Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
Kapitola 8 Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
Kromě plazmatických bílkovin (kapitola 13), což jsou dusíkaté látky v plazmě převažující, vyskytují se zde i
dusíkaté látky nebílkovinné povahy. Mnohé z nich mají diagnostický význam. Některé jsou odpadními
látkami, jiné vykazují biologickou aktivitu. Mezi hlavní dusíkaté látky nebílkovinné povahy patří močovina,
kreatinin, kyselina močová, aminokyseliny a amoniak. Dále to jsou karnitin, glutathion, oxid dusnatý a
nebílkovinné dusíkaté látky s hormonálním účinkem.
8.1. Močovina
Močovina (urea) je diamid kyseliny uhličité: NH2–CO-NH2. Vzniká v játrech v cyklu močoviny (tzv. malý
Krebsův cyklus nebo též ornitinový cyklus). U savců, obojživelníků a některých ryb to je konečný produkt
metabolismu dusíku z bílkovin (u ptáků a plazů se tvoří kyselina močová; amoniak, jako takový, vylučují
žábrami raci a mnohé ryby). Dusík močoviny představuje hlavní složku tzv. nebílkovinného dusíku.
Osud amoniaku
Amoniak je buněčný jed, proto musí být přeměněn na látku netoxickou; tou může být karbamoylfosfát nebo
glutamin. Oba tyto produkty mají další využití.
Karbamoylfosfát vstupuje do močovinového cyklu za tvorby močoviny, odpadního produktu metabolismu
aminokyselin; druhá (syntetická) metabolická cesta vede od karbamoylfosfátu k pyrimidinům
Sumární reakce pro tvorbu močoviny:
2 NH3 + CO2 H2N – CO - NH2 + H2O
(ATP / ADP)
Glutamin (GLU.NH2) tvoří (spolu s asparaginem) latentní zásobu amoniaku
v organismech a hraje důležitou roli v biosyntetických dějích: syntéza aminokyselin
transaminací, syntéza purinových nukleotidů, syntéza dalších dusíkatých látek
(glukosamin, histidin). Glutamin může také odštěpit NH3 v ledvinách, čímž přispívá
k udržování acidobazické rovnováhy (viz kapitola 8 Vnitřní prostředí ).
NH3 + CO2 H2N-CO-O~ P
ATP ADP
močovina
pyrimidiny
Karbamoylfosfát
bílkoviny
aminokyseliny
NH3
močovina
močovinový
cyklus v
játrech
močnetoxická
odpadní
látka
karbamoylfosfát
glutamin
puriny
aminace
40%
profiltrovaného
množství
močoviny se
pasivně
resorbuje spolu
s vodou
pyrimidiny
odštěpení
NH3
v ledvináchbuněčný jed 
NH2
O
NH2
O
OH
Asparagin
NH2
O
NH2
O
OH
Glutaminpuriny, kyselina listová
odštěpení NH3 v ledvinách (vylučování protonů jako NH4
+
)
syntéza aminokyselin (transaminace)
syntéza dalších dusíkatých látek (aminace)
NH3 GLU.NH2
Močovina
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-2
8.1.1. Metody stanovení močoviny
8.1.1.1. Neenzymové metody
 s diacetylmonoximem (DAM)
 s o-ftaldialdehydem
Diacetylmonoxim [CH3-CO-CNOH-CH3] dává s močovinou za přítomnosti thiosemikarbazidu [NH2-CS-NHNH2]v silně
kyselém prostředí (kyselina sírová) za zvýšené teploty (var na vodní lázni) a v přítomnosti Fe
3+
růžové zbarvení;
zbarvení je stálé asi 15 minut, vhodné k fotometrii při 525 nm (490 – 540 nm)
o-Ftaldialdehyd (ortho-ftaldialdehyd) reaguje s močovinou v kyselém prostředí za tvorby meziproduktu (Nkarbam(o)yl-1,3-
dihydroxyisoindolin), který dává s N-(1-naftyl)ethylendiaminem červeně zbarvený produkt; sleduje
se nárůst absorbance v závislosti na čase při 510 – 530 nm [kinetické měření]
O-ftaldialdehyd N-(1-naftyl)ethylendiamin
8.1.1.2. Enzymové metody
Enzym ureáza odštěpí z močoviny amoniak, který se stanoví UV testem, případně Berthelotovou reakcí.
ureáza
NH2–CO-NH2 + H2O 2 NH3 + CO2
+ H+
NNHH44
++
Vzniklý amonný ion se stanovuje:
 Berthelotovou reakcí: se salicylanem sodným, chlornanem sodným [NaOCl] a nitroprussidem
sodným [Na2[Fe(CN)5(NO)].2 H2O] (katalyzátor reakce) vzniká zelené zbarvení, fotometrovatelné
při 540 – 560 nm (při optimální vlnové délce 630 nm je reakce příliš citlivá).
Diagnostická souprava PLIVA-Lachema Diagnostika: BLT Močovina 200 (UREA 200) – modifikovaná (upravená) Berthelotova
reakce – místo salicylanu sodného se používá 3-methyl-6-isopropylfenol; produktem reakce je indofenol; maximum absorbance je při
705 nm, fotometruje se při 580 – 650 nm
indofenol
 UV-testem při 340 nm; tato rovnice současně představuje princip stanovení amoniaku (str. 7-19):
NH4
+
+ kyselina -oxoglutarová glutamát+
+ H2O
GLDH = glutamátdehydrogenáza
Poznámka I: UV-test je analyticky správnější než reakce uvedená ad a.
Poznámka II: Ve výše uvedené rovnici je si třeba představit glutamát za daných podmínek jako kation [HO2C-(CH2)2-CHNH3
+
-CO2H]
Berthelotovou
reakcí
(kolorimetrie)
UV-testem
(plně enzymatická
reakce s GLDH)
stanovuje se
NH
NH2
O
O
NH2
N
O
GLDH
NADH + H+
NAD+
OH N
CH3 O
CH3
Diacetylmonoxim
NH2
NH
S
NH2 Thiosemikarbazid
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-3
8.1.2. Klinické poznámky
Referenční rozmezí
Močovina v plazmě: 2,5 – 8,3 mmol/l
Močovina v moči: 320 – 570 mmol/24 hodin
Hladina v plasmě závisí na
- exkrečních vlastnostech ledvin pro močovinu (glomerulární filtrace + tubulární resorpce)
- proteinovém metabolismu, tj. na přívodu bílkovin do organismu a na jejich katabolismu (100 g proteinů
může vést k produkci až 35 g /5,8 molů močoviny)
Hladina v moči závisí na
- urémii (hladině v plazmě, séru)
- exkrečních vlastnostech ledvin (narušené či nenarušené schopnosti filtrace + resorpce)
- průtoku krve ledvinou (záleží zejména na hodnotě krevního tlaku)
Koncentrace močoviny v plazmě/séru ne zcela spolehlivě odráží funkci ledvin. Ledviny mají totiž velkou
rezervní kapacitu k udržení stabilní hladiny močoviny v krvi.
 Nárůst koncentrace močoviny v plazmě může mít různé příčiny
A. Nadměrná tvorba močoviny
- nadměrný přívod bílkovin v potravě
- zvýšený katabolismus (sepse, horečka…)
- operační trauma, infekce nebo zánět
- podávání steroidních hormonů nebo jejich zvýšená tvorba, podávání cytostatik
- masivní krvácení do GIT, hematomy
- intenzivní trénink (zvýšení koncentrace na 12 – 15 mmol/l)
B. Porucha jejího vylučování ledvinami
- tzv. funkční selhání ledvin (hypoperfúze kůry ledvin při šoku, nedostatečné srdeční činnosti, větší
dehydrataci…)
- ledvinové selhání při různých chorobách (nefritidy aj.), působením léků apod.
- překážka při odtoku moče (obstrukční uropatie)
- jaterní selhání a jeho komplikace (hepatorenální syndrom - funkční postižení, při kterém se mj.
snižuje ledvinná filtrace a tvorba moči)
- poškození ledvin při masivní hemolýze (hemolyticko-uremický syndrom)
Poznámka: Při oběhové poruše dojde ke snížení průtoku krve ledvinami, tím dojde ke snížení filtrace a ke zvýšení koncentrace
močoviny v plazmě. Koncentrace v plazmě nepřesáhne 17 mmol/l.
C. Kombinace A. a B.
 Pokles koncentrace močoviny v plazmě může mít rovněž různé možné příčiny
A. Porucha tvorby močoviny
- snížení příjmu bílkovin v potravě
- konečné stadium při onemocnění jater (jediný orgán tvorby močoviny)
- anabolické stavy (fyziologicky u dětí)
B. Močové ztráty
- fyziologicky v těhotenství (zvýšená filtrace v glomerulech + výstavba bílkovin plodu)
Dusíková bilance pacienta
Ztráty dusíku močí za 24 hodin jsou důležitým ukazatelem míry katabolismu (zátěže). Dusík močoviny
představuje asi 80% celkového dusíku ztráceného močí. Z hodnoty močoviny ve sbírané moči lze vypočítat
tzv. dusíkovou bilanci pacienta, tj. rozdíl mezi příjmem a výdejem dusíku:
dusíková bilance = příjem N /24 h – (ztráty N v moči + neměřitelné ztráty)
Dusíková bilance se počítá v gramech dusíku za časové období.
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-4
8.2. Kreatin a kreatinin
Tvorba kreatinu a jeho cyklického amidu kreatininu je naznačena ve schématu na straně 8-6. Kreatinin se
tvoří ve svalové tkáni neenzymovým odštěpením fosforečné skupiny z kreatinfosfátu, makroergické
sloučeniny, prvotního energetického zdroje pro svalovou práci. Kreatinin se vylučuje ledvinami, při
fyziologických hladinách prakticky pouze glomerulární filtrací. Při hodnotách kreatininémie > 200 mol/l se
vylučuje i tubulární sekrecí.
8.2.1. Metody stanovení kreatininu
1. Jaffého reakce (reakce kreatininu s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí)
Existuje ve dvou provedeních, jako metoda konstantního času (s deproteinací biologického vzorku) a kinetické
stanovení (bez deproteinace).
