, princip měření (VIM3), jev, který slouží jako základ měření. Tento jev může být fyzikální,
chemické nebo biologické povahy.
Příklad: V klinické biochemii jsou k měření látkového množství hojně využívány spektrofotometrické metody, kde
měřicím principem je absorpce (zářivé) energie; ke zjištění aktivity/koncentrace iontů mohou být použity iontově
selektivní elektrody, kde měřicím principem je změna potenciálu indikační elektrody; přítomnost či nepřítomnost určité
látky v živném prostředí může vést k růstu či zastavení růstu kolonie bakterií – princip zjištění přítomnosti či
nepřítomnosti testované látky v růstovém médiu podle chování bakterií.
Postup měření (jehož relativně složitou definici dle VIM3 najdete v Dodatku) má laboratorní personál k
dispozici ve formě standardního operačního postupu (SOP). Podrobně popsaný postup měření v SOP,
umožňuje měření provést případně i málo zacvičené osobě. Často bývají k dispozici i zkrácené pracovní
postupy, resp. návody, které popisují základní úkony (přípravu reagencií, umístění reagencií v analyzátoru
apod.).
Výsledek měření je hodnota veličiny získaná měřením.
Poznámka: Preferovaným formátem IUPAC-IFCC pro označování veličin v laboratorní medicíně je „Systém-Složka; druh
veličiny“, viz příklad s vápníkem, níž v šedém poli.
IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry (Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii)
IFCC = International Federation of Clinical Chemistry (Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny)
Standardizovaný laboratorní výsledek v klinické biochemii by měl vždy obsahovat tyto informace:
 vyšetřovaný systém (pacient, krev, plazma, sérum, moč, mozkomíšní mok)
 vyšetřovaný analyt/komponenta (kreatinin, močovina, glutamátdehydrogenáza, glukóza)
 druh měřené veličiny (látkové množství, hmotnostní koncentrace, látková změna)
 číselnou hodnotu ( 2,14; 38,4; 215)
 jednotku (mol/l, kat/l, g/l)
Když doposud uvedené informace shrneme do (hypotetického) výsledku měření, může zápis výsledku
měření na pracovišti klinické biochemie vypadat např. takto: S-Ca = 2,14 mmol/l. Názvy jednotlivých členů
rovnice jsou uvedeny ve schématu:
Uvedený zápis lze interpretovat např. takto:
 v analyzovaném vzorku krevního séra (systém) byla zjištěna látková koncentrace (měřená veličina)
2,14 (číselná hodnota) mmol kalcia v litru séra (koncentrace s jednotkou měření mmol/l)
 látková koncentrace vápníku v krevním séru je rovna 2,14 mmol vápníku v jednom litru séra, nebo
 koncentrace vápníku je 2,14 mmol v litru séra,
 analyzovaný vzorek obsahuje v litru séra 2,14 jednotek atomů vápníku,
 zjištěná koncentrace vápníku v 1 litru séra představuje 2,14 (odvozené) jednotky, jinými slovy, tato
koncentrace je 2,14x větší než je měřicí jednotka, atd., atp.
Chyba měření. Nauka o měření, metrologie, vychází z předpokladu, že měření vede pouze k přibližné
hodnotě, více nebo méně odlišné od hodnoty skutečné, která je svou podstatou nezjistitelná (podobně, jako
nelze dosáhnout absolutní teplotní nuly). Rozdíl hodnoty zjištěné a skutečné byl nazván chybou (od
chyběti, něco naměřené hodnotě chybí). Určitou chybou je zatíženo každé měření.
systém analyt číselná hodnota výsledku jednotka měření
CaS- = 2,14 mmol/
l
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-5
Chyba měření, chyba (VIM3), naměřená hodnota veličiny minus referenční hodnota.
Poznámka: Chyba měření není omyl, výrobní chyba apod. Je to pojem použitelný za určitých podmínek. Předchozí
vydání VIM (VIM2) definovalo touto definicí pojem odchylka. V praxi se setkáme s oběma pojmy.
Znalost chyby umožňuje korekci, čili opravu výsledku.
Chyby měření se rozdělují na chyby systematické (soustavné, anglicky systematic errors) a chyby
náhodné (nahodilé, anglicky random errors).
Chyby systematické ovlivňují výsledek stejným směrem (navyšují nebo snižují výsledek).
Systematické odchylky se také nazývají bias [ anglická výslovnost je přibližně baies]. Svůj původ mají v některém
faktoru, který při určitých stejných podmínkách měření ovlivňuje ve stejném smyslu měření opakovaná.
Měření se provádí určitou metodou použitím měřicího přístroje, takže chyby systematické lze rozdělit na
chyby
 metody, které vznikají z nedokonalosti použité metody měření (např. ovlivnění hodnot hustoty moči
přítomností bílkovin, eliminace chyby se provádí zavedením příslušné korekce, případně měřením
veličiny několika různými metodami a zhodnocením souhlasu či nesouhlasu výsledků)
 měřicích přístrojů, způsobené jejich nedokonalou, špatnou, zhoršenou či neodpovídající funkcí
(chyba se eliminuje důsledným sledováním stavu měřicího zařízení a dodržováním pokynů pro
údržbu)
 osobní, které mají původ v osobě, která provádí měření (uplatní se zejména při manuálním měření,
např. odměřování kapalin, měření času, odečítání ze stupnice atp., kdy zkušený pracovník vykazuje
lepší výsledky, než pracovník nedostatečně, případně špatně zapracovaný, s malou zkušeností; tyto
chyby lze eliminovat zejména zavedením přístrojů, mechanizace a automatizace).
Systematická chyba může mít složku
 konstantní (výsledek je u všech hladin odchýlen
vždy stejným směrem o stejnou hodnotu) a
 proporcionální (výsledek se liší od správné hodnoty
u všech hladin stejným směrem o stejný násobek).
 Další možností je kombinace obou předchozích.
Typickými zdroji systematických chyb jsou rozdílné
laboratoře, rozdílné metody, rozdílné přístroje a pracovníci
laboratoří.
Systematickou chybu charakterizuje aritmetický průměr.
Jak uvidíme dále, je systematická chyba v podstatě totožná
s pojmem pravdivost.
Například chemikálie, reagencie, kalibrátory a komponenty přístrojů se
mohou časem měnit (kazit se) a být příčinou narůstajících či klesajících
trendů v laboratorních výsledcích.
Chyby náhodné se odlišují od chyb systematických především tím, že neznáme jejich původ. Jsou
vzájemně nezávislé, jsou nepředvídatelné a nezdůvodnitelné.
Odhad jejich výskytu lze zjistit statistickými metodami založenými
na počtu pravděpodobnosti.
Náhodnou chybu charakterizuje směrodatná odchylka.
Zdroje náhodných chyb ovlivňují každé měření různě, a to jak
pozitivně, tak negativně (navyšují i snižují výsledek). Eliminace
chyby je možná opakovaným měřením a vypočítáním
aritmetického průměru (při náhodném výskytu chyby v obou
směrech je při opakovaném měření pravděpdobné, že se chyby,
minimálně z věší části, vzájemně vyruší).
Jak uvidíme dále, je náhodná chyba v podstatě totožná s pojmem
preciznost.
Naměřený
průměr
Referenční
hodnota
Celková chyba
Náhodná chyba
Naměřené hodnoty
Systematická
chyba (BIAS)
vztažná metoda
porovnávanámetoda
proporcionální chyba
konstantní chyba
náhodná
chyba
Chyba náhodná a chyba systematická
(konstantní a proporcionální)
Přehled chyb měření
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-6
Příkladem náhodného působení mohou být např.
 výkyvy (fluktuace) v elektro-optickém mechanismu měřicího přístroje,
 smíchávání vzorku a reagencie,
 teplota přístroje,
 odpařování vzorku a reagencií.
 Další náhodné ovlivnění může mít svůj původ v kalibraci metody, která může ovlivnit náhodným
způsobem výsledky ze dne na den.
Součet chyby náhodné a chyby systematické dává chybu celkovou (viz obrázek „Přehled chyb měření“ na
předchozí straně).
Výsledek měření ovšem ovlivňují nejenom chyby analytické, ale také hrubé chyby a omyly, zapříčiněné
nekorektní lidskou činností. K hrubým chybám by v práci laboratorních pracovníků docházet nemělo, ale
nelze je zcela vyloučit. Každá lidská činnost je zatížena asi 5% chybou. Snížit toto procento může plně
automatizovaný či robotizovaný provoz (asi na 0,5%). Ke snižování osobních chyb významně přispívá také
důsledné dodržování zásad správné laboratorní práce.
Nejčastější chyby a omyly v analytické fázi měřicího procesu způsobené lidskou činností:
- nesprávné uchovávání reagencií (nevhodná teplota, světlo rozkládající světlocitlivé reagencie či
analyty, prošlá doba exspirace…)
- nesprávná příprava reagencií (špatné poměry ředění, nekvalitní destilovaná voda, záměna
reagencií…)
- při manuální práci: nesprávné odměřování roztoků, špatná teplota vodní lázně, nesprávné časové
intervaly, chyby ve výpočtech ...
- při práci na automatech: neznalost ovládání přístroje, chybné vkládání reagenčních souprav, nádobek
s reagenciemi, nesprávné zadávání požadavků, chybné vložení vzorků, chybná kontrola (nesprávné či
vadné kontrolní vzorky) ...
- špatně nastavená metoda (nevhodné chemické parametry...)
- nesprávné ředění (případně neředění) příliš koncentrovaných (aktivních) vzorků
- nesprávná funkce měřicího přístroje (zanedbání vnitřní kontroly jakosti)
3.2. Kalibrace je hledání vztahu mezi signálem měřicího přístroje a koncentrací
V analytickém procesu představuje kalibrace ústřední záležitost. Špatně nakalibrovaná metoda dává špatné
výsledky, je nepoužitelná. Při kalibraci jde v principu o nalezení vztahu mezi závisle a nezávisle
proměnnými, tj. mezi hodnotami veličiny dané etalony (standardy) a hodnotami analytického signálu
(danými většinou měřidlem, měřicím systémem).