2. Stanovení s kyselinou 3,5-dinitrobenzoovou
3. Stanovení s 1,4-naftochinon-2-sulfonanem
4. S o- -naftolem a thyminem (metoda se nehodí pro stanovení v moči)
5. Enzymové metody
 ISE
o potenciometrické stanovení amoniaku po jeho odštěpení keatininiminohydrolázou
(kreatinin + H2O  N-mehylhydantoin + NH3)
o amperometrické stanovení peroxidu vodíku (viz kapitola 7, str. 7-3), popis reakce viz dále
Barevný test na str. 8-7
 UV-test při 340 nm: kreatininamid hydroláza umožní působení kreatininázy a přeměnu kreatininu na
kreatin. Ten je následně kreatinkinázou fosforylován (s využitím ATP) na kreatinfosfát. V reakční
směsi přítomný fosfoenolpyruvát se přispěním pyruvátkinázy změní na pyruvát a v předchozí reakci
uvolněný ADP se regeneruje na ATP. Pyruvát se v další reakci katalyzované laktát dehydrogenázou
hydrogenuje na kyselinu mléčnou, přitom přechází NADH na NAD. Sleduje se pokles absorbance
při 340 nm (viz schéma na str. 8-8).
 Barevný test: kreatinin hydrolyzuje za přispění kreatininázy na kreatin, ten dále hydrolyzuje za
přispění kreatinázy na sarkozin a močovinu, sarkozin se oxiduje pomocí sarkozinoxidázy na glycin,
formaldehyd a peroxid vodíku; peroxid vodíku, 4-aminoantipyrin a TOOS [N-ethyl-N-(2-hydroxy-3sulfopropyl)-m-toluidin]
reagují za odštěpení vody na červené chinonové barvivo (viz schéma na str
8-7)
Poznámka: enzymové metody jsou již delší dobu doporučeny pro pracoviště s pacienty v transplantačních programech a
na hemodialýze. V současnosti je enzymová metoda doporučena ČSKB k všeobecnému používání jako standardizovaná
metoda s návazností na primární standard, která nemá nedostatky Jaffého reakce, a kterou by měla postupně nahradit.
6. Izotopová diluce ve spojení s plynovou nebo kapalinovou chromatografií a
hmotnostní spektrometrií
(referenční metoda, viz Kapitola 3, Analytická fáze, str. 3-9)
8.2.1.1. Reakce Jaffé
Max Jaffé (25.7.1841 – 26.10.1911), německý biochemik, profesor farmakologie,
popsal reakci kreatininu s alkalickým pikrátem za tvorby červenooranžového
zbarvení již v roce 1886 (!). Pro stanovení kreatininu v séru ji poprvé použil Folin
v roce 1904. Od té doby prošla tato reakce mnoha úpravami a obměnami
s cílem vylepšit její specifitu.
Poznámka: Ačkoliv jméno Jaffé má zřejmě francouzský původ, jedná se o německého badatele a
výslovnost je shodná s psanou podobou, tedy jafe (nikoliv žafe, džafe apod., jakkoliv se to v této
podobě u nás hojně používá).
Jedná se tedy o reakci kreatininu s kyselinou pikrovou v alkalickém prostředí.
NH
NH
N
CH3
O
NH2
NH
N
CH3
O
OH
NH
NH
N
CH3
O
OHP
O
OH OH
Kreatin
svaly, mozek, krev, stopy v moči
Kreatinfosfát
(rezerva energie)
Kreatinin
(anhydrid kreatinu, resp. cyklický amid kreatinu)
krev, moč, všechny tělní sekrety,sliny, žluč, pot, likvor
Max Jaffé
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-5
Reakce je jednoduchá, ale nespecifická, doposud je to však nejrozšířenější reakce, která je postupně
nahrazována specifičtější reakcí enzymatickou (širšímu a rychlejšímu rozšíření enzymové metody brání
zejména ekonomické důvody). Výsledkem Jaffého reakce je nestálý adukt červenooranžové barvy,
v kyselém prostředí se rozpadající:
Kromě kreatininu reagují při Jaffého reakci ve vedlejších reakcích i jiné látky (tzv. chromogeny, což jsou
v daném případě zejména bílkoviny, glukóza, kyselina askorbová, guanidin, aceton, kefalosporiny a oxokyseliny,
jako jsou kyselina acetoctová a pyrohroznová), které snižují specifitu metody pro stanovení
kreatininu, tj. vedou k falešně vyšším výsledným hodnotám (v plazmě se podle metody jedná o navýšení
cca 18 – 35 mol/l), kromě bilirubinu, který výtěžnost reakce snižuje (u kinetického stanovení, viz dál).
Vliv pH na výtěžek reakce
Relativní rychlosti reakce jsou následující:
1. chromogeny velmi rychle reagující (nejvíc pyrohroznan)
2. kreatinin (v alkalickém prostředí!)
3. chromogeny pomalu reagující
Běžně se jako rušivé látky projevují především:
 Glukosa – ovlivňuje již v koncentracích nad 6,1 mmol glukosy/l, hodnoty nad 15 mmol glukosy/l ovlivňují
stanovení kreatininu takovým způsobem, že výsledky jsou nespolehlivé
 Kyselina acetoctová – pokud je v moči, je nutno ji odstranit povařením
 Bilirubin – při kinetickém stanovení (ne při stanovení s deproteinací, kdy je odstraněn) snižuje výsledky
stanovení kreatininu; při koncentracích nad 100 mmol bilirubinu/l je nutno bilirubin ve vzorku potlačit
(ferrikyanidem, jódem aj.)
Vliv rušivých látek je omezen správnou volbou optimálních podmínek (čas, pH, teplota), použitím čerstvých,
správně uchovávaných reagencií (zejména NaOH), úpravou (modifikací) reakce (např. okyselením se
eliminuje vliv pomalu reagujících chromogenů).
Reakce se používá jak pro stanovení v séru (plazmě), tak v moči (moč je nutno před analýzou ředit) .
Kyselina pikrová
(2,4,6-trinitrofenol)
Komplex pikrát-kreatinin
(okyselením se rozpadá)
N
+
O
-
O
N
+
O
-
O
N
+
O
-
O
OH O
-
-
N
+
O
-
O
N
+
O
-
O
N
+
O
-
O
N
NH
O
NHCH3
Rychlost reakce
kreatininu
s kyselinou pikrovou
Výtěžek reakce
pHpH 12,4
Vzrůstu rychlosti reakce kreatininu
s kyselinou pikrovou konkuruje vzrůst
rychlosti reakce s
–
OH ionty, výtěžek je
tedy nižší (z obrázku je patrno, že
optimálním pH je pH 12,4)
Poznámka: Kefalosporiny (cefalosporiny) jsou
beta-laktamová antibiotika, deriváty kyseliny
7-aminocefalosporanové. Název pochází od
Cephalosporium, plísně, z níž byly tyto látky
poprvé izolovány.
Guanidin, je silně zásaditá sloučenina
vyskytující se v rostlinách a nižších živočiších,
s vlastnostmi parasympatického stimulans.
Mnohé deriváty guanidinu slouží jako léčiva.
NH2
NH
NH2
Guanidin
(při pozorném pohledu na vzorec
kreatinu na str. 7-9 zjistíte, že
guanidin je jeho součástí).
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-6
Metabolická cesta tvorby kreatininu (zkráceně)
arginin + glycin
kyselina guanidinoctová
(glykokyamin, glykocyamin)
ornitin
transaminidáza
(určuje rychlost biosyntézy
kreatinu)
KREATIN
ATP
ADP
 CH3
z methinoninu (ireverzibilně)
transferáza
KREATINFOSFÁT
KREATININ
MOČ
(odpad)
kreatinkináza
zpětná vazba
i z potravy
10x rychlejší než fosforylace
(Zásobárna makroergických fosfátů = rezerva energie výhodnější
než ADP/ATP)
Pi (neenzymově!)
ATP
ADP
ledviny
játra
sval
ledviny
CH3
S
NH2
O
OH
Methionin
NH2 NH
NH
NH2
O
OH NH2
OH
O
Glycin
NH2
NH2
O
OH
Ornitin
NH2
N
NH2
O
OH
ArgininKyselina guanidinoctová
Diagnostická souprava PLIVA-Lachema Diagnostika:
Reakční podmínky pro BLT test CREAT 100 (určen pro manuální
stanovení)
Reakční doba: 15 – 20 minut
pH: 12,3 – 12,5 (nejkritičtější faktor)
Teplota: 25  1,5 °C (kritické je ovlivnění pH teplotou)
Vlnová délka: z pásma 490 – 520 nm (505 nm)
Spektrální šíře: 1 – 2 nm (méně jak 10)
Reakce –
OH iontů je kompenzována porovnávacím vzorkem
(slepým pokusem), ostatní chromogeny volbou reakční doby.
Poznámka: V praktickém životě je potřeba dát
pozor na to, aby hydroxid sodný byl vždy čerstvý
a aby dávkovače dávaly správné množství jak
hydroxidu, tak kyseliny pikrové (platí i pro provoz
na automatických analyzátorech)
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-7
Sarkosinoxidáza
kataláza
Stanovení v moči se používá pro
- odhad glomerulární filtrace (viz Clearance endogenního kreatininu)
- odhad úplnosti sběru moče: odpad kreatininu vztažený na kg hmotnosti by se neměl snížit víc jak o 30%
proti očekávané hodnotě
- standardizaci odpadu látek močí: koncentrace stanovované látky se přepočítává na 1 mmol kreatininu a
tím se eliminuje vliv různé koncentrace moči
8.2.1.2. Enzymové reakce
Barevný test
V první reakci, kreatinasa a sarkosin oxidasa hydrolysují endogenní kreatin za vzniku peroxidu vodíku, který je
eliminován katalasou. Po přidání kreatininasy a 4-aminoantipyrinu, pouze kreatin vytvořený z kreatininu účinkem
kreatininasy je následně hydrolyzován kreatinasou a sarkosin oxidasou za vzniku peroxidu vodíku. Tento nově vzniklý
peroxid vodíku reaguje s N-etyl-N-sulfopropyl-m-toluidinem (ESPMT) za katalýzy peroxidasou. Absorbance vzniklého
komplexu při 546 nm je přímo úměrná koncentraci kreatininu ve vzorku.
(Souprava CREAT E L 204 Erba-Lachema Diagnostika, citace z příbalového letáku).
Reakční schémata pro zvídavé studenty:
CH3-NH-CH2-CO2H + NH2-CO-NH2 H2O +
sarkosin + H2O + O2 NH2-CH2-CO2H + CH2=O + H2O2
2 H2O + O2 2 H2O2
+ H2O
H2O2 + N-etyl-N-sulfopropyl-m-toluidin + 4-aminoantipyrin barevný pigment + H2O
(TOOS)
NH2
NH
N
CH3
O
OHKreatináza
Kreatin
Sarkosin Močovina
Glycin Formaldehyd
I. fáze
NH
NH
N
CH3
O
Kreatinin
Kreatinináza
NH2
NH
N
CH3
O
OH
Kreatin
II.fáze
Po přidání kreatininázy, tj. od kreatininu, běží dále reakce podle schématu I. fáze (naznačeno šipkou); tvořící se
peroxid vodíku tentokrát pochází výlučně z kreatininu a je stanoven modifikovanou Trinderovou reakcí (intenzita
zbarvení barevného pigmentu je proporcionální původní koncentraci kreatininu ve vzorku:
Peroxid pocházející z kreatinu ve
vzorku (I. fáze) je eliminován
pomocí katalázy
Peroxid pocházející z kreatininu (II.
fáze – přeměna kreatininu na
kreatin) je stanoven modifikovanou
Trinderovou reakcí
začátek reakce
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-8
UV test
8.2.2. Klinické poznámky
 Zvýšená koncentrace sérového kreatininu:
Viz odstavec 7.2.1.2. kde se diskutují příčiny zvýšené urémie (funkční i anatomické selhání ledvin,
obstrukce v močových cestách atd.). Kreatininémie výrazně stoupá u chronického selhání ledvin (hodnoty u
těžkého selhání jsou až nad 1000 mol/l), u akutních stavů a u funkčního selhání ledvin je zvýšení
kreatininémie mírnější. Indikovaný stav pro umělou ledvinu je pro pacienty s hodnotami kreatininu mezi 700
– 800 mol/l. Zvýšený příjem bílkovin a fyzická námaha ovlivňují hladinu kreatininu v krvi jen málo, proto je
kreatinin specifičtějším ukazatelem porušené funkce ledvin než močovina. Hladina kreatininu v séru však
není citlivá na rané poškození ledvin a během léčby selhání ledvin reaguje na hemodialýzu pomaleji, než
močovinový dusík v krvi (BUN).
 Snížená koncentrace sérového kreatininu:
Fyziologicky v dětském věku a u těhotných (zvýšená glomerulární filtrace – viz „Močovina“). U osob s malou
svalovou hmotou, u nemocných s myodystrofií a u osob dlouhodobě upoutaných na lůžko.
Referenční meze se liší podle pohlaví, věku a hmotnosti testované osoby i podle použité metody.
Jaffé metoda Enzymová metoda (Erba Lachema s.r.o.)
Krev: muži do 124 mol/l 44 – 90 mol/l
ženy do 115 mol/l 44 – 87 mol/l
děti výrazně nižší hodnoty (malá svalová hmota)
Moč: do 18 mmol/24 hod. 5 – 18 mmol/24 hod.
Množství vyloučené denně je úměrné svalové hmotě a je individuální konstantou člověka.
Odpad na kg hmotnosti
muži: 0,097 - 0,177 mmol/kg/24 hod
ženy: 0,124 - 0,230 mmol/kg/24 hod
Poznámka: poškození ledvinové tkáně z více jak 1/3 vede k poklesu hladiny kreatininu v moči
NH
NH
N
CH3
O
NH2
NH
N
CH3
O
OH
NH
NH
N
CH3
O
OHP
O
OH OHKreatinináza Kreatinkináza
CH2
O
OH
O
P
O
OH
OH
CH3
O
OH
O
ATP ADP
Kreatinin
kreatin Kreatinfosfát
Pyruvátkináza CH2
O
OH
OH
Kyselina (enol) - pyrohroznová
[(enol) – pyruvát]
Kyselina
fosfoenolpyrohroznová
(fosfoenolpyruvát)
Kyselina (keto) - pyrohroznová
[(keto) – pyruvát]
Laktátdehydrogenáz
a
Kyselina mléčná
(laktát)
NADH +H+
NAD+
Součást reakční
směsi
UV-test
CH3
CH
C
O
OH
OH
+ H2O
Srovnej také se schématem na str. 8-6
Poznámka k názvosloví některých enzymů (srovnej s kapitolou 12 Enzymy):
EC 3.5.2.10 Kreatinin amidohydroláza, též Kreatinin hydroláza nebo Kreatinináza; hydrolázy tohoto typu se také nazývají amidázy
EC 3.5.3.3 Kreatin amidinohydroláza, též Kreatináza. Přehledný seznam enzymů včetně užívaných názvosloví ve Wikipedii
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-9
8.2.3. Clearance endogenního kreatininu
to clear (angl.) = čistit, očistit, vyčistit, vyprázdnit, vyklidit, uvolnit
clearance (angl.) = vyklizení, vyprázdnění, odstranění, odklizení, asanace; výprodej zásob; vybírání (schránky) [vyslov: klírens]
endogenní = vnitřní (tzn. vytvořený v organismu, organismu vlastní, nedodaný zvenku)
Jak bylo uvedeno v kapitole 5, každou sekundu se ve zdravé ledvině tvoří přibližně 2 ml primární moči.
Snížení filtrace vypovídá o snížené funkci ledviny. Jednou z cest, jak se (nepřímo) přesvědčit o filtrační
schopnosti ledviny, je stanovení tzv. clearance (resp. clearance indikátorové látky).
Pod pojmem clearance se rozumí
 objem krve nebo plazmy, obsahující to množství indikátorové látky, které se močí vyloučí za jednu
sekundu
 objem krve nebo plazmy „očištěné“ zcela od takového množství (indikátorové) látky, které je
v jednosekundovém vzorku moči (což jsou výroky v podstatě totožné).
Jde tedy o to, zjistit tento objem, většinou výpočtem z údajů koncentrace podané (či endogenně vytvořené)
indikátorové látky v séru/plazmě a její koncentrace v moči, sbírané po určitou konkrétní dobu (obvykle 24
hodin). Rutinním testem pro vyšetření filtrační funkce ledvin je kreatininová clearance, resp. clearance
ednogenního kreatininu.
Poznámka: Clearance je fiktivní pojem, protože se při jednom průtoku ledvinami plazma zcela nezbaví dané látky (výjimkou je
aminohippurát).
Přehledné schéma clearance endogenního kreatininu
Legenda k tabulce:
VP = objem plazmy očištěné glomerulární filtrací za 1 sekundu od kreatininu
V24 = objem moči sbírané 24 hodin
VS = objem moči vyloučené za 1 sekundu (tj. V24 / 24 hod . 60 min . 60 s)
CM = koncentrace kreatininu v definitivní moči
CP = koncentrace kreatininu v plazmě (= koncentrace kreatininu v primární moči)
KI = koncentrační index (tj. CM/ CP)
GF = glomerulární filtrace = VP = clearance (nedochází-li k tubulární resorpci či sekreci, je clearance rovna glomerulární filtraci GF)
Anatomie Nefron Obecné pojmy Příklad
Glomerulus Filtrace
plazmy
CP
(koncentrace kreatininu v plazmě)
CP
72 mol/l
Primární
moč
CP
(stejná
koncentrace
kreatininu
v primární moči
jako v plazmě)
VP
(objem plazmy očištěné
glomerulární filtrací za 1
sekundu od kreatininu)
VP = KI . Vs = GF
VP
83 . 0,0174 =
= 1,44 ml/s
Ref. hodnota:
1,7 – 2,0 ml/s
Tubuly Tvorba
definitivní
moči
(zde
především
zahuštění)
(zakoncentrování)
KI
(koncentrační index udává,
kolikrát je koncentrace
kreatininu v moči vyšší než
v plazmě, čili zkoncentrování
moči)
KI = CM/CP
KI
5936/72 = 83
Ledvinová
pánvička
Definitivní
moč
CM
(koncentrace
kreatininu
v definitivní moči,
vyšší než
v plazmě, moč
byla
zakoncentrována)
V24
(objem moč za 24 hodin v ml)
Vs
(objem moči za sekundu
v ml)
Vs = V24 /60.60.24
Vs = V24 /86400
V24
1500 ml
Vs
1500/60.60.24 =
= 1500/86400 =
= 0,0174
CM
5936 mol/l
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-10
Indikátorová látka by při průchodu ledvinou neměla být ledvinou ani resorbována, ani vylučována
(secernována), ale pouze filtrována. Tyto podmínky nejlépe splňuje inulin (polysacharid
nahrazující u některých rostlin škrob). Proto se inulinová clearance považuje za „zlatý standard“
tohoto typu vyšetření. Nicméně i endogenně tvořený kreatinin vykazuje podobné vlastnosti jako
inulin a vylučování kreatininu do moči je považováno za míru glomerulární filtrace. Vyšetření se
nazývá clearance endogenního kreatininu, nebo zkráceně kreatininová clearance. Mírné
vylučování kreatininu tubuly navyšuje hodnotu kreatininové clearance oproti aktuální GFR o 10
– 20%, což je přijatelné, avšak při kreatininémii >200 mol/l tubuly secernují kreatinin již
významně a vyšetření nelze použít.
Výpočtem pro glomerulární filtraci GF vychází:
Referenční hodnoty: [1,7 – 2,0 ml/s], čili jednosekundový objem od kreatininu očištěné plazmy
je roven sekundovému objemu vyloučené moči krát zahuštění moči, tedy koncentrační index.