Prakticky se každé měření provádí na nějakém přístroji (fotometr, koagulometr, coulometr…), který na
měřenou veličinu reaguje odezvou čili signálem (generace či změna napětí, proudu apod.).
Např. při fotometrii může být popsán tento sled kroků:
Analyt reaguje s činidlem za tvorby barevné sloučeniny. Intenzita zbarvení této sloučeniny je přímo úměrná původní
koncentraci analytu. Přístroj – fotometr, měří intenzitu zbarvení prostřednictvím proudu, který se tvoří po dopadu
světelného záření na detektor. Odezvou čili signálem je v tomto případě intenzita proudu, která je ve vztahu
k intenzitě zabarvení sloučeniny a tedy i ve vztahu k původní koncentraci analytu. Intenzita proudu může být
vyjádřena v ampérech ( ) nebo po převodu hodnot proudu na absorbanci, jako absorbance. V tomto případě
bude nejčastější odezvou absorbance.
D/P
ZDROJ FILTR KYVETA SE VZORKEM DETEKTOR A PŘEVODNÍK UKAZATEL
SCHÉMA FOTOMETRU
ABSh/A
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-7
Popsaný soubor činností (a podobné další soubory činností prováděné za definovaných podmínek) ustavuje
mezi touto odezvou S (intenzitou signálu, indikací) a měřenou vlastností c (množstvím, koncentrací
stanovovaného analytu ap.) funkční vztah (tzv. kalibrační funkce):
S = f(c).
Opakování z matematiky: Vždy, když můžeme k danému souboru čísel přiřadit jistým způsobem jiný soubor čísel,
máme co činit s funkční závislostí.
Tato funkční závislost (předpis, „jistý způsob přiřazení“) může být
 lineární, kdy funkcí je rovnice přímky a grafickým vyjádřením funkce je přímka, nebo
 nelineární, kdy grafické vyjádření (relativně složité) funkce představuje křivka odlišná od přímky.
Pro popsaný případ s fotometrem platí (za předpokladu, že c = koncentrace)
A = f(c)
což říká, že absorbance A je nějakou funkcí f koncentrace (c), čili hodnota absorbance se mění (podle
nějakého předpisu, tj. funkce – lineární, nelineární) v závislosti na hodnotách koncentrace daného analytu.
Existují matematické postupy umožňující rozhodnout, zda se jedná o lineární či nelineární závislost.
Lineární závislost (funkce) je vyjádřená obecnou rovnicí y = a + b.x,
kde y = hodnota odezvy, a = úsek na ose y (intercept), b = směrnice přímky a x = množství-koncentrace analytu; a by se
mělo blížit nule
Pro případ výše uvedeného vztahu mezi absorbancí a koncentrací analytu bude obecná rovnice vypadat
takto:
A = a + b.c resp. A = a + k.c
Nejjednodušším příkladem této funkční závislosti (tj. kalibrační křivky), je vztah pro a = 0 (přímka
procházející počátkem – viz obrázek na další stránce):
A = k.c,
s obvykle používanou symbolikou, tj. absorbance (A) je přímo úměrná koncentraci (c), k je směrnice křivky.
Z této rovnice lze vypočítat kalibrační faktor f: f = c/A
Kalibrační faktor je nejjednodušším vyjádřením kalibrace. Upravením vztahu dostaneme c = f . A,
což je analytická funkce, kterou můžeme zjistit obsah stanovované složky z intenzity signálu (tj. princip
stanovení koncentrace analytu pomocí faktoru).
A
0,8
0,7
0,6
0,5 k
0,4
0,3
0,2
0,1
ckal
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
c
Schematické znázornění lineárních kalibračních křivek procházejících i neprocházejících počátkem
Azměřené
0 = hodnota nulového
kalibrátoru
ckal = hodnota kalibrátoru
sklon křivky je dán směrnicí k
a = tzv. intercept, část
vytnutá křivkou na ose y
Křivka
neprocházející
počátkem Křivka
procházející
počátkem
Intercept a
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-8
Průběh kalibrační funkce se ověří zpracováním sady standardů (u lineárních závislosti je to obvykle pět
standardů) o vzrůstající koncentraci a vynesením do grafu. Kalibrační křivka se prokládá experimentálními
body metodou nejmenších čtverců.
Jednou ověřený lineární průběh (postupem popsaným dále u nelineárních závislostí) dané funkce umožňuje
napříště pracovat již s omezeným počtem kalibrátorů (etalonů, standardů), tedy v případě lineárních
závislostí se kalibrační křivka většinou sestrojí pomocí kalibrátoru s nulovou hodnotou stanovovaného
analytu a kalibrátoru s určitou hodnotou tohoto analytu, nejčastěji hodnotou blízkou horní hranici
referenčních hodnot.
Pracovní rozsah v případě lineární závislosti je oblast kalibračního grafu mezi (dolní) mezí stanovitelnosti
(LQ, viz kapitola 4, str. 4-11) a bodem, kde křivka závislosti signálu/odpovědi přístroje na koncentraci
přestává být lineární
2
, případně horní mezí stanovitelnosti (viz kapitola 4, obr. na str.4-12).
U nelineárních závislostí se obvykle používá standardní roztok (kalibrátor) o nulové hodnotě
stanovovaného analytu a pět až sedm dalších standardních roztoků (kalibrátorů), s koncentracemi
pokrývajícími pracovní rozsah metody (viz obr. níž).
Jak u lineárních tak u nelineárních závislostí se každý standard (kalibrátor) při kalibraci měří 2 - 5x (u sedmi
standardních roztoků je to tedy až 35 měření). Konečný tvar kalibrační křivky u nelineárních závislostí je
různý. Průběh může být polynomický, velmi často se provádí tzv. kubická neboli spline interpolace.
Poznámka: Na uvedeném odkazu je možno si „pohrát“ s šesticí naměřených bodů a intuitivně si ozřejmit o co se
v principu jedná.
Měřicí/pracovní rozsah u nelineárních kalibrací je obvykle vymezen hodnotami kalibrátorů s nejnižší a
nejvyšší koncentrací analytu. Výsledky mimo tyto meze se uvádějí formou „výsledek <dolní limit“, případně
„výsledek >horní limit“, pokud se u vysokých koncentrací původní vzorek (z nějakých důvodů) neředí nebo
se ho neaplikuje menší množství. Konkrétní postup při kalibraci se ozřejmí v praktických cvičeních klinické
biochemie.
Nové kalibrace se provádějí vždy
 se zavedením metody
 po nasazení nových šarží činidel či kalibrátoru
 je-li v interní kontrole jakosti indikována systematická chyba
 po opravě, úpravě, preventivní prohlídce a kontrole měřicího přístroje
 v souladu s požadavkem výrobce diagnostické soupravy na frekvenci kalibrací
2
Z praktického hlediska je výhodné, shoduje-li se oblast linearity s pracovním rozsahem, ne vždy tomu tak však je.
A
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 C
Obecný příklad průběhu nelineární kalibrační křivky
C = hodnoty kalibrátorů
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-9
3.3. Definitivní, referenční a rutinní metody měření
Základními zdroji správně určených hodnot jsou
 definitivní a
 referenční metody měření.
Definitivní (primární, absolutní) metody měření jsou určené zejména pro stanovení správnosti jiných
metod měření (referenčních a rutinních) a hodnot analytů v primárních referenčních materiálech
Jsou to kvalitativně nejvyšší metrologické metody, které, jsou-li uplatňovány, lze plně popsat a pochopit a
pro které lze poskytnout úplný rozbor nejistot v jednotkách SI, a proto lze jejich výsledky přijmout bez
odkazu na etalon měřené veličiny.
Definitivní metody
- vykazují nejvyšší metrologickou kvalitu
- jejich postup měření je zcela pochopen a je dokonale dokumentován
- mají přesně známou a dostatečně nízkou nejistotu měření
- jejich výsledky jsou vyjádřené v SI jednotkách
- jsou vysoce specifické
Tyto metody jsou prakticky nezávislé jak na prostředí v němž se sledovaný analyt nachází (tj. na tzv.
matrici
2)
), tak na jiném standardu (tj. výsledek nezávisí na kalibrátoru/standardu, ale vyplývá z metody).
Analýza materiálu primární (definitivní) metodou se provádí s úmyslem přiblížit se co nejtěsněji k „pravdivé
hodnotě“.
2)
Příklad rozdílných matric: stanovení Na
+
v séru – bílkovinná matrice, stanovení Na
+
v moči – matrice roztoku
elektrolytu, čili krystaloidní
Principy primárních/definitivních metod měření
 ID/MS resp. ID/GC/MS (tj. izotopová diluce čili ředění/hmotnostní spektrometrie resp. izotopová
diluce/plynová chromatografie/hmotnostní spektrometrie)
Při izotopové diluci kombinované s hmotnostní spektrometrií se ke stanovovanému analytu přidá izotop
analytu nebo analyt značený stabilním izotopem (např. deuteriem) jako vnitřní standard; nechá se ustavit
rovnováha mezi izotopy (případně značenou a neznačenou formou analytu) a pomocí hmotnostní
spektrometrie se změří poměr izotopů (resp. neznačený analyt/značený analyt).
Metoda je velmi přesná a nezávislá na matrici.
 gravimetrie (vážení)
 volumetrie (odměrná analýza) – k těmto dvěma principům není třeba cokoliv dodávat
 coulometrie (podrobnosti ke coulometrickým titracím viz kapitola 9, str. 9-34)
 snížení bodu tání (kryoskopie, podrobnosti viz kapitola 5, str. 5-5)
Referenční metody se používají pro posouzení správnosti rutinních metod a certifikaci laboratoří a
měřicích systémů.
Referenční metody
- mají dobře prozkoumaný a velmi podrobně popsaný postup měření
- mají dokumentovanou, uvedenou a dostatečně nízkou nejistotu měření
- navazují na primární metody měření, nebo na primární referenční materiály (tzv. návaznost na primární
metody či primární referenční materiály), jinými slovy, poskytují stejné nebo obdobné výsledky jako
metody primární
Referenční metody jsou na rozdíl od primárních metod do jisté míry výsledkem shody (domluvy) odborníků
a často představují soudobý maximální standard kvality (state-of-the-art, tj. na úrovni doby, nejmodernější).