Koncentrační index je roven koncentraci kreatininu v definitivní moči lomeno koncentrace
kreatininu v primární moči, tj. v plazmě (až na bílkoviny má primární moč prakticky stejné
složení jako plazma). Filtrační plocha v ledvinách je přímo úměrná povrchu těla (S = povrch
těla), proto daný výpočet odpovídá konkrétnímu povrch těla S. Pro možnost srovnání výsledků
různě velkých osob, tedy s různou velikostí povrchu těla, se výsledky vztahují na jednotkový
povrch těla, který je 1,73 m
2
Povrch těla S se získá z údajů o výšce a váze testované osoby, a to odečtením
z nomogramu nebo výpočtem. Jeden z možných vzorců pro výpočet povrchu těla je
Odpovídá-li tedy vypočtená GF povrchu těla S, pak tzv. korigovaná glomerulární filtrace GFK odpovídá
velikosti těla s povrchem 1,73 m
2
: GF ................... S a GFk ...................1,73
a odtud
Referenční hodnoty: [1,28 – 2,29 ml . s-1
. 1,73 m-2
]; [1,15 – 2,35 ml . s-1
. 1,73 m-2
- podle Racka]
Kreatininová clearance se většinou vyšetřuje jako jednorázová, tj. moč se sbírá jedno sběrné období,
nejčastěji 24 hodin. Někdy se moč sbírá ve více intervalech, např. šestkrát po čtyřech hodinách, vypočítá se
clearance pro každý interval zvlášť a z výsledků se potom vypočítá průměrná clearance (jako konečný
výsledek). V tomto případě se jedná o tzv. clearanci dělenou (frakcionovanou).
Ideální clearance kreatininu GFID je clearance vztažená na věk (s věkem clearance klesá – klesá
glomerulární filtrace):
ě á í
Resorpce R je definována jako vstřebaný objem VR připadající na glomerulární filtraci GF, čili podíl VR/GF.
Vstřebaný objem („zahuštění“) je definován
(glomerulární filtrace minus sekundový objem moči).
Referenční interval: [0,986 – 0,998]
8.2.4. Klinické poznámky
Snížení hodnoty GF: Funkční poškození glomerulů, snížené prokrvení ledviny. Za normální se považuje
hodnota v rozmezí GFID  30%, velmi snížená je hodnota kreatininové clearance pod 25% GFID.
Příklad: Pacientka, 76 roků, s diagnózou pyelonefritida měla při kreatininové clearanci tyto hodnoty:
Sběr moči za 24 hodin = 1400 ml, hodnota kreatininu v séru = 98 mol/l, kreatinin v moči 6,63 mmol/l, váha 90 kg, výška 155 cm.
Vypočtěte hodnoty nekorigované GF a R, zhodnoťte výsledek.
GF = VS . (CM / CP) = (V24/60.60.24) . (CM / CP) = (1400/86400) . (6630/98) = 0,016 . 67,7 = 1,08 [ml/s]
S = 0,0167.m.h = 0,0167 . 90.155 = 0,0167 . 139,5 = 0,0167 . 118,1 = 1,97 [m
2
]
GFK = (GF . 1,73) /S = (1,08 . 1,73)/1,97 = 1,87/1,97 = 0,95 [ml/s]
GFID = - 0,00946 . věk + 2,118 = - 0,00946 . 76 + 2,118 = - 0, 719 + 2,118 = 1,40 [ml/s]; (0,95/1,40) . 100 = 68% (tedy sníženo o 32%)
Komentář: Třicetiprocentní rozmezí ideální GF = [0,98 – 1,82]. Naměřená hodnota GF je menší než –30% GFID, je tedy snížená.
Kdyby se nebral v úvahu věk pacientky (tedy ideální GF), je výsledek rovněž pod dolní hranicí normy: 0,95 proti 1,28 resp. 1,15
ml/s. R = 1 – (CP /CM) = 1 – (98/6630) = 1 – 0,0148 = 0,985. Výsledek je těsně pod dolní hranicí normy.
Inulin
(část vzorce)
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-11
8.2.5. Odhad glomerulární filtrace z hodnot sérového kreatininu
Z hodnot sérového kreatininu [S-Kreat] lze odhadnout hodnotu glomerulární filtrace [eGF] pomocí
výpočtových metod. Existuje rovnice podle Cockrofta a Gaulta, ta je však v současnosti již považována za
obsolentní (neaktuální, zastaralá) a od roku 2009 v ČR nedoporučována k používání.
Přednost se dává rovnici MDRD (Modificatiton of Diet in Renal Disease), která má při použití
standardizované metody stanovení sérového kreatininu (enzymově) tzv. zkrácený či čtyřparametrový tvar:
[ml/s/1,73 m2
]
Pro muže je poslední člen rovnice roven “1“, pro černou populaci obsahuje rovnice ještě další korekční člen.
Výsledek je vztažen na tzv. ideální povrch těla, tj. 1,73 m
2
. Absolutní hodnota odhadnuté glomerulární
filtrace se získá vydělením výsledku hodnotou 1,73 a vynásobením skutečnou hodnotou povrchu těla
(vzorec pro výpočet povrchu těla viz např. str. 8-10). Pro výpočet [eGF] u dětí a mladistvých do 18 let se
tato rovnice nehodí. Pro tuto věkovou kategorii se používá výpočet podle Schwartze:
[ml/s/1,73 m2
]
V této rovnici F představuje faktor, který je tabelován a nabývá různých hodnot pro různá pohlaví a různé
věkové skupiny.
Rovnicí obdobnou rovnici MDRD je rovnice CKD-EPI (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration;
podrobnosti např. zde), rovněž obsahuje čtyři proměnné, ale je postavena poněkud odlišně, měla by dávat
poněkud lepší výsledky než rovnice MDRD. V současnosti se v Evropě prosazuje rovnice Lund-Malmö,
která má proti jmenovaným určité výhody, např. možnost použití pro jedince již od 1 roku věku až po
dospělé. Detailnější popis zde. Kromě toho je navržena i tzv. kvadratická rovnice Mayo Clinic (MCQ), ta
se však v České republice nepoužívá. Pro výpočtové metody se zásadně doporučuje použití hodnoty
koncentrace kreatininu získané enzymovou metodou.
.
Jiné možnosti odhadu GF poskytují nízkomolekulární proteiny a polypeptidy, které se při poklesu
glomerulární filtrace hromadí v plazmě. Jedná se např. o 2-mikroglobulin, C-peptid, Cystatin C aj.
Pro odhad glomerulární filtrace je zvl. vhodný zejména cystatin C, protože na rozdíl od ostatních
jmenovaných je to látka nezávislá (tzn. její produkce a tím i její koncentrace v plazmě/séru) na přítomnosti
zánětu, některých nádorů apod. Cystatin C patří mezi inhibitory cysteinových proteáz, je tvořen dvěma
polypeptidovými řetězci, molekula má kladný náboj, relativní molekulová hmotnost je 13 343.
Stanovuje se imunochemicky, s využitím nefelometrie nebo turbidimetrie, nefelometrie dává obecně
preciznější a přesnější výsledky. Na trhu jsou k dispozici soupravy pro stanovení cystatinu C s principy
 PENIA (particle-enhanced nephelometric immunoassay) a
 PETIA (particle-enhanced turbidimetric mmunoassay).
(podrobnější popis principů metod viz kapitola 13, str. 13-21).
Od určité hodnoty koncentrace Cystatinu C v plazmě vykazují metody poněkud rozdílné výsledky, proto
existují i dvě rovnice pro výpočet odhadu glomerulární filtrace – Leveyova (PENIA) a Grubbova (PETIA).
Levey: eGF = 1,278 . [CysC]
-1,19
Grubb: eGF = 1,412 . [CysC]
-1,68
(tato rovnice je použitelná do koncentrace 2,5 mg CysC/l)
[CysC] = koncentrace cystatinu C v krevním séru v mg/l.
Pro vzájemnou srovnatelnost je vyžadováno použití certifikovaného referenčního materiálu. V současné
době je k dispozici certifikovaný referenční materiál pro cystatin C ERM DA-471/IFCC, jehož certifikované
hodnoty byly určeny metodami RID, PETIA a PENIA a jsou nabízeny soupravy s návazností na tento
materiál).
V roce 2014 Grubb a celá řada dalších spolupracovníků vyvinuli, za pomoci sedmi metod stanovení
standardizovaných podle mezinárodního kalibrátoru, novou rovnici pro odhad GF z koncentrace cystatinu C,
prakticky nezávislou na metodě stanovení a bez členů určujících pöhlaví a rasu.
Český překlad práce lze nalézt např. ve firemním časopisu fy Roche Diagnostics, Labor Aktuell, 01/15, str. 14 – 23.
Cystatin C je lepším ukazatelem funkce glomerulů než clearance endogenního kreatininu! Je třeba zvážit i výhodu
stanovení v plazmě před sběrem moči!
Poznámka: Z hlediska rané detekce akutního ledvinového selhání (AKI) se jako velmi nadějný jeví nový marker z rodiny lipokalinů,
malých sekrečních proteinů účastnících se převážně transmembránových přenosů lipofilních substancí, neutrofilní lipokalin
asociovaný s gelatinasou (NGAL), jehož hladina v moči i v plazmě se oproti hladině S-kreatininu v případě hrozícího AKI zvyšuje
podstatně rychleji, řádově v hodinách. Základní zkušenosti v klinické praxi však teprve musí přijít. Srovnej též v kapitole 16,
Markery na str. 16-19. Stručně k dané problematice viz. např. zde.
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-12
8.3. Kyselina močová
Kyselina močová (1,3,8-trioxopurin) – u člověka a primátů konečný produkt katabolismu purinových látek
(adenin, guanin). Adenin a guanin jsou součástí především nukleových kyselin (viz kapitola 22), ale i
některých koenzymů (ATP, NAD(P) aj.). Kyselina močová vzniká jak z purinových látek tělu vlastních, tak
z purinových látek přivedených do organizmu potravou (!).
Tvorba kyseliny močové
Obecně: nukleové kyseliny  nukleotidy  nukleosidy  volné báze  kyselina močová
To je katabolická dráha purinových bází. Ty ovšem mohou být zčásti přeměněny zpět na nukleotidy o
opětně využity k syntéze nukleových kyselin.
Ostatní savci přeměňují kyselinu močovou dále na allantoin (alantoin):
Kyselina močová 5-hydroxyisourát Alantoin
(oxidovaná forma)
Sumárně zapsaná rovnice tvorby alantoinu:
kyselina močová + O2 + H2O alantoin + CO2 + H2O2
Kyselina močová není pouze odpadní látkou, je významným antioxidantem a chrání organismus před účinky
volných radikálů. Přeměna na allantoin probíhá i u člověka (oxidací kyseliny močové působením volných
radikálů), malé množství alantoinu se dá prokázat v krvi člověka a toto množství je ukazatelem zátěže
organismu volnými radikály.
Asi 90% kyseliny močové profiltrované glomeruly se resorbuje v proximálním tubulu. V distálním tubulu
dochází jednak k sekreci kyseliny močové, jednak k její absorpci. Pochody v distálním tubulu mohou být
ovlivněny řadou aniontů a léků. Zbývající (neresorbovaný) podíl kyseliny močové se vylučuje močí.
Kyselina močová je špatně rozpustná ve vodě. Tak mohou vznikat krystaly v okolí kloubů (dna) a „kameny“
v močových cestách.
N
+
O
OH
OH
NH
NH
N
NH2
O
N
+
O
O
OH
OH
OH
O
P
NH
NH
N
NH2
O
N
NH
NH
N
NH2
O
Guanosinmonofosfát Guanosin Guanin Xantin
N
+
O
O
OH
OH
OH
O
P
N
NH
N
NH2
Adenosinmonofosfát
N
+
O
OH
OH
N
NH
N
NH2
Adenosin
N
N
NH
N
NH2
Adenin
N
NH
N
N
H
O
NH
NH
N
N
H
O
O
Hypoxantin
N
N
N
H
N
OH
OH
OH
Kyselina močová
Xantinoxidáza
(XO)
XO
N
H
NH
N
H
N
H
O
O
O
N
H
N
H
O
O
NHO
NH2
urikáza
+O2 +H2O
–H2O2
N
H
NH
N
H
N
O
O
O
OH
–CO2
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-13
o-fenanthrolin
8.3.1. Metody stanovení kyseliny močové
8.3.1.1. Redoxní neenzymové metody
(v současnosti se nedoporučují)
a. Redukce solí kyseliny fosfowolframové v alkalickém prostředí – vznikají modré roztoky vhodné k fotometrii
b. Redukce železitých solí kyselinou močovou a reakce s o-fenanthrolinem
kyselina močová
Fe3+
Fe2+
+ o-fenanthrolin  červené roztoky
Příklad přípravy činidla kyseliny fosfowolframové v laboratoři: 40 g wolframanu sodného p.a. nebo 44,9 g Na2WO4.2H2O rozpustit
v asi 300 ml destilované vody. Přidat 32 ml 85% kyseliny o-fosforečné a mírně vařit pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Po
ochlazení na laboratorní teplotu přidat 300 ml destilované vody, 32 g Li2SO4.H2O p.a. a doplnit destilovanou vodou na 1000 ml.
Připravit 3 mol/l NaOH (12 g NaOH do 100 ml destilované vody) a upravit jím pH fosfowolframového činidla na hodnotu pH = 2,5 ±
0,1 (spotřeba asi 76 ml). Roztok činidla má být čirý a slabě žlutozelený. Uchovávat v lednici.
Tato ukázka návodu na přípravu činidla má pouze demonstrovat ještě nedávné poměry v laboratorní praxi.
Příprava reagencií v laboratoři v současné době se nedoporučuje!
8.3.1.2. Enzymové metody
Použitý enzym – urikáza – katalyzuje oxidaci kyseliny močové kyslíkem na peroxid vodíku a allantoin (viz
rovnici na str. 7-14). Peroxid vodíku se stanoví
a. Přímo, s využitím Trinderovy reakce (viz Kapitola 3, str. 3-21)
Toto uspořádání měl např. set BLT: OXOCHROM KYSELINA MOČOVÁ (UA 105 E)
Diagnostický set Erba-Lachema Diagnostika: KYSELINA MOČOVÁ AOD 100 používá místo 4-chlor-3methyfenolu
tzv. TOOS, tj. sodnou sůl N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidinu. Vzniklý
peroxid vodíku se tedy stanovuje oxidační kopulací se 4-aminoantipyrinem a s TOOS (za katalýzy
peroxidázou). Fotometrie při 505 nm.
b. Nepřímo, s využitím katalázy
c.
kataláza
H2O2 + CH3OH H2O + HCHO
methanol formaldehyd
HCHO + CH3-CO-CH2-CO-CH3 + NH4
+
= 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidin
acetylaceton (žlutá látka, fotometrie při 410 nm)
Poznámka: Metody s katalázou se v současnosti nedoporučují.
8.3.2. Klinické poznámky
Referenční rozmezí se mírně liší podle použité metody, obecné hodnoty uvádí např. Racek
pro muže 200 – 420 mol/l,
pro ženy 140 – 340 mol/l.
 Hyperurikémie:
Vyšší koncentraci kyseliny močové v krvi mají muži (vzhledem k ženám) a obézní osoby. Obecný princip
hyperurikémie – zvýšená tvorba a snížené vylučování kyseliny močové. Velmi často bývají příčinou
hyperurikémie oba mechanismy současně.
N
CH3
CH3
N
CH3
CH3
OO
CH3
CH3
O
O
N
N
CH3
NCH3
OH
S
O
OH
O
N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin
3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidin
Lutidin
(2,4-dimetylpyridin)
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-14
a. Příčiny zvýšené produkce kyseliny močové
- zvýšený příjem purinů v dietě (maso, zvěřina, vnitřnosti)
- zvýšená syntéza purinů díky zvýšené aktivitě příslušného enzymu
- zvýšená degradace nukleových kyselin při zániku velkého množství buněk (po ozáření, po léčbě
cytostatiky, pneumonie aj. chorobné stavy)
- zvýšené odbourávání ATP (např. po zátěži)
- u některých dědičných onemocnění postihujících enzymový aparát metabolismu adeninu a guaninu
Hyperurikémie obecně mohou být projevem dědičné poruchy (defekt určitého enzymu, primární
hyperurikémie, viz. odst. 8.5.), příkladem jsou Lechův-Nyhanův syndrom (nefunkční
hypoxantinguaninfosforibosyl transferáza) a Von Gierkeho choroba (nefunkční glukosa-6-fosfatáza), nebo
jsou důsledkem jiné choroby (sekundární hyperurikémie), např. karcinomu, psoriázy, (lupénky),
myeloproliferativních procesů, léčby diruetiky či zvýšeného tkáňového obratu.
b. Příčiny sníženého vylučování kyseliny močové
- stavy se sníženou glomerulární filtrací
- soutěž některých aniontů s kyselinou močovou o aktivní sekreci v distálním tubulu (takto působí např.
laktát, thiazidová diuretika aj.); tubulární sekreci kyseliny močové snižuje i alkohol
Pro zvídavé studenty:
Syntéza purinových nukleotidů probíhá v organismu de novo a organismus si tuto syntézu pečlivě hlídá. Purinové nukleotidy se
budují sledem energeticky náročných reakcí a celý postup začíná na fosofribosylpyrofosfátu (PRPP). Klíčovou roli regulace syntézy
zde hraje hned první enzym, PRPP-glutamylamidotransferáza. AMP, ADP, GMP a GDP zpětnovazebně ovlivňují (inhibují) aktivitu
této transferázy, takže organismus si tvoří pouze potřebné množství purinových nukleotidů. Aktivita zmíněného enzymu může být
geneticky pozměněna, a to ve smyslu zvýšené rychlosti reakce (Vmax je vyšší oproti „normálu“), vyšší afinity k PRPP nebo rezistence
k inhibici zpětnou vazbou. Každá z těchto poruch vede ke zvýšené produkci purinových katabolitů, tj. zejména kyseliny močové.
Klinické projevy této genetické poruchy (těchto genetických poruch) se nazývají dna.
Dna (arthritis uratica, podagra), je metabolické onemocnění, kdy došlo k přesáhnutí meze rozpustnosti urátu (močanu) sodného.
Bývá doprovázena hyperurikémií, ale neplatí to vždy. Rovněž tak hyperurikémie nemusí mít příznaky dny. Vznikající krystaly této
látky se ukládají v okolí kloubu a vyvíjí se zánětlivá reakce, vzniká tzv. dnavá artritida. Tyto krystalky mohou způsobit i mnohem
závažnější onemocnění, kterým jsou nefropatie, s možným tragickým scénářem selhání ledvin a smrti.
Léčba se snaží potlačit zvýšenou tvorbu kyseliny močové, zvýšit její vylučování, případně odstranit primární onemocnění, které
k hyperurikémii vede.
Léčba: Léčba se snaží omezit tvorbu kyseliny močové nebo zvýšit její exkreci (nejsou-li postiženy ledviny), dále se používají léky s protizánětlivým
účinkem, omezuje se tmavé maso a alkohol v dietě. U sekundární dny se ovlivňuje, pokud to jde, primární onemocnění.
 Hypourikémie:
Zhusta bývá příčinou působení léků, které mohou působit jako inhibitory xantinoxidázy, nebo mohou
snižovat reabsorpci kyseliny močové v distálním tubulu. Možnou příčinou může být i (vzácný) vrozený
defekt tvorby xantinoxidázy, případně vážné postižení jater. V tomto případě se mohou u postižené osoby
vyskytovat xantinové močové konkrementy. Nález hypourikémie má malý diagnostický význam
8.4. Některé další dusíkaté látky
8.4.1. Amoniak
Vzniká při degradaci dusíku aminokyselin v játrech, kde z něj vzniká močovina a v proximálním tubulu ledvin
hydrolýzou glutaminu.
Referenční rozmezí amoniaku v plazmě se uvádí 35 – 50 mol/l (záleží na použité metodě). Odběr plazmy
je speciální (anaerobní s okamžitým chlazením) a zpracování materiálu musí být bezprostřední. Nejčastější
indikací tohoto vyšetření je selhání jater.