Při jeho překonání vývojem, jsou nahrazeny metodami dokonalejšími. Primární metody jsou v podstatě
referenční metody nejvyšší kvality. Primární a referenční metody vykazují oproti metodám rutinním
především významně vyšší selektivitu.
Rutinní metody jsou metody užívané v běžném provozu v klinických laboratoří.
Mají návaznost na metody referenční. Některé rutinní metody mohou být metodami referenčními (např.
hexokinázová metoda při stanovení glukózy, coulometrické titrace při stanovení chloridových aniontů).
Někdy se lze setkat i s pojmem metody unifikované [unifikovaný = shodný, sjednocený, sourodý], čímž se myslí
metody, které byly doporučeny k všeobecnému používání; jsou to metody poskytující shodné výsledky
v laboratořích, které je používají; všeobecný profit z používání unifikovaných metod je zřejmý.
Vzájemné vztahy mezi definitivními, referenčními a rutinními metodami jsou uvedeny, spolu s kalibračními
materiály, na schématu „Návaznost“ na straně 3-10.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-10
3.4. Referenční materiály slouží kalibracím a kontrolám
Referenční materiály jsou určeny pro kalibrace přístrojů nebo pro verifikaci (ověření) měřicí metody.
V daném měření může být referenční materiál použit pouze buď pro kalibraci nebo k prokazování kvality.
Materiály určené ke kontrole kvality nelze používat jako kalibrátory.
Certifikovaný referenční materiál, CRM (VIM3), referenční materiál doprovázený dokumentem vydaným
způsobilou osobou a poskytuje jednu nebo více specifikovaných hodnot vlastností s přidruženými
nejistotami a návaznostmi s použitím platných postupů.
Příkladem mohou být komerční referenční materiály s přidělenými hodnotami koncentrací analytů a přidruženými
nejistotami měření uvedenými v připojeném certifikátu a sloužící jako kalibrátor, nebo jako kontrolní materiál
pravdivosti měření.
Primární referenční materiály – jsou validovány pomocí definitivních měřicích metod (jsou vztaženy na
pravdivé hodnoty).. Primární referenční materiály slouží k vývoji a validaci referenčních měřicích metod.
Sekundární referenční materiály – slouží k vývoji a přípravě kalibračních materiálů pro rutinní metody a jsou
zdrojem dat (hodnot) pro kontrolní materiály. Někteří autoři nehovoří o přípravě, ale uvádějí jako sekundární
referenční materiál přímo kalibrační a testovací materiál (CTM).
Kontrolní materiály – se používají ke sledování (monitorování) rutinních metod, tedy za účelem sledování
jakosti (kontroly kvality, QC), nikoliv k účelům kalibrace.
Metrologická návaznost, (metrological traceability) (VIM3), vlastnost výsledku měření, pomocí níž může
být výsledek vztažen ke stanovené referenci přes dokumentovaný nepřerušený řetězec kalibrací, z nichž
každá se podílí svým příspěvkem na stanovené nejistotě měření.
Referencí pro tuto definici může být definice měřicí jednotky nebo postup měření.
Myslím, že podstatu metrologické návaznosti (a také „reálné skalární veličiny přijaté dohodou“, se kterou jsme se
setkali u výkladu měřicích jednotek) velmi dobře objasní následující úryvek z úvodu publikace „Metrologie v kostce“,
což je překlad publikace „Metrology – in short” 3rd edition, July 2008, od autorů Preben Howarth, z Danish
Fundamental Metrology Ltd, a Fiona Redgrave, z National Physical Laboratory. (EURAMET project 1011, účastníci:
DFM Denmark,NPL United Kingdom, PTB Germany):
„Trest smrti hrozil tomu, kdo zapomněl nebo zanedbal svoji povinnost zkalibrovat své měřidlo délky při každém
úplňku. Takové bylo riziko královských architektů odpovědných za budování chrámů
a pyramid pro faraony ve starém Egyptě tři tisíce let před naším letopočtem. První královský loket byl definován jako
délka předloktí od lokte ke špičce nataženého prostředníčku vládnoucího faraona,
plus šířka jeho ruky. Prvotní měření bylo přeneseno na černou žulu a do ní vytesáno. Pracovníkům na staveništích byly
předány žulové nebo dřevěné kopie a architekti byli odpovědni za jejich udržování.“
Metrologická návaznost
 je nástroj pro zajištění správných výsledků
 a postup, který dává do vztahu naměřené hodnoty s hodnotami referenčního standardu.
Je důležité, aby kalibrační materiály používané v laboratoři navazovaly na referenční materiály vyššího
řádu, jak je zřejmé z následujícího obrázku (i z výše uvedené ukázky), který také asi nejlépe poslouží
pochopení návaznosti.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-11
Primární metodou je definován primární referenční materiál, na ten se nakalibruje referenční metoda, a ta je
následně zdrojem hodnot pro sekundární referenční materiál, který slouží ke kalibraci rutinních metod.
Referenční metody spolu s referenčními materiály také poskytují data pro přípravu kontrolních materiálů pro
vnitřní i vnější sledování jakosti/hodnocení kvality rutinních metod (viz dál). Útvar na obrázku vpravo svou
různou šířkou nahoře a dole vyjadřuje nejistotu jednotlivých metod.
Poznámka: Místo pojmu metrologická návaznost se často používá jednodušší pojem návaznost
Výsledky dosažené v různých laboratořích různými metodami by při zajištění metrologické návaznosti měly
pro stejný analyt poskytovat stejné výsledky (i když, velmi pravděpodobně) s různými nejistotami.
Výrobce přístrojů, reagencií, diagnostických souprav musí pro své výrobky provést tzv. validaci, čili ověřit,
že výrobek vyhovuje zamýšlenému použití (např. stanovení hodnot konkrétního analytu v krevním séru
člověka). Naměřené hodnoty (u diagnostických souprav jsou to např. linearita, meze stanovitelnosti,
nejistoty apod.) jsou součástí popisu daného výrobku.
Zdravotnická laboratoř pak musí ověřit (verifikovat), že uváděné hodnoty jsou platné v konkrétních
podmínkách konkrétní laboratoře.
Jedná se tedy v podstatě o (objektivní) potvrzení faktu, že daná metoda splňuje podmínky na ni kladené
Např.:
 je použita správná analytická metoda měření
 je použit správný analytický postup měření
 jsou zabezpečeny takové podmínky v preanalytické fázi, že je dosahováno správných a přesných
výsledků
 jsou použity vhodné a vyhovující přístroje
 je dostatečně správně ošetřena postanalytická fáze měření – vhodný počítačový program apod.)
Definice SI jednotky
Primární kalibrátor
Produktový kalibrátor výrobce
Pracovní kalibrátor výrobce
Referenční kalibrátor
Rutinní vzorek
Kontrolní materiál
Primární měřicí metoda
Měřicí metoda zvolená výrobcem
Referenční měřicí metoda
Stálá metoda výrobce
Laboratorní rutinní měřicí metoda
VÝSLEDEK
Vzorku pacienta
Vzorku kontrolního
NÁVAZNOST
Nejistota
Mezinárodní vědecké organizace
Výrobce IVD
Laboratoř
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-12
3.5. Automatizace a její role v klinické chemii
O úloze mechanizace a automatizace v klinických laboratořích byla již zmínka v kapitole věnované
preanalytické a částečně i postanalytické fázi laboratorního diagnostického procesu. K těmto pojmům
dlužno dodat ještě pojem další, robotizace, což je celosvětově užívané slovo původem od českého
spisovatele Karla Čapka, který slovo „robot“ použil v roce 1920 ve svém románu R.U.R., a to již v názvu
(Rossum´s Universal Robots). Má význam „umělý člověk“ a v pojmu robotizace budeme hledat činnosti,
které kopírují a nahrazují činnost člověka. Příkladem z klinické laboratoře může být „ruka“ přenášející
stojánky se zkumavkami z jednoho přístroje do druhého, vozík, který se sám naviguje a dorazí s nákladem
na určené místo apod. Oproti automatů vykazují roboty jednu důležitou schopnost: v kritické situaci mají
možnost volby, rozhodují se.
Automatizace laboratorních procesů zcela jistě zvýšila kvalitu laboratorní práce. Uvádí-li se, že chybovost
lidské práce je asi 5%, pak zavedení automatů snižuje tuto chybovost desetkrát, na hodnotu 0,5%, a to je již
významný posun. Proto byla do této kapitoly věnované analytické kvalitě zařazena i krátká zmínka o
automatických systémech používaných v klinických laboratořích.
3.5.1. Automatické analyzátory
První laboratorní pracoviště, která začala využívat automatické analyzátory, byla pracoviště klinické
biochemie.
Umožnil to
- vznik nových analytických metod (bez agresivních činidel a postupů ztěžujících automatizaci, jako
jsou var, deproteinace, centrifugace aj.)
- rozvoj výpočetní a přístrojové techniky.
V současné době existují automaty i pro postupy, o nichž se nepředpokládalo, že jsou automatizace
schopné: elektroforéza, heterogenní imunoanalýza, močová analýza pomocí diagnostických proužků,
močový sediment, krevní nátěry a mikroskopie diferenciálu bílé řady apod.
Automaty jsou přístroje pracující samostatně, autonomně [automatos, ř. = z vlastního podnětu]. Jsou to
přístroje opatřené zpětnou vazbou, která ovlivňuje vstup. Jsou tedy schopny regulace a samostatné, čili
autonomní práce. Rozvoj automatů byl umožněn rozvojem techniky a počítačové vědy.
Automaty ve formě automatických (chemických) analyzátorů vstoupily do našich laboratoří v osmdesátých
létech minulého století (v ostatní Evropě v létech sedmdesátých, počátky jsou na konci padesátých let),
masivního rozšíření se dočkaly počátkem devadesátých let. Rozvoj v tomto oboru stále pokračuje a přístroje
tohoto typu zastarávají relativně rychle (i když jsou použitelné poměrně dlouhou dobu – kolem 10 let).