8.4.1.1. Metody stanovení amoniaku
Využívá se typu reakce, známého ze stanovení močoviny, s glutamátdehydrogenázou:
GLDH
NH4
+
+ kyselina oxoglutarová glutamát
+
+ H2O
NADH + H+
NAD+
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-15
Při analýze je nutno pracovat s vysoce čistou vodou prostou amoniaku, který se ve stopách vyskytuje běžně
v ovzduší. Diagnostická souprava může obsahovat ionex na bezprostřední přípravu čisté vody. Odběr musí
být anaerobní, vzorek uchovávaný při teplotě tajícího ledu a analýza musí proběhnout do 1 hodiny po
odběru. Použití moderního odběrového systému a bezprostřední doprava vzorku do laboratoře s okamžitou
následnou analýzou preanalytické podmínky zjednodušují.
Indikace vyšetření: U pacienta se projevují mentální změny, dezorientace, ospalost, nebo když upadne do kómatu;
u pacientů se stabilizovanou jaterní chorobou v případě náhlého zhoršení stavu (spolu s dalšími jaterními testy).
8.4.2. Aminokyseliny
Mezi látky nebílkovinného dusíku patří i aminokyseliny. Na rozdíl od močoviny, kreatininu a kyseliny
močové však nejsou odpadními látkami, ale prekursory (výchozími látkami), ze kterých si organismus staví
bílkoviny tělu vlastní. Aminokyseliny jsou i důležitými metabolity využívané organismem k získávání energie
i k přeměně na různé biologicky významné sloučeniny, jak je zřejmé z jejich bohatého metabolismu, stručně
znázorněného na schématu. Navzdory svému významu nejsou aminokyseliny v ledvinných tubulech zcela
resorbovány, a proto se nacházejí i v moči.
Volné aminokyseliny se stanovují v séru a/nebo v moči, a to:
 jako tzv. -aminodusík (tj. souborně všechny aminokyseliny; aminodusík podává informaci o
celkovém množství aminokyseliny v dané tělesné tekutině a má jen omezený diagnostický význam)
 jako spektrum aminokyselin
 cíleně konkrétní aminokyseliny (hydroxyprolin, cystin...)
Indikace stanovení aminokyselin
 u jaterního selhání (především jako -aminodusík)
 u nemocných v těžkém stavu (spektrum)
 při diagnostice dědičných metabolických poruch (cílené stanovení, případně spektrum aminokyselin)
 při posuzování kostního metabolismu (cílené stanovení aminokyselin hydroxyprolinu a hydroxylyzinu
z kolagenu – viz kapitola 19 Biomarkery, str.19-25.).
AMINOKYSELINY
bílkoviny
vzájemné přeměny
SER-GLY; SER-CYS aj.
bílkoviny tělu vlastní
hormony, biogenní aminy, nukleotidy
NH3
močovina
uhlíkatá kostra aminokyselin
vznik některé C4-
dikarboxylové
kyseliny a tím
napojení na
metabolismus
sacharidů
(glukoplastické
AK) PHE, TZR,
ILEU, ARG, PRO,
HIS, GLU, ASP,
[TRP]
tvorba volného
acetoacetátu
(ketoplastické
AK) PHE, TYR,
ILEU, LEU, LYS
jednouhlíkaté
štěpy (C1)
SER, GLY,
MET, HIS
aktivní
mastné
kyseliny ALA,
VAL, ILEU,
LEU (LYS –
jinou cestou)
odbourání na
CO2 a H2O
trávení
odštěpení NH3
glutamin
proteosyntéza
Stručný přehled metabolismu AK
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-16
Změny v hladinách plazmatických aminokyselin nastávají zejména u jaterního selhání a akutní hepatitidy:
8.4.2.1. Metody stanovení aminokyselin
-aminodusík se stanovuje ninhydrinovou reakcí - stručné schéma reakce:
R-CHNH2-CO2H + ninhydrin = redukovaný ninhydrin + R-COH + CO2 + NH3
aminokyselina aldehyd
ninhydrin + redukovaný ninhydrin + NH3 = [ninhydrin – N – ninhydrin]
(modře zbarvený komplex)
Popis provedení reakce pro zvídavé studenty: biologický materiál se deproteinuje, aminokyseliny v supernatantu se potom
nechají reagovat za varu s činidlem (ninhydrin); dochází k odbourání aminokyselin na aldehyd a oxid uhličitý, současně se uvolní
amoniak, který s ninhydrinem reaguje za tvorby sloučeniny složené ze dvou molekul ninhydrinu spojených atomem dusíku;
výsledkem je modrý roztok, vhodný k fotometrii; při stanovení interferují močovina a pochopitelně amoniak z okolí, které
s ninhydrinovým činidlem reagují také; reakce je poměrně citlivá, lze jí zjistit množství aminokyselin nižší než 1g.
Druhou možností je reakce aminokyselin s fluorescaminem; lze zjistit nanogramová množství aminokyselin
Referenční rozmezí u dospělých: 2,4 – 4,0 mmol/l (u novorozenců jsou hodnoty vyšší)
Jednotlivé aminokyseliny lze oddělit a stanovit chromatografickými a elektroforetickými metodami, o
kterých se podrobněji pojednává v hodinách Vybraných laboratorních metod.
Spektrum aminokyselin lze stanovit jak chromatografickými, tak elektroforetickými technikami
Princip chromatografických metod: molekuly dělených látek se rozdělují (podle
různých fyzikálně-chemických principů jako jsou adsorpce, rozpustnost, velikost
molekuly, ...) mezi nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní) fázi (např.
mezi dvě rozpouštědla). Dělení je založeno na skutečnosti, že molekuly ve směsi
mají rozdílné tendence připojit se k jedné nebo ke druhé fázi.
Chromatografické metody používané pro analýzu aminokyselin:
- papírová chromatografie
- papírová chromatografie dvourozměrná
- tenkovrstevná chromatografie (TLC – Thin Layer Chromatography)
- iontově-výměnná (ionexová) chromatografie
- automatizovaná ionexová chromatografie: automatické analyzátory
aminokyselin (na výstupu je ninhydrinová reakce)
Z elektroforetických metod je to především vysokovoltová elektroforéza (pracuje se
s napětím 2000 – 5000 V, případně i vyšším).
Koncentrace jednotlivých aminokyselin v plazmě:
Od stopových množství až po 650 mmol/l (maximální koncentrace alaninu u zdravých osob).
8.5. Dědičné metabolické poruchy
V předchozím textu jsme se setkali a v dalším textu se setkáme s pojmy typu autosomálně recesivní
metabolická porucha metabolismu, autosomálně recesivní genetické onemocnění s poruchou v genu
kódujícím. apod. Dědičné metabolické poruchy (DMP) jsou molekulární geneticky podmíněné
choroby, které (negativně) ovlivňují metabolické dráhy v těle, protože, díky genetickému defektu, chybí
v metabolické dráze určitá klíčová součást. Fyziologická funkce metabolické dráhy je tak narušena a vyústí
v různé patologické projevy dané choroby. Důsledkem genetického defektu je chybná tvorba příslušné
bílkoviny a podle důležitosti bílkoviny v metabolismu či stavbě organismu, vzniknou různé klinické projevy.
Analyzátor aminokyselin
AAA 500, fy Ingos, s.r.o.
Jaterní selhání
: alanin, arginin, kyselina glutamová
: glycin, serin, threonin
Akutní hepatitida
:fenylalanin, tyrozin
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-17
Bílkoviny, které mohou být tímto defektem postihnuty
 enzymy: nejčastější případ, důsledkem je hromadění substrátu a/nebo nedostatek produktu;
vznikají náhradní metabolické cesty, atypické, často toxické látky
 krevní bílkoviny (nikoliv enzymy): plazmatické bílkoviny nebo hemoglobin
 strukturní bílkoviny buněčné membrány: změna tvaru buňky a její odolnosti k cytolýze
 receptor: buňka ztrácí schopnost navázat a vychytat určitou látku
 regulační protein: projevem může být např. nekontrolovaný růst (vznik malignity)
U tzv. enzymopatií je příčinou dědičné metabolické poruchy mutace v genu, který kóduje určitý enzym.
Většinou (ale ne vždy) je dědičnost recesivní, protože nepostižená alela zajišťuje tvorbu dostatečného
množství funkčního enzymu.
Pokud enzym chybí, nebo je nefunkční, mohou nastat tři případy:
1. Netvoří se produkt reakce daným enzymem katalyzované a nemohou tak vznikat ani následné
produkty, pro který je předchozí produkt prekurzorem. Některá z (nevytvořených) látek pak tělu
chybí
2. Substrát reakce daným enzymem katalyzované se neodbourává, hromadí se. Tato kumulace může
poškozovat buňky či tkáně, může jí i o látku potenciálně toxickou.
3. Substrát, který se nemůže přeměnit na produkt, se začne náhradní cestou odbourávat na jinou
látku, která bývá toxická a může určité buňky či tkáně poškozovat.
U konkrétní osoby může dojít i ke kombinaci těchto mechanismů. Metabolické dráhy či metabolické funkce
mohou být narušeny i mutacemi v genech pro receptory, specifické proteiny či strukturní proteiny.
Dědičných metabolických poruch je obrovské množství, některé se vyskytují relativně často (fenylketonurie),
jiné se vyskytují naopak velmi vzácně, v počtu několika jedinců na celém světě. Ne všechny příčiny těchto
chorob byly již objeveny.
Poznámka: Ne každá mutace nutně vede ke genetické poruše. Záleží také na místě v proteinu, kde k záměně aminokyseliny došlo.
Některé změny se vůbec nemusí projevit, ale to znáte z jiného předmětu.
8.5.1. Principy laboratorní diagnostiky dědičných metabolických poruch
Rozlišují se tři úrovně detekce poruchy, tj. detekce na úrovni (viz též schéma na str. 7-23)
1. Nukleové kyseliny (DNA, mRNA) - metody přímo prokazují defektní gen; nejznámější metodou z této
oblasti je polymerázová řetězová reakce (zkratka PCR, výslovnost pí sí ár, z anglického polymerase
chain reaction), ale existuje celá řada dalších metod. Problematice DNA a RNA diagnostiky lidských
chorob, PCR a dalším metodám se věnuje Kapitola 19, DNA diagnostika lidských chorob. Jedná se o
moderní metody, které poskytují vesměs lepší výsledky než analýza např. na úrovni proteinu.
2. Proteinu – enzym se může prokázat v tkáňové kultuře fibroblastů histochemicky či
imunohistochemicky; proteiny bez enzymové aktivity se prokazují např. změnou putování při
elektroforéze a jinými elektromigračními metodami (podrobnosti o bílkovinách a metodách jejich
stanovení jsou uvedeny v Kapitole 10, Bílkoviny).
3. Substrátu (postiženého enzymu) – nejdéle používaný způsob (viz dále v textu popisy metabolických
poruch aminokyselin).
Substrát
Produkt
Mutace
jaderné DNA
Mutace
mitochondriální
DNA
Multiorgánové
postižení
Podstata vrozených metabolických poruch
Pozměněný
(nefunkční)
protein
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-18
V diagnostice dědičných metabolických poruch hraje poměrně důležitou roli také stanovení kreatininu,
protože většina stanovovaných analytů v moči se přepočítává na jednotkovou koncentraci kreatininu. Mezi
tyto analyty patří zejména organické kyseliny, aminokyseliny, puriny a pyrimidiny.
Tzv. Kaufmanův koeficient dává do poměru koncentraci kyseliny močové a kreatininu (obojí) v moči. Tento koeficient je nezbytný
při stanovení hyper- a hypourikosurií spojených s dědičnými poruchami purinového a pyrimidinového metabolizmu
*)
a střádavými
onemocněními
**)
*)
např. Lesch-Nyhanův syndrom, tj. úplný deficit hypoxanthin-guanin-fosforibosyltransferázy, kde je Kaufmanův koeficient zvýšený,
naopak např. u deficitu purinnukleosid fosforylázy a xantindehydrogenázy je tento koeficient snížený
**)
např. svalová glykogenóza typu I a VII, kde se nachází Kaufmanův koeficient zvýšený
8.5.2. Poruchy metabolismu aminokyselin a jejich příčiny
Poruchy metabolismu aminokyselin lze rozdělit do dvou velkých skupin.
Jsou to poruchy
 intermediárního metabolismu aminokyselin, kde příčinou je defekt tvorby enzymu potřebného pro
jejich metabolismus (důsledkem je hromadění metabolitu, tj. substrátu příslušného enzymu, před
přerušením metabolické dráhy a poškození tkání, především CNS)
 transportu aminokyselin, kde lze rozlišit poruchy
o renálního tubulárního transportu (reabsorpce), tj. poruchy resorpce určitých aminokyselin
v tubulech ledvin
o střevního transportu určité aminokyseliny, tj. poruchy jejich absorpce z tenkého střeva; důsledkem
je malnutrice této aminokyseliny); v obou případech je výsledkem atypické složení aminokyselin
v moči.
Poruchy intermediárního metabolismu aminokyselin
 Fenylketonurie – autosomálně recesivní genetická metabolická porucha, tzn. dědí
se od obou rodičů, při které se fenylalanin nepřeměňuje na tyrozin, protože došlo
k mutaci genu zodpovědného za tvorbu jaterní fenylalanin hydroxylázy, nezbytné
pro tuto přeměnu. Při zanedbání dojde u jedince k mentální retardaci, epileptickým
záchvatům a dalším závažným medicínským projevům. Proto se pravidelně
vyhledává u všech novorozenců (v ČR od roku 1975): metodou je Guthrieho
[guth´ri:] test pro screening. Principem testu je podpora růstu bakteriálního kmene
Bacillus subtilis v okolí terčíku s krví obsahující zvýšenou koncentraci fenylalaninu,
což je esenciální složka pro tento kmen (viz obrázek vpravo).
U tzv. variantních fenylketonurií má fenylalanin hydroxyláza částečně zachovanou
aktivitu.
Poruchy
metabolismu
aminokyselin
Poruchy intermediárního
metaboslismu aminokyselin
Poruchy transportu aminokyselin
Poruchy renálního tubulárního transportu
určitých aminokyselin
Poruchy střevního transportu určité
aminokyseliny
Schéma různých úrovní detekcí dědičných metabolických poruch
Změněná DNA
Změněná RNA Změněná bílkovina
Hromadění substrátu
Nedostatek produktu
Vznik alternativních produktů
1. úroveň 3. úroveň
Metody analýzy nukleových kyselin Metody analýzy bílkovin Různé metody analýzy
2. úroveň
Guthrieho test
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-19
Léčba: speciální strava bez fenylalaninu (do dospělosti, u žen po celé období plodnosti, protože během těhotenství může
dojít k tzv. maternální fenylketonurii, tj. ovlivnění nepostiženého plodu vysokou hladinou fenylalaninu v krvi postižené
matky, průnikem přes placentu). Léčba závisí také na stupni postižení produkce enzymu (variantní fenylketonurie),
v některých případech je dieta méně přísná, popřípadě žádná.
 Alkaptonurie – autosomálně recesivní, vzácné postižení metabolismu aminokyselin fenylalaninu a
tyrosinu: kyselina homogentisová (alkapton) se nemůže dále metabolizovat na kyselinu fumarovou a
acetoctovou. Její přebytek má za následek ukládání alkaptonu a jeho oxidačních, tmavě zbarvených
produktů v kůži, v chrupavkách a ve vazivu, což vede k degenerativním změnám kloubů,
osteoartritidě, poškození srdečních chlopní a tvorbě ledvinových kamenů.
Léčba: Žádná jednoznačná léčba neexistuje. Doporučují se vysoké dávky vitamínu C a omezení (zvl. u dětí) fenylalaninu a
tyrosinu ve stravě.
 Tyrozinémie - tyrozin se nemůže dále metabolizovat na kyselinu homogentisovou což vede ke
zvyšování jeho koncentrace v krvi
TyrosinFenylalanin
Hormony
(adrenalin,
thyroxin)
Kyselina
fenylpyrohroznová
(a jiné látky)
Kyselina
homogentisová
meziprodukty
(DOPA
dopachinon
dopachrom
indolchinon)
Melanin
Moč
JÁTRA
Kyselina fumarová
+
kyselina acetoctová
fenylalaninhydroxyláza
Genetická porucha (1)
náhradní reakce
(3,4)
melanomy
Genetická porucha (2)
transamináza
polymerace
Melanogeny, alkapton, kyselina fenylpyrohroznová – nástin metabolismu
Legenda k obrázku (červená čísla v závorkách odpovídají číslům v závorkách na obrázku):
(1) Fenylketonurie: (nedostatek fenylalaninhydrolázy, proto vzrůstá hladina fenylalaninu)
(2) Alkaptonurie: (chybí homogentisátoxygenáza odbourávající kyselinu homogentisovou, tj. alkapton, v játrech a
v ledvinách, proto se kyselina homgentisová/alkapton vylučuje do moči)
(3,4) Hypertyrosinemie: typ II a I, tzv. tyrozinózy,
I – asi defekt fumarylacetátacetáhydrolázy a maleinylacetáthydrolázy,
II – defekt tyrosintransaminázy z jater.
O
NH2
OH
O
O
OH
O
NH2
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
O
Fenylalanin Kyselina fenylpoyrohroznová Kyselina homogentisová Kyselina fumarováTyrosin
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-20
o Tyrozinemie I, autosomálně recesivní genetické onemocnění s postižením (pravděpodobně)
fumarylacetáthydrolázy případně i maleinylacetáthydrolázy. V krvi je zvýšená koncentrace
tyrozinu a metioninu. Průběh může být akutní nebo chronický. Při neléčení akutní tyrozinózy
selhávají kojencům játra a jedinec zmírá asi po půl až třičtvrtě roce. U chronického průběhu se
vyskytují těžké jaterní cirhózy, hepatomy, špatně fungují ledviny. Někdy se pozoruje i porucha
duševního vývoje, hyperglykemie, hypertenze aj. Nemocní se dožívají přibližně 10 let.
Léčba: Dieta chudá na tyrozin a fenylalanin.
o Tyrozinemie II, Richner-Hanhartův syndrom, autosomálně recesivní genetické onemocnění
s postižením jaterní cytosolové tyrosinaminotransferázy (mitochondriální izoenzym má funkci
zachovanou): v krvi a v moči se nacházejí zvýšené koncentrace tyrozinu (tyrozin je jediná
aminokyselina zvýšená v moči). U postiženého jedince dochází k různým malformacím,
změnám na kůži, k poruše duševního vývoje. Změny na játrech a ledvinách pozorovány nejsou.
Léčba: Upravená dieta, tzn. snížený přísun aromatických aminokyselin a proteinů.
 Albinismus - vrozený deficit tyrozinázy, porucha přeměny tyrozinu na melanin. Důsledkem je
postižení kůže (bílá až průhledná), duhovky (nebarevná, někdy narůžovělá, díky prosvítající krvi
v kapilárách), světloplachost, problémy s viděním aj.
Léčba: Jedná se zejména o nápravu vidění, ať již chirurgicky (těkání očí) nebo pomocí brýlí či kontaktních čoček.
Homocystinurie - dědičná autosomálně recesivní porucha metabolismu cysteinu, při které díky
deficitu cystathionin--syntázy, dochází ke zvýšeným hladinám
homocysteinu.Tato skutečnost má četné důsledky, včetně mentální retardace,
epilepsie, psychických chorob, očních anomálií, trombóz, předčasné
aterosklerosy aj.