3.5.2. Rozdělení automatických analyzátorů
Přehled rozdělení automatických analyzátorů
(Dělení převzato z J.Racek a kol.: Klinická biochemie)
Princip
dělení
Typ analyzátoru Princip dělení Typ analyzátoru
Způsob
práce
centrifugální
Velikost a rychlost
analyzátoru
malé
průtokové (kontinuální) střední
diskrétní velké
Princip
měření
optické systémy
Pořadí prováděných testů
batch mode
elektrochemické systémy random access
kombinované systémy Prostředí v němž probíhá
reakce
roztok
(„mokré“ analyzátory)
Počet
prováděných
metod
jednoúčelové „suchá chemie“
pro několik vybraných metod
Zařazení v diagnostickém
procesu
centrální
mnohoúčelové
bed-side
kombinované
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-13
3.5.2.1. Dělení podle způsobu práce
 centrifugální
„Boom“ těchto přístrojů zdánlivě pominul. Vznikly
z potřeb kosmického výzkumu – gravitační pole je
vytvářeno centrifugální silou, rotací. V těchto přístrojích
tvoří pracovní prostor, „kyveta“, ve kterém probíhá
reakce, součást rotoru/disku. Kyveta se skládá z několika
navzájem spojených částí, do kterých se pipetuje vzorek
a jedna případně dvě reagencie. Ke vzájemnému spojení
roztoků a promíchání dochází po roztočení rotoru/disku
odstředivou silou. Svou roli hrají i síly kapilární. Světelný
paprsek fotometru prochází kyvetou zezdola nahoru, či
opačně. Vlastní měření je velmi rychlé, nicméně je
možno provádět vždy jen jeden typ reakcí (např. stanovit
ALT, močovinu nebo glukosu apod.), tj. přístroj pracuje „po
metodách“ (batch mode). Pokusem o robotizovaný
centrifugální analyzátor byl přístroj MONARCH fy IL Instruments, který používal rotory na jedno
použití, využíval robotické prvky a díky propracovanému softwaru bylo možno stanovit několik
analytů vedle sebe (odložení rotoru na inkubační místo a práce s druhým rotorem, poté návrat
k práci s původním rotorem atd.). Pokus však nebyl příliš úspěšný. V současné dochází k oživení
centrifugálního principu zejména v malých přístrojích typu POCT, pro humánní i veterinární
medicínu. Příkladem může být malý chemický analyzátor Piccolo
Express od firmy ABAXIS, který má k dispozici několik specifických
disků – panelů de facto souborů, čili lze stanovit několik parametrů
současně (nikoliv ovšem jednotlivý parametr). BioChemistry Panel
Plus panel zmiňovaného přístroje umožňuje současné stanovení
albuminu, alkalické fosfatázy, alaninaminotransferázy, amylázy,
aspartátaminotransferázy, močoviny, kalcia, kreatininu, C-reaktivního
proteinu, gamaglutamyltransferázy, glukosy, celkové bílkoviny a
kyseliny močové, tedy celkem 13 parametrů.
 průtokové (kontinuální)
V těchto analyzátorech procházel vzorek a reagencie systémem hadiček, vzájemně odděleny
vzduchovou
bublinou. Na
vhodném místě
došlo k promíchání
vzorku a reagencií
(oddělily se
vzduchové bubliny a
reagencie se
vzorkem prošly
spirálově stočenou
hadičkou), ve
vyhřívané oblasti
k inkubaci (průběh
vlastní reakce) a
fotometrii v průtokové
kyvetě. Metoda analýzy
se nazývá kontinuální
průtoková analýza
(CFA), případně segmentovaná průtoková analýza (segmented flow analysis, SFA). Zdokonalený
způsob se nazývá FIA, průtoková injekční analýza (flow injection analysis), která je obdobná SFA,
ale do systému není zaváděn vzduch. Příkladem (SFA) jsou přístroje firmy Technikon Corporation.
Přístroj této firmy AutoAnalyzer byl prvním automatických analyzátorem, který byl použit v klinických
analýzách, a to již v roce 1957 a zcela změnil dosavadní charakter práce. (Firma Technicon prodala
v roce 1980 tuto část své činnosti firmě Revlon, která o sedm let později učinila totéž a prodala firmu
společnosti Bayer. Vlastníkem této části Bayeru je v současnosti firma Siemens).
Piccolo Express
Piccolo Express – rotor/disk
Technicon AutoAnalyzer II (AAII)
Uveden firmou Technicon®
v roce 1972, dosud po celém světě pracují stovky těchto přístrojů,
mnoho z nich ještě s logem firmy Technicon®
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-14
 diskrétní
Zde dochází k oddělenému (čili diskrétnímu) pipetování vzorku a reagencií do reakčních nádobek
(kyvet), k promíchání míchadlem a následné (po určité
inkubační době) fotometrii. Kyvety jsou buď
k jednorázovému použití a musí se proto do přístroje
stále doplňovat, nebo je přístroj vybaven mycí stanicí,
kyvety jsou promývány a opakovaně používány. Jsou to
nejrozšířenější analyzátory a příkladem jsou např.
analyzátory firmy Hitachi (704, 717, 917, MODULAR),
Olympus (AU 400, AU 640, AU 2700, AU 5400), Abbott
(AEROSET, ARCHITECT) aj. Analyzátory Dade Behring
Dimension
®
používají plastické kyvety na jedno použití,
které si analyzátor vytváří sám ze speciální fólie; po zatavení
slouží současně jako snadno skladovatelný, přepravovatelný a
spalitelný sáček s odpadem.
3.5.2.2. Dělení podle principu měření
 optické systémy
Jsou nejčastější. Principem je klasická fotometrie v UV/VIS
oblasti, umožňující i turbidimetrická měření. Moderní
analyzátory většinou mají možnost pracovat současně s minimálně dvěma vlnovými délkami
(bichromatické měření), což zpřesňuje analýzy
 elektrochemické systémy
Mají za princip potenciometrii, amperometrii, konduktometrii apod. Tyto systémy umožňují pracovat
bez ohledu na optické vlastnosti vzorku (hemolýza, zákal), tedy i v plné krvi. Na elektrochemických
principech pracují analyzátory na stanovení pH a parciálního tlaku krevních plynů (AB rovnováha),
ale také stále častěji ke stanovení koncentrace iontů (Na
+
, K
+
, Cl
)
a ionizovaných frakcí (Ca
2+
,
Mg
2+
), prostřednictvím tzv. iontově selektivních elektrod (ISE). ISE s imobilizovaným enzymem
v membráně tvoří tzv. enzymovou elektrodu, vhodnou ke stanovení různých substrátů (glukosa – viz
kapitola 7. Glukosa, laktát, močovina, kreatinin). Tyto elektrody bývají ve velmi rychlých statimových
analyzátorech (pro omezený počet základních analýz). Analyzátor tohoto typu provede základní
vyšetření z několika kapek krve během několika desítek sekund (většinou do minuty).
 kombinované systémy
Jsou velmi časté – např. většina moderních analyzátorů
pracujících na optickém principu obsahuje tzv. ISE-modul
pro stanovení iontů na elektrochemickém principu.
 integrované systémy
Kombinace biochemického a imunochemického
analyzátoru.
3.5.2.3. Dělení podle počtu prováděných metod
 jednoúčelové
Provádějí jednu, vysoce frekventní metodu – typickým příkladem jsou glukózové analyzátory
 pro několik vybraných metod
Provádějí několik společně požadovaných metod: např.
acidobazické analyzátory, analyzátory iontů, kombinace
acidobazických analyzátorů s iontovým modulem, analyzátory pro
současné stanovení glukosy, močoviny, kreatininu apod.
 mnohoúčelové
Selektivní výběr metod z nabídky několika desítek metod, často
lze volit i druh analýz (biochemické analýzy, analýzy lékových
hladin, imunochemické analýzy apod.)
Vitros
®
5600 Integrovaný systém
ABBOTT Architect c4000
BIOSEN C-line Clinic
Analyzátor glukózy a laktátu
firma EKF Diagnostics
Měřicí kyvety analyzátorů
Dade Behring Dimension
®
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-15
 kombinované
Kombinované analytické systémy složené z několika výše uvedených přístrojů, řízené počítačem
z jednoho centra (např. dva analyzátory s výkonem 1000t/hod poskytují kombinovaný systém
s výkonem 2000 t/hod.).
3.5.2.4. Dělení podle velikosti a rychlosti analyzátoru
 malé: zpracovávají do 300 testů/analýz za hodinu
 střední: zpracovávají zhruba 400 – 800 testů/h
 velké: zpracovávají nad 1000 testů/h, někdy 2 i 3 tisícwe testů za hodinu, případně i více
Toto dělení je ovšem individuální a pouze přibližné
3.5.2.5. Dělení podle pořadí prováděných testů
 pracující podle metod
Tzv. „batch mode“ analyzátory. Typickým příkladem jsou centrifugální (ale i jiné) analyzátory. U
všech vzorků se nejprve zpracuje jeden typ analýzy, pak druhý atd. U těchto přístrojů je
předpokladem tzv. uzavřený příjem materiálu a jsou problémy např. se statimovými vzorky
 pracující „po pacientech“
Tzv. „random access“ analyzátory, čili analyzátory s náhodným přístupem. Analyzátor provádí
všechny analýzy postupně pro jednotlivé pacienty, jak byly zadány požadavky (např. pro pacienta č.
1 – ALT, AST, BIL, GLUK, pro pacienta č. 2 – močovinu, kreatinin, kyselinu močovou atd.).
Nejrozšířenější typ analyzátorů
3.5.2.6. Dělení podle prostředí v němž probíhá reakce
 roztok
Převážná většina analyzátorů pracuje s roztoky reagencií, tj. reagencie jsou buď přímo od výrobce
v kapalné formě, nebo se, např. z práškových či lyofilizovaných chemikálií, roztoky připraví
rozpouštěním destilovanou vodou
 „suchá chemie“ (dry chemistry)
Tento typ přístrojů využívá chemikálie imobilizované ve vrstvě celulózy želatiny, kde po zvlhčení
(vzorkem) dojde k vývinu zbarvení, které je možno měřit reflexní (tj. odraznou – paprsek zbarvením
neprochází, ale odráží se) fotometrií. Typickým příkladem jsou reagenční proužky pro analýzu moči.
Existují však i diagnostické proužky pro stanovení celé řady analytů v plné krvi pacienta (pracuje
s nimi např. přístroj REFLOTRON fy Roche Diagnostics). Firma Kodak vyvinula řadu vícevrstevných
filmů určených pro klinicko-biochemické analýzy v séru; jednotlivé vrstvy slouží k separaci, reakcím
pomocným i konečné reakci s vývinem zbarvení. Tyto filmy se používají v analyzátorech EKTACHEM,
které tvoří celou výkonnostní řadu od malých po velké přístroje. Práce s těmito analyzátory je velmi
„čistá“, s malým snadno spalitelným odpadem, je však
dražší a filmy jsou vyvinuty pro omezený, i když široký,
okruh analýz
Ilustrativní ukázka konstrukce
vícevrstvého filmu (slide) fy Kodak
Slovníček pojmů k obrázku:
Mount podložka, podpora, držák
Upper horní
Lower dolní
Slide film, slide
Layer vrstva
Spreading roznášecí, rozdělující
Reagent reagenční
Semipermeable polopropustná
Indicator indikační
Support podpora, opora
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-16
3.5.2.7. Dělení podle zařazení v diagnostickém procesu
Analyzátory
 centrální
Analyzátor umístěný v centrální laboratoři a provádějící podstatnou část rutinních (případně i
speciálních) analýz požadovaných po laboratoři
 u lůžka pacienta
Menší analyzátory jednoúčelové, či s omezeným
spektrem metod, na principu suché chemie nebo
na elektrochemických principech umožňující tzv.
bed-side diagnostics (diagnózu u lůžka pacienta),
point-of-care testing (testování, vyšetřování
v laboratorních koutech), near-patient testing
(testování, vyšetřování v blízkosti pacienta)
Reflotron Plus®
Přenosný analyzátor určený do
ambulancí praktických lékařů, případně
k lůžku pacienta. Principem je „suchá
chemie“. Fa ROCHE s.r.o.
Poznámka: Mezi výkonnostními parametry analyzátoru je někdy
uváděn i parametr WALKAWAY, což je doba, za kterou přístroj
provede maximálně možný počet analýz bez zásahu obsluhy (tj.
přístroj se maximálně naplní, zadá se maximální počet požadavků
a obsluha může“ walkaway“ – odejít, a vrátit se až po této době,
kdy budou analýzy provedeny. Pak může doplnit reagencie...
atd.).
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-17
3.6. Některé vybrané analyzátory
Zde jsou na obrázcích ukázány některé (namátkou) vybrané analyzátory
Biochemické analyzátory ADVIA 1600 (Siemens) a Vitros 5,1 FS (Ortho-Clinical Diagnostics a Johnson-Johnson company)
Kombinované analyzátory Architect ci8200 (Abbott) vlevo a Dimension®
RxL (Dade Behring) vpravo
Beckman-Coulter AU480
Kompaktní, středně výkonný a spolehlivý,
rozšířený analyzátor s vynikajícími ISE
Olympus AU5400
Dva analyzátory AU2700 tvořící vysoce
výkonný kombinovaný systém
VITROS 5.1 představuje kombinaci „mokré“ a „suché“
chemie. Základem je původní EktaChem doplněný o
mokrou chemii v „mikro“ provedení (malé nádobky, malé
objemy)
ADVIA 1600, výkonný automaticky analyzátor firmy
Bayer (dnes Siemens) svého času poměrně hojně
rozšířený v ČR
Dva spojené analyzátory – biochemický
a imunochemický; díky patentovanému
mytí dávkovačů lze pracovat s primární
zkumavkou bez tvorby alikvotů
Biochemický analyzátor
s heterogenním modulem pro
imunoanalýzu.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-18
Modulární analytický sytém cobas®
6000 a Cobas (vlevo) a stolní imunochemický analyzátor Cobas e411 (Roche)
Stolní imunochemický analyzátor Elecsys®
2010 a modulární imunochemický analyzátor Modular®
E170 (Roche)
Biochemické analyzátory firmy Beckman-Coulter
Představitel analyzátorů řady UniCel®
DxC
Synchron LX systém
Synchron CX systém Dimension Vista 1500 Intelligent Lab System
v sobě skrývá 4 technologie
(ISE, fotometrie, nefelometrie, imunochemie)
Analyzátor firmy Siemens
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-19
Podrobnosti o analyzátoru Evidence
®
Investigator lze nalézt na odkazu:
http://www.randox.com/Evidence%20Investigator.php, kde si lze stáhnout i brožuru o biochipové technologii
použité v tomto přístroji.
Podrobnosti včetně videa k analyzátoru Evidence®:
http://www.selectscience.net/suppliers/randox-laboratories-
ltd/?compID=7614&u=62E1AFE0-3EB2-46A2-852F-
E564D43E7F2E
A k analyzátoru Evidence Evolution:
http://www.selectscience.net/products/evidence-
evolution/?prodID=86723&u=62E1AFE0-3EB2-46A2-
852F-E564D43E7F2E&techBID=116
Evolution je celosvětově první plně automatický
imunochemický sytém typu random access na
platformě biochipové technologie. Systém je schopen
provést 2940 testů za hodinu, pracovat v modu batch i
true random access a okamžitý STAT. Systém je
napojitelný na perianalytický modul s radiofrekvenční
identifikací vzorků.
První plně automatizovaná laboratorní linka Power Procesor Beckman-Coulter v Čechách, v klinických
laboratořích KlinLab s.r.o. v Praze (Immunotech a.s.)
Nejedná se o úplnou automatizaci, ale o vysoký stupeň automatizace, který je z obrázků patrný.
Realizace linky: firma Immunotech a.s.
Evidence Evolution
Přístroje na bázi proteinové biočipové technologie firmy Randox
Vlevo Evidence® Investigator (poloautomat) a vpravo automatický analyzátor Evidence®
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-20
3.7. Několik poznámek k analytickým reakcím
3.7.1. Dvě důležité analytické reakce v klinické biochemii
V klinické biochemii se můžeme setkat s analytickými reakcemi různých typů, nicméně dvě z nich zaujímají
svým způsobem významné postavení. Jsou to modifikovaná Trinderova reakce a optický či UV test.
3.7.1.1. Modifikovaná Trinderova reakce
V roce 1940 popsal Emerson vysoce citlivou barevnou reakci fenolů s 4-aminoantipyrinem v přítomnosti
oxidačního činidla, jejímž výsledkem jsou chinoniminová barviva. Jedná se zde o spojení (kopulaci) dvou
činidel za oxidačních podmínek, proto se tento typ reakce obecně nazývá oxidační kopulace. V roce 1969
Trinder použil tuto reakci v uspořádání, ve kterém jako oxidační činidlo využil peroxid vodíku rozložený
peroxidázou. Tato Trinderova reakce bývá často, vzhledem k výše uvedené skutečnosti, nazývána
Emerson-Trinderovou reakcí. Reakce se stala předmětem bádání za účelem zlepšení jejích analytických
vlastností. Při této činnosti se došlo k závěru, že místo prostého fenolu, je lépe použít fenol substituovaný,
např. 4-chlor-3-methyl-fenol. Uspořádání se substituovanými fenoly pak nesou název modifikovaná
Trinderova reakce.
Na schématu je „klasická“ Trinderova reakce. Modifikovaná
Trinderova reakce by obsahovala místo fenolu např. již
zmíněný 4-chlor-3-methyl fenol nebo 3-methylfenol (jak je tomu
v případě reagencií fy Erba Lachema, viz kap.7, str.7-2) apod.
Při stanovení konkrétního analytu (glukosa, cholesterol...) předchází Trinderově reakci oxidace tohoto
analytu za tvorby jeho oxidované formy a peroxidu vodíku a Trinderova reakce tak slouží v podstatě ke
stanovení H2O2.
V případě cholesterolu je to ještě o něco složitější, protože prvním z reakčních sledů je hydrolýza esterů
cholesterolu, které tvoří převažující formu výskytu tohoto analytu v séru/plazmě/krvi a jako takové by
oxidovat nešly, protože oxidovatelná OH- skupina cholesterolu je vázána právě v esteru.
Jakékoli vedlejší/soutěživé reakce odčerpávající peroxid vodíku snižují výtěžnost (Trinderovy) reakce a
poskytují falešně nižší výsledky (např. reakce s kyselinou askorbovou a některými léčivy).
Obecné schéma tohoto typu analytické reakce
analyt oxidovaný analyt + H2O2
4-aminoantipyrin + substituovaný fenol chinoniminové barvivo
peroxidáza (POD)
N
N
OCH3
CH3 NH2
+
OH
O
N
NCH3
CH3 N
+ 4 H2O
2H2O2
POD
4
aminoantipyrin
fenol
chinoniminové barvivo
OH
CH3
Cl
4-chlor-3-methyl-fenol
OH
CH3
3-methyl-fenol
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-21
Využití modifikované Trinderovy reakce
Stanovení
 glukózy (metoda GOD/POD) – kapitola 7, str. 7-2
 kreatininu (enzymové stanovení, barevný test) – kapitola 8, str. 8-7
 kyseliny močové (enzymové metody) – kapitola 8, str. 8-13
 cholesterolu (enzymové metody) – kapitola 14, str. 14-4
 triacylglycerolů (enzymové metody) – kapitola 14, str. 14-6.
3.7.1.2. Optický/UV test
Tento typ analytické reakce využívá skutečnosti, že redukovaná forma NAD/NADP má jiné fyzikálněchemické
vlastnosti než forma oxidovaná. Chemicky správné zápisy těchto dvou nukleotidů vypadají takto:
Pro stručnost bývá někdy formálně správný, ale poněkud zdlouhavý zápis redukované formy nahrazován
méně správným, zato však rychlejším (a možná i přehlednějším) zápisem NADH2/NADPH2 (někdy i pouze
NADH/NADPH) a zkratky názvů oxidovaných forem se často píší bez kladného znaménka.
Redukované formy, na rozdíl od forem oxidovaných, absorbují záření o vlnové délce 340 nm, absorpční
křivky těchto forem tedy budou mít rozdílný průběh:
.
Oxidovaná forma Redukovaná forma
NAD
+
NADH + H
+
NADP
+
NADPH + H
+
Redukovaná forma
NADH2/NADPH2
Oxidovaná forma
NAD/NADP
Průběh absorpční křivky dvou forem NAD/NADP
Lze si představit, že při přeměně NAD(P) na NAD(P)H2 v kyvetě, kterou bude
procházet záření o vlnové délce 340 nm, bude na výstupu pozorovatelný
nárůst absorbance.
Při přeměně NAD(P)H2 na NAD(P) tomu bude opačně.
vlnová délka [nm]
A
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-22
3.7.2. Průběhy analytických reakcí jsou důležité
V této části textu jsou ukázány nejobvyklejší formy časového průběhu chemických reakcí připadající
v úvahu v laboratořích klinické biochemie a způsoby jejich vyhodnocování a zjišťování výsledku.
Na jednoduchých grafech jsou znázorňovány reakční koordináty, tj. průběhy závislosti signálu/indikace
(nejčastěji absorbance) na čase a principy vyhodnocení.
3.7.3.1. End point
Reakce dosáhne po určité době koncového bodu (end point), kdy rychlost přeměny výchozích složek na
produkty rovná se přeměně produktů na výchozí složky. V obecném schématu reakce se rychlosti v1 a v2
sobě rovnají: v1 = v2.
Měří-li se absorbance vznikajícího produktu (většina případů), pak od okamžiku vyrovnání rychlostí se její
hodnota nemění. Měří se hodnota absorbance dosažená v tomto koncovém bodu. „Přetažení“ doby
inkubace není rozhodující, pokud výsledný produkt je stabilní.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 1 2 3 4 5
A340
čas v minutách
Závislost nárůstu absorbance při 340 nm
na stoupající koncentraci NAD(P)H
A
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 čas
A + B C + D
v1
v2
Poznámka: při kalibraci se vynášejí na osu x
hodnoty koncentrací analytu v kalibračních
roztocích a na osy y hodnoty absorbance
naměřené pro tyto jednotlivé koncentrace.
Obrázek ukazuje jak může například vypadat
průběh závislosti absorbance na čase
v případě reakce end point.
V pracovním návodu pro tuto metodu bude
uvedena, jak vyplývá z obrázku, např. tato
formulace: „Inkubujte 5 minut a změřte
absorbanci roztoku při xxx nm“.
A
t
Lze měřit rychlost průběhu reakce, tj. změnu
absorbance za časovou jednotku, čili poměr A/t ,
přesněji A/1 min
Většinou se měří změna absorbance za 3 minuty a
dělí se třemi (při manuálním provedení) nebo se
nastaví vhodný čas, resp. počet měřicích bodů
v automatickém analyzátoru. Zde záleží na
možnostech analyzátoru.
Při opačném průběhu reakce má graf opačný průběh
(křivka směruje dolů), princip měření však zůstává
zachován.
Podrobnosti jsou uvedeny dále v textu.
Využití tohoto typu reakce je značné, jak vysvitne
z dalších částí tohoto učebního textu.
A za
5 časových
jednotek
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-23
3.7.3.2. Kinetické měření
Reakce probíhá tak rychle, že je možno za časovou jednotku, nejčastěji 1 minutu, zaznamenat zřetelný
nárůst či pokles absorbance. V anglosaské literatuře se nazývá tento způsob měření rate (rychlost, ev.
poměr). V grafickém znázornění vypadá princip měření takto:
Poznámka: při kalibraci se vynášejí na osu x hodnoty koncentrací analytu v kalibračních roztocích a na
osy y hodnoty Amin naměřené pro tyto jednotlivé koncentrace.
3.7.3.3. Měření v konstantním čase
Měření v konstantním čase (v anglosaské literatuře fixed time) je podobné měření kinetickému. Neměří se
ale změna absorbance za jednu minutu, ale za určitý (konstantní) čas, např. 10, 20 nebo 30 minut, tzn. od
času „nula“ do času „10“, „20“, „30“....., měří se tedy absorbance dosažená po určité době. „Přetažení“
inkubační doby by vedlo k falešně pozitivním výsledkům, je tedy třeba přesně dodržet inkubační čas. Toho
se dosahuje např. zastavením reakce v konkrétním čase inhibitorem. Při analýze na automatickém
analyzátoru není třeba reakci zastavovat, analyzátor přesně měří časové intervaly.
A
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
čas
A
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
čas
Na obrázku je znázorněno měření
změny absorbance (A) v daném
případě v tříminutovém intervalu.
Změna absorbanc za jednu minutu
se získá vydělením naměřené
změny absorbance A3m třemi:
A = A3m/3
Podmínkou pro tento způsob
měření je lineární průběh závislosti
absorbance na čase. U kinetických
měření enzymových se toleruje
maximálně 15% odchylka od
linearity průběhu.
N
a
p
m
P
p
re
o
in
A
č
a
n
A6m
A3m
 3 min
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-24
3.7.3.4. Dvoubodové měření
Dvoubodové měření (v anglosaské literatuře two point, 2P) je obdobou měření v konstantním čase. Měření
nezačíná však v čase „0“, tj. na počátku reakce, ale až po uplynutí určité doby, v měřicím bodě P1.
Dvoubodové měření je obvyklé při analýze na automatických analyzátorech, kdy první měřicí bod (P1) se
obvykle určuje tak, aby měření absorbance proběhlo těsně po přidání vzorku a druhý bod buď po určité
době průběhu reakce (fixed time), nebo po dosažení rovnováhy (end point – viz následující schéma).
3.8.4. Vyčerpání reakční směsi
Zde se nejedná o způsob měření, ale o častý úkaz v denní praxi
klinické biochemie. Může se stát, že během reakce dojde k takovému poklesu koncentrace součásti či
součástí reakční směsi, že reakce přestane probíhat. Tento jev je obvyklý zejména při enzymových reakcích
(viz kapitola 12), kdy stanovovaný analyt se může vyskytovat v analyzovaném vzorku v takovém množství,
že dojde k překročení katalytických možností enzymu či ke spotřebování substrátu a k praktickému
zastavení reakce.
A
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
čas
A
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 čas
AP1-P2
P1 – P2
Reakce s koncentrací analytu v oblasti linearity metody by
měla probíhat podle zelené čáry (pokles absorbance v čase).
Při výrazném nadbytku např. stanovovaného enzymu však
reakce probíhá zpočátku výrazně rychle a po krátké době
dochází ke spotřebování substrátu a praktickému zastavení
reakce.
Pokud bylo (kinetické) měření nastaveno např. mezi 2. a 5.
časovým úsekem (zelená šipka) je ve skutečnosti naměřena
falešně nízká hodnota. Automaty mají funkce, které hlídají
tyto skutečnosti: např. je limitovaná rychlost změny
absorbance s časem, je hlídaná spodní (či horní) hranice
(limita) absorbance apod.
Při tzv. reflexním retestování automat posune oblast měření,
např. v tomto případě by to mohlo být mezi body 0-1, tzn., že
změří počáteční rychlost reakce.
Na obrázku je znázorněno měření
absorbance (AP1-P2) v daném
případě mezi časovými úseky
2 – 6.
Při pohledu na ilustrační obrázek
je potřeba si uvědomit, že průběh
reakce v čase nemusí být takto
lineární (jak je požadováno pro
měření typu rate), ale lze
dvoubodově měřit např. reakce
typu end point.
A P1-P2
P1 P2
Při tomto nastavení metody
dochází v podstatě k „blankování“
zabarvení či zakalení vzorku a
není pro tyto případy třeba stavět
speciální „slepý“ (blank) vzorek.
Poznámka: při kalibraci metody se na osu x
vynášejí hodnoty koncentrace kalibračních
roztoků a na osu y naměřené hodnoty
absorbance (v daném příkladu AP2-P6) pro
tyto koncentrace.
A3m
A3
m
Tato uspořádání mají tu výhodu, že
lze odečíst „sérový blank“, tzn.
vlastní zabarvení vzorku
biologického materiálu. Významné
např. u stanovení bilirubinu.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-25
3.9. Dodatek
3.9.1. Vybrané pojmy a definice z metrologie
Měření (VIM3) je proces experimentálního získávání jedné nebo více hodnot veličiny, které mohou být
důvodně přiřazeny veličině.
Poznámka: Od začátku je třeba vzít na vědomí, že každý vědní obor má nejen svou terminologii, ale i určitá slovní
spojení a způsob vyjadřování. Např. v právě uvedené definici je pod slovním spojením „mohou být důvodně přiřazeny“
možno tušit např. skutečnost, že jsme změřili nějaký délkový rozměr (délka = jedna z veličin) a protože jsme měřili
správným postupem a kalibrovaným měřidlem, můžeme změřený výsledek (např. 1, 35 m) oprávněně (tedy i
důvodně) považovat za hodnotu, kterou daná, měřená veličina má, čili, jinými slovy, jsme tuto hodnotu veličině
přiřadili.
Veličina (VIM3) je fyzikální nebo chemická vlastnost jevu, tělesa nebo látky, která má velikost, jež může
být vyjádřena jako číslo a reference.
Poznámka I: reference = odkaz, odvolávka, odvolání, vztah, poukázání; tímto odkazem může být např. měřicí jednotka
(2,0 mmol/l, kde číslo je 2,0 a reference je mmo/l), nebo postup měření, referenční materiál či jejich kombinace.
Poznámka II: od pojmu „fyzikální nebo chemická vlastnost…., která má velikost“ je třeba odlišit pojem “jmenovitá
vlastnost“, což je vlastnost jevu, tělesa nebo látky, kde vlastnost nemá velikost (pohlaví člověka, barva vzorku nátěru,
barva při kapkové zkoušce v chemii, pořadí aminokyselin v polypeptidu apod.). Jmenovitá vlastnost má hodnotu,
která může být vyjádřena slovně, číslicemi, písmeny, či jinak. Pro jmenovité vlastnosti se nepoužívá měření. V této
souvislosti je vhodnější používat pojem „vyšetření“.
Poznámka III: Veličina je český výraz pro latinské quantitas, množství, počet (odvozeno od quantum, tj. kolik, jak
mnoho). V angličtině má podobu quantity, kde latinský původ je zřejmý (na rozdíl např. od němčiny, kde tu latinu není
znát – messgrösse, ale význam je stejný; francouzské vyjádření grandeur zcela odpovídá výrazu v češtině).
Měřicí jednotka (VIM3), reálná skalární veličina, definovaná a přijatá konvencí, se kterou může být
porovnávána jakákoliv jiná veličina stejného druhu vyjádřením podílu veličin jako čísla. Zkrácený název je
jednotka, často se používá v kombinaci s názvem veličiny, např. hmotnostní jednotka nebo jednotka
hmotnosti. Měřicí jednotky jsou označovány konvencí přidělenými názvy a značkami.
Poznámka: „podíl veličin...“ vlastně vyjadřuje „kolikrát je měřicí jednotka obsažena v naměřené hodnotě veličiny“
Mezinárodní soustava jednotek (VIM3), soustava jednotek založená na Mezinárodní soustavě veličin,
jejich názvech, značkách, včetně řad předpon a jejich názvů a značek, společně s pravidly pro jejich použití,
přijatá Generální konferencí pro váhy a míry (CGPM).
Hodnotou veličiny (VIM3) se rozumí číslo a reference, které společně vyjadřují velikost veličiny.
Příklady: délka tyče 1,25 m, resp. 125 cm; hmotnost objektu 0,534 kg, resp. 534 g; teplota daného vzorku +18 °C.
Číselná hodnota veličiny (VIM3), číslo ve vyjádření hodnoty veličiny kromě jakéhokoliv čísla sloužícího
jako reference.
Příklady: ve výše uvedených příkladech hodnot veličiny, jsou číselnými hodnotami veličiny čísla 1,25/125; 0,534/534,
18. Je zřejmé, že číselná hodnota veličiny v daných příkladech závisí na měřicí jednotce.
Referenční hodnota (veličiny) (VIM3): hodnota veličiny používaná jako základ pro porovnání s hodnotami
veličin stejného druhu.
Poznámka: Referenční hodnotou veličiny může být pravá hodnota veličiny měřené veličiny, nebo konvenční hodnota
veličiny. Referenční hodnota veličiny s přidruženou nejistotou měření je obvykle poskytována s referencí k materiálu,
např. certifikovanému referenčnímu materiálu, k zařízení, např. stabilizovanému laseru, k referenčnímu postupu
měření, k porovnávání etalony (standardy).
Odvozená veličina (VIM3) je veličina v soustavě veličin definovaná pomocí základních veličin této
soustavy.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-26
Příklad: V soustavě veličin, která má za základní veličiny délku a hmotnost, je hustota odvozenou veličinou
definovanou jako podíl hmotnosti a objemu (což je třetí mocnina délky).
Další odvozené veličiny: Plošný obsah, objem, rychlost, hustota, poměrná hustota, síla, tíha, práce, energie, výkon,
dynamická viskozita, povrchové napětí, tlak, kmitočet, frekvence otáčení (otáčky), vlnová délka, Avogadrova
konstanta, molární zlomek, molalita, elektrický náboj, elektrický potenciál, kapacita, hustota elektrického proudu,
odpor (rezistance), elektrická vodivost, aktivita, poločas (přeměny), ozáření.
Odvozená jednotka (VIM3) , měřicí jednotka pro odvozenou veličinu
Příklad: Kilometr za hodinu, značka km/h je odvozenou měřicí jednotkou rychlosti, ale mimo SI (nicméně jej přijatá pro
použití s SI). Tzv. koherentní odvozenou jednotkou rychlosti v soustavě SI je metr za sekundu (m/s). Mol na metr
krychlový (mol/m
3
resp. mol.m
-3
) je koherentní odvozená jednotka látkové koncentrace.
Základní jednotka (VIM3), měřicí jednotka, která je přijata konvencí pro základní veličinu. V každé
koherentní (tj. souvislé, systémové, soudržné, logické) soustavě jednotek (takovou je např. Mezinárodní
soustava jednotek SI) existuje pro každou základní veličinu pouze jedna základní jednotka.
Soustava jednotek (VIM3), soubor základních jednotek a odvozených jednotek, společně s jejich násobky
a díly, stanovený v souladu s danými pravidly pro danou soustavu veličin.
Poznámka: Koherentní soustava jednotek je soustava jednotek založená na dané soustavě veličin, ve které měřicí
jednotka pro každou odvozenou veličinu je koherentní odvozenou jednotkou.
[koherentní = souvislé, systémové, logické]
Příklad: Soustava koherentních jednotek SI a vztahů mezi nimi. Uvědomme si, že SI neplatí až tak dlouho. Ti starší
z nás se učili jinou koherentní soustavu jednotek, a to CGS, tj. „centimetr, gram, sekunda“, kde základní jednotky jsou
zřejmé z názvu soustavy.
Měřená veličina je veličina, která má být měřena..
Poznámka: veličiny lze chápat v obecném smyslu (délka, čas, látkové množství...) a v konkrétním smyslu (délka
konkrétní tyčky, koncentrace bilirubinu v konkrétním krevním vzorku). Measurand (měřená veličina) je konkrétní
veličina subjektu, který má být měřen.
Příklady měřených veličin (s ohledem na prostředí klinické biochemie): látková koncentrace, hmotnostní koncentrace,
katalytická koncentrace, látková a hmotnostní změna aj. (elektrolytů, proteinů, prvků, metabolitů apod.).
Zde si je třeba uvědomit skutečnost, že měření, měřicí systém a podmínky za jakých je měřeno, mohou
měnit jev, těleso nebo látku tak, že veličina, která je (právě) měřena, se může lišit od měřené veličiny jak je
definována. V tomto případě je nutno použít odpovídající korekci.
Příklad: odměrné nádobí kalibrované na teplotu 25 °C ale vytemperované na teplotu místnosti 23 °C bude poskytovat
výsledky, které je nutno korigovat na definovanou teplotu 25 °C; hodnoty naměřené urinometrem je nutno korigovat
na přítomnost bílkovin, glukózy apod.
Systém. Český výraz pro systém je soustava. Z toho lze intuitivně vytušit, že se jedná o souhrn prvků, které
spolu nějakým způsobem souvisejí tak, že tvoří smysluplný celek. Systém je vymezen hranicemi, a to
hranicemi skutečnými nebo myšlenými a oblast mimo tyto hranice se nazývá okolí. Systémem v dané
souvislosti může být například organismus, pacient, orgán, tkáň, buňka, chemická látka. Systém studovaný
v klinických laboratořích může být odvozen nebo připraven z biologického materiálu.
Komponenta, čili složka, je definovatelná část systému. V odborném tisku se často místo pojmu
komponenta používá pojem entita.
Příkladem komponent mohou být atomy, molekuly, ionty, radikály, makromolekuly, fyzikální tělesa (buňky, mikroby,
viry) atd.
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-27
Analyt je složka vzorku stanovovaná analýzou a uvedená v názvu měřené veličiny. Synonymem jsou
výrazy analyzovaná složka a komponenta.
Příklad: stanovovanou složkou/komponentou/entitou/analytem může být např. glukosa v plazmě, čili P-glukosa,
vápník v séru, neboli S-Ca, amyláza v moči, tj. U-AMS apod.
Metodou měření či měřicí metodou se rozumí „generický popis logického organizování činností použitých
při měření„ (VIM3).
Poznámka: Podle způsobu zjišťování měřené veličiny lze rozeznávat měřicí metody přímé, nepřímé, absolutní a
relativní, kontaktní a nekontaktní, komparační, kompenzační a omezovací, substituční, diferenční, statické,
dynamické… Metody přímé stanovují veličinu přímo podle definice měřené veličiny, všechny ostatní metody jsou
nepřímé a jsou založeny na známém vztahu měřené veličiny k jiným veličinám, hodnota měřené veličiny se zjišťuje
výpočtem, odečtením z nomogramu, z grafu či z tabulky.
Příklad: Přímé měření teploty teploměrem – hodnota měřené veličiny se odečte přímo na stupnici měřidla, nepřímé
stanovení odporu R kovového vodiče změřením protékajícího proudu I při daném napětí U a výpočtem podle vztahu
R=U/I. Délku lze stanovit absolutně, tj. vzhledem k jednotce, přímo na stupnici měřidla (ta udává násobek základní
jednotky délky – metru), koncentrace se stanovuje (většinou) relativně, vzhledem k etalonu (standardu, normálu).
V tomto případě udává výsledek měření násobek hodnoty standardu, na který bylo měřidlo nakalibrováno.
Postup měření (VIM3), podrobný popis měření podle jednoho nebo více měřicích principů a dané metody
měření, založený na modelu měření a zahrnující jakýkoliv výpočet nutný k získání výsledku měření
Výsledek měření (VIM3), soubor hodnot veličiny přiřazený měřené veličině společně s jakoukoliv
dostupnou relevantní (tj. podstatnou, důležitou) informací. Je to hodnota získaná měřením. Relevantní
informací může být např. nejistota měření (viz kapitola 4, str. 4-8).
Měřidlo, měřicí přístroj (VIM3), zařízení používané k měření buď samotné, nebo ve spojení s jedním nebo
více přídavnými zařízeními. Konstrukce měřicího zařízení vychází z principu měření.
Poznámka: zacházení s měřidly (mimo jiné) upravuje zákon č. 505/1990 Sb., Zákon ze dne 16. listopadu 1990 o
metrologii.
Měřicí systém (VIM3) , sestava jednoho nebo více měřidel a často dalších zařízení, včetně jakýchkoliv
činidel a zdrojů, sestavená a přizpůsobená k poskytování informace používané ke generování hodnot
veličiny ve specifikovaných intervalech pro veličiny specifikovaných druhů. Jsou to tedy všechny složky,
které jsou zapotřebí k provedení daných vyšetření. Měřicí systém se může skládat i z jediného měřidla.
Poznámka 1: Preferovaným formátem IUPAC-IFCC pro označování veličin v laboratorní medicíně je „Systém-Složka;
druh veličiny“.
Poznámka 2: Nejistota měření charakterizuje míru rozptýlení naměřených hodnot, tj. popisuje interval, ve kterém se
s danou pravděpodobností (např. 95%), nachází výsledek (podrobnosti jsou uvedeny v kapitole 4, na str. 4-8).
Kalibrace (VIM3): činnost, která za specifikovaných podmínek v prvním kroku stanoví vztah mezi
hodnotami veličiny s nejistotami měření poskytnutými etalony (standardy) a odpovídajícími indikacemi s
přidruženými nejistotami měření a ve druhém kroku použije tyto informace ke stanovení vztahu pro získání
výsledku měření z indikace.
Poznámka: Indikacemi se v definici rozumí hodnota analytického signálu.
Etalon, standard měření, standard, (measurement standard, etalon) (VIM3), realizace definice dané
veličiny, se stanovenou hodnotou veličiny a přidruženou nejistotou měření, používaná jako reference.
(srovnej též text na str. 3-3, poměrná kvantitativní stupnice).
Některé příklady: vodíková referenční elektroda s přidělenou hodnotou veličiny 7,072 a přidruženou standardní
nejistotou měření 0,006; řada referenčních roztoků kortisolu v lidské plazmě, která má certifikovanou hodnotu veličiny
s nejistotou měření pro každý roztok; referenční materiál poskytující hodnoty veličiny s nejistotami měření pro
hmotnostní koncentraci každého z deseti různých proteinů
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-28
Limit of detection – LD, (VIM3), naměřená hodnota veličiny získaná daným postupem měření, pro kterou je
pravděpodobnost nepravdivého tvrzení o nepřítomnosti složky v materiálu β, přičemž pravděpodobnost
nepravdivého tvrzení o její přítomnosti je 
Poznámka: IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry, Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii)
doporučuje implicitní hodnoty pro a rovné 0,05. Odtud plyne přibližný výklad výše uvedené definice, že mez
detekce je takové množství analytu, které zajišťuje, že chybná interpretace výsledku bude 5%: 5% bude
pravděpodobnost, že toto množství ve vzorku nebude rozpoznáno, 5% bude pravděpodobnost, že toto množství bude
detekováno jako přítomné ve vzorku, i když analyt ve vzorku přítomen nebude. Jinými slovy, při tomto množství
analytu je 95% pravděpodobnost (= téměř jistota), že výsledek bude správně interpretován – přítomnost i
nepřítomnost analytu budou (spolehlivě) rozpoznány. (implicitní = zahrnutý, obsažený, ale nevyjádřený přímo)
Referenční materiál, RM (VIM3), materiál dostatečně homogenní a stabilní, s referenci ke specifikovaným
vlastnostem, které byly stanoveny tak, že se hodí pro jejich zamýšlené použití při měření nebo při zkoumání
jmenovitých vlastností.
Poznámka: referenční materiál zahrnuje materiály ztělesňující veličiny (lidská plazma bez přidělené hodnoty veličiny
látkové koncentrace látkového množství cholesterolu, používaná jako kontrolní materiál preciznosti měření) stejně
jako jmenovité vlastnosti (stupnice barev indikující jednu nebo více specifikovaných barev).
Validace (VIM3), ověřování, že specifikované požadavky jsou přiměřené pro zamýšlené použití.
Příklad: postup měření běžně používaný pro měření hmotnostní koncentrace dusíku ve vodě, smí být také validován
pro měření v lidské plazmě.
Ověřování, (verifikace, VIM3) poskytnutí objektivního důkazu, že daná položka splňuje specifikované
požadavky.
Příklad: ověření, že pracovní postup (manuální, v analyzátoru) pro stanovení určitého analytu v lidském séru popsaný
výrobcem diagnostické soupravy platí také pro konkrétní podmínky konkrétní laboratoře
3.10. Některé odkazy mohou být užitečné
Velmi užitečný WEB o historii jednotek, definicích jednotek, převodu jednotek, atd:
http://www.converter.cz/index.htm
Databázi biologických variací lze nalézt na adrese http://www.westgard.com/biodatabase1.htm.
Westgardova stránka je v dané oblasti veskrze užitečným zdrojem informací .
Hlavním pramenem informací textu 3. kapitoly byl edukační CD-ROM „Metrologická terminologie v klinické a analytické
laboratoři“, 2. přepracované vydání, autorů doc. Ing. Zbyňka Plzáka, CSc., RNDr. Bedřicha Friedeckého, Ph.D. a RNDr
Josefa Kratochvíla, který čerpá (zejména) z třetího vydání Mezinárodního metrologického slovníku (VIM 3).
Další užitečnou pomůckou byl edukační CD-ROM „Analytická kvalita v klinické laboratoři“, od autorů RNDr. Bedřicha
Friedeckého, Ph.D. a RNDr Josefa Kratochvíla.
Dále byla velmi užitečnou pomůckou Technická fyzika od dr. F. Nachtikala, 2. vydání, JČMF, Praha 1937.
Důležitým zdrojem byl i překlad Mezinárodního metrologického slovníku z roku 2008 (VIM 3), uveřejněný na stránkách
Úřadu pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, dostupný na adrese:
http://www.unmz.cz/files/Sborníky%20TH/Terminologie%20v%20oblasti%20metrologie_DEF.pdf
ROC analýza viz např.: http://gim.unmc.edu/dxtests/ROC1.htm
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-29
3.11. Kontrolní otázky a pokyny si projděte
1. Co je to metrologie?
2. Umíte vyjádřit pojem „měření“?
3. Víte co je veličina?
4. Víte co je to měřicí jednotka?
5. Jaký je vztah mezi veličinou a měřicí jednotkou?
6. Čím se liší základní veličina od odvozené veličiny?
7. Co je to stupnice? Jaké stupnice znáte?
8. Jsou v ČR zákonné i jiné měřicí jednotky než jednotky SI?
9. Která základní jednotka je nejvíce užívána v klinické biochemii? Které základní veličiny se týká?
10. Co je to systém? Které systémy obvykle připadají v úvahu v klinické biochemii?
11. Co si představíte pod pojmem primární vzorek?
12. Umíte popsat měřicí sytém?
13. Které části tvoří výsledek měření v klinické biochemii?
14. Prostudujte si pojem chyba. Co to je? Jaké chyby znáte? Jak se to řekne anglicky?
15. Zkuste svými slovy říci co je kalibrace, pak svůj výrok zkonfrontujte s definicí.
16. Je rozdíl mezi pojmy etalon a standard?
17. Co si představujete pod pojmem funkční závislost? Dá se vyjádřit graficky? Pokud ano, jak byste
postupovali?
18. Co je to kalibrační faktor a co je to analytická funkce?
19. Chápete rozdíl mezi linearitou a pracovním rozsahem metody? Nezapomeňte si k tomu přečíst
poznámku na str. 3-8.
20. Jak se provádí kalibrace? Dovedete si to představit prakticky?
21. Promyslete, jaký je rozdíl mezi definitivní, referenční a rutinní metodou měření. Promyslete různá
hlediska.
22. Chápete rozdíl mezi referenčním a certifikovaným referenčním materiálem? Který z nich bude
dražší?
23. Co je to metrologická návaznost? Jak se to řekne anglicky?
24. Co je to validace?i A co verifikace?
25. Jaký je rozdíl mezi mechanizací, automatizací a robotizací?
26. Rozdělte automatické analyzátory.
27. Jaký je rozdíl mezi Trinderovou reakcí a modifikovanou Trinderovou reakcí?
28. Jaký je princip UV testu?
29. Jaký je rozdíl mezi měřením end point, rate, two point a fixed time?
30. Čeho se týká pojem vyčerpání reakční směsi?
Klinická biochemie Kapitola 3. Analytická fáze
Pavel Nezbeda 3-30
OBSAH:
Kapitola 3 Analytická část vyšetření .............................................................................................................. 3-1
3.1. Měřením se zabývá metrologie .......................................................................................................... 3-1
3.2. Kalibrace je hledání vztahu mezi signálem měřicího přístroje a koncentrací .................................... 3-6
3.3. Definitivní, referenční a rutinní metody měření .................................................................................. 3-9
3.4. Referenční materiály slouží kalibracím a kontrolám ........................................................................ 3-10
3.5. Automatizace a její role v klinické chemii......................................................................................... 3-12
3.5.1. Automatické analyzátory........................................................................................................... 3-12
3.5.2. Rozdělení automatických analyzátorů ...................................................................................... 3-12
3.5.2.1. Dělení podle způsobu práce.............................................................................................. 3-13
3.5.2.2. Dělení podle principu měření............................................................................................. 3-14
3.5.2.3. Dělení podle počtu prováděných metod............................................................................ 3-14
3.5.2.4. Dělení podle velikosti a rychlosti analyzátoru.................................................................... 3-15
3.5.2.5. Dělení podle pořadí prováděných testů............................................................................. 3-15
3.5.2.6. Dělení podle prostředí v němž probíhá reakce ................................................................. 3-15
3.5.2.7. Dělení podle zařazení v diagnostickém procesu............................................................... 3-16
3.6. Některé vybrané analyzátory............................................................................................................ 3-17
3.7. Několik poznámek k analytickým reakcím ....................................................................................... 3-20
3.7.1. Dvě důležité analytické reakce v klinické biochemii ................................................................. 3-20
3.7.1.1. Modifikovaná Trinderova reakce ....................................................................................... 3-20
3.7.1.2. Optický/UV test.................................................................................................................. 3-21
3.7.2. Průběhy analytických reakcí jsou důležité ................................................................................ 3-22
3.7.3.1. End point............................................................................................................................ 3-22
3.7.3.2. Kinetické měření................................................................................................................ 3-23
3.7.3.3. Měření v konstantním čase ............................................................................................... 3-23
3.7.3.4. Dvoubodové měření .......................................................................................................... 3-24
3.8.4. Vyčerpání reakční směsi........................................................................................................... 3-24
3.9. Dodatek ............................................................................................................................................ 3-25
3.9.1. Vybrané pojmy a definice z metrologie..................................................................................... 3-25
3.10. Některé odkazy mohou být užitečné .............................................................................................. 3-28
3.11. Kontrolní otázky a pokyny si projděte ............................................................................................ 3-29