Léčba: Specifická léčba neexistuje. Doporučují se vysoké dávky vitamínu B6, případně dieta s nízkým
obsahem metioninu (obecně dieta s nízkým obsahem bílkovin), často také léčba pomocí
trimetylglycinu (betainu), který konvertuje přeměnu homocysteinu zpátky na metionin, normální
dávky kyseliny listové a přídavek cysteinu do stravy. Různí jedinci také různě reagují, podle toho se léčba upravuje. (O
homocysteinu je také zmínka v Kapitole 13, Vitamíny).
a. Poruchy transportu aminokyselin
 Cystinurie (nejčastější případ) – autozomálně recesivní dědičně podmíněná metabolická porucha
vstřebávání cystinu a bazických aminokyselin
lyzinu, argininu a ornitinu ve střevech a
ledvinách. Důsledkem je vysoká koncentrace
nejméně rozpustného cystinu v moči a tvorba
cystinových konkrementů v ledvinách,
v močovodu, ale také ve žlučníku, a to již
v mladém věku. Cystinurie je asymptomatická
(bezpříznaková), pokud se nevytvoří kameny.
Jakmile se kámen vytvoří, nebo produkce
kamenů je častá či závažná může se projevit
několik symptomů, např. nausea, zvracení,
chronická bolest, hematurie atd.
Léčba: Odpovídající hydratace, alkalizace moči, úprava
diety s redukcí soli a příjmu bílkovin, zejména s obsahem
metioninu. Léčba kamenů je zvláštní kapitolou jiného medicínského odvětví.
 Hartnupova choroba, autosomální recesivní metabolická porucha transportu neutrálních
aminokyselin v ledvinných tubulech a tenkém střevě. Postižený gen kontroluje absorpci těchto
aminokyselin ze střeva a reabsorpci v ledvinách. Osoby s touto poruchou nemohou patřičně
absorbovat příslušné aminokyseliny ze střeva a reabsorbovat je z ledvinných tubulů. Do moči se tak
vylučují značná množství aminokyselin typu tryptofanu, důsledkem jsou projevy nedostatku
aminokyselin, poškození CNS produkty odbourávání (např. indikanem, produktem oxidace
tryptofanu), snížená syntéza niacinu (důsledek malabsorpce tryptofanu), kožní pelagroidní změny aj.
Léčba: Deficit aminokyselin může být překonán dietou bohatou na proteiny. Pacienti se musí chránit před působením
slunečního světla. U některých pacientů je třeba dodávat kyselinu listovou.
O
NH2
NH2 OH
NH
O
NH
NH2
NH2
OH
O
NH2
SOH
O
NH2
S OH
OH
NH2
NH2
O
Cystin Lysin
Arginin Ornitin
OH
SH
NH2 O
Homocystein
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-21
Na závěr malý výlet do patologie pro zvídavé studenty
Choroby mohou mít genetický základ, nebo mohou být získané vlivem okolního prostředí. Získat lze chorobu již
prenatálně (před porodem), perinatálně (v době porodu) nebo postnatálně (kdykoliv po porodu). Některé choroby
jsou tak kongenitální (dítě se narodí s onemocněním, které může být
genetické, nebo získané v nitroděložním prostředí. Některé choroby jsou
typické pro dětský věk, další napadají zejména dospělé jedince a některé
nemoci jsou charakteristické pro seniory. Nemoc může být také primární,
kdy se jedná o poruchu samu o sobě (orgánu, tkáně, procesu), nebo
sekundární, kdy je choroba výsledkem jiného postižení, které se manifestuje
v daném orgánu, tkáni, procesu. Defekty mohou být strukturální nebo
funkční (většinou jdou ruku v ruce spolu). Defekt může být částečný nebo
celkový, může být lokalizován v určité tkáni či buněčné linii, nebo může být
systémový, kdy zahrnuje více tkání a orgánů. Některé choroby jsou
progresivní, vzdorující nasazené léčbě, zatímco jiné vymizí bez léčení,
organismus je schopen si s nimi sám poradit. Bohužel, mnohé choroby
ovlivňují, a to negativně, buněčné či humorální komponenty, které mají
sloužit k obraně organismu. Některé choroby jsou idiopatické, objevují se
z neznámých příčin a s neznámými mechanismy.
8.6. Ostatní látky s nebílkovinným dusíkem
Z těch nejznámějších sem patří např. karnitin, glutathion, oxid dusnatý a nebílkovinné dusíkaté látky s hormonálním
účinkem.
Karnitin je (v šesti krocích) syntetizován v játrech z lysinu a metioninu za přispění kyseliny askorbové. Přírodním
izomerem je L-karnitin. Nachází se ve značné míře ve svalech, odtud i název (caro, lat. = maso). Karnitin pomáhá
přenést acyl-CoA (aktivovaný řetězec mastné kyseliny) přes mitochondriální membránu do mitochondriální matrix,
kde dojde k -oxidaci mastné kyseliny („acylu“). Přenos je podstatně složitější, než je zde popsáno a zúčastňuje se ho
několik enzymů. Používání karnitinu jako „spalovače tuků“ ve formě potravního doplňku je sice moderní až módní, leč
sporné, neexistují vědecky podložené důkazy, že takto funguje.
Gluathion je přirozeně se vyskytující tripeptid (g-glutamylcysteylglycin, kap. 13, str. 40), který se zúčastňuje redoxních
pochodů v organismu. Jako příklad může posloužit příspěvek glutationu k udržení redukovaného stavu hemoglobinu
(kap. 9, str. 5).
Oxid dusnatý (NO) je řazen mezi tkáňové hormony, stručná zmínka o oxidu dusnatém v této souvislosti je uvedena
v kapitole 17, v tabulce n str. 17-45.
N
+
CH3
CH3
CH3
OH O
OH
Karnitin
O
OH NH
NH
NH2
O
SH
O
OH
O
Glutathion
O
NH2
NH2
OH
O
NH2
S
CH3 OH
Lysin Methionin
Robert Guthrie, MD, PhD
klinický chemik a mikrobiolog
1916 - 1995
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-22
8.7. Stručné shrnutí kapitoly
8.7.1. Močovina
 Močovina je odpadní produkt organismu, kterým likviduje jedovatý amoniak, produkt metabolismu
bílkovin.
 Moderní metody stanovení močoviny jsou enzymové. Enzym ureáza odštěpuje amonný kation,
který může být stanoven pomocí glutamátdehydrogenázy UV-testem při 340 nm (plně enzymový
test), nebo může být stanoven pomocí nitroprussidu sodného, chlornanu a salicylanu, jako barevná
sloučenina, při 550 nm (Berthelotova reakce).
 Koncentrace močoviny v plazmě závisí na kvalitě glomerulární filtrace a tubulární resorpce ledviny,
proteinovém metabolismu, tj. na přívodu bílkovin do organismu a jejich katabolismu.
 Změny koncentrace močoviny v plazmě mohou být obousměrné. Nárůst může být způsoben
nadměrnou tvorbou, poruchou jejího vylučování, nebo kombinací obou principů. Pokles může být
způsoben poruchou její tvorby nebo ztrátami močí.
 Koncentrace močoviny v moči závisí na kvalitě glomerulární filtrace a tubulární resorpce ledviny, na
hodnotě krevního tlaku (průtok ledvinou) a na urémii
 Laboratorní stanovení močoviny podává obraz o kvalitě ledvinových funkcí, funkčnosti jater,
metabolismu bílkovin a dalších skutečnostech.
8.7.2. Kreatinin
 Kreatinin je cyklický amid kreatinu, odpadní produkt z kreatinfosfátu, energetického zdroje pro
svalovou práci. Při koncentracích v plazmě do 200 mol/l se vylučuje prakticky glomerulární filtrací.
 Nejběžnější metodou stanovení kreatininu je Jaffého reakce s kyselinou pikrovou v alkalickém
prostředí. Tato reakce je nespecifická ovlivňují ji jak rychlé, tak pomalé chromogeny, zejména
glukóza, kyselina acetoctová a bilirubin. Ovlivnění se minimalizuje přesným dodržením reakčních
podmínek, tj. pH, teploty a času.
 Moderní metody jsou enzymové. Barevný test s ukončením modifikovanou Trinderovou reakcí
využívá enzymy kreatinázu, sarkozinoxidázu, katalázu a kreatininázu. Metoda s ukončením UV
testem při 340 nm využívá enzymy kreatininázu, kreatinkinázu, pyruvátkinázu a
laktátdehydrogenázu. Obě metody jsou dražší, ale specifické. Pro některé obory je enzymové
stanovení kreatininu povinné, např. pro využití výsledku při transplantacích.
 Stanovení kreatininu slouží zejména k ohodnocení funkce ledvin, zejména k odhadu hodnoty
glomerulární filtrace. To je možné z hodnoty kreatininémie s použitím vhodné rovnice, např. MDRD,
CKD-EPI nebo Lund-Malmö, existují i jiné rovnice. Další možností je zjištění clearance endogenního
kratininu, tj. objemu plazmy, který ledvina během jedné sekundy zbavila endogenně vytvořeného
kreatininu. Ke zjištění hodnoty clearance je zapotřebí vzorek moči, séra/plazmy, hodnota diurézy,
hmotnost a výška pacienta. Největší chyby při výpočtu vyplývají z nepřesných (mimolaboratorních)
údajů o době trvání sběru a ze sběru samotného.
 Pro zamezení těmto chybám se k odhadu glomerulární filtrace využívají i jiné látky, rutinně se např.
cystatin C, koncentrace v plazmě (séru).
8.7.3. Kyselina močová
 Kyselina močová je (u člověka) konečným produktem katabolismu purinových látek, tj. metabolismu
nukleových kyselin a nukleotidů. Vzniká z látek tělu vlastních i do organismu přivedených.
 Kyselina močová má ochrannou roli, působením volných radikálů se mění na alantoin (konečný
produkt katabolismu purinových látek u ostatních savců) a tím je eliminuje. Alantoin je u člověka
ukazatelem zátěže organismu volnými radikály.
 Moderní metody stanovení kyseliny močové jsou enzymové. Enzym ureáza katalyzuje oxidaci
kyseliny močové kyslíkem na peroxid vodíku a alantoin, peroxid se stanoví modifikovanou
Trinderovou reakcí. Metoda podle Katayamy s katalázou se nedoporučuje.
 Diagnosticky má význam zejména hyperurikémie, která může být způsobena zvýšenou produkcí
kyseliny močové, nebo snížením jejího vylučování ledvinami, případně oběma mechanismy. Vlastní
příčinou zvýšené produkce může být dědičná porucha (primární hyperurikémie), nebo jiná choroba
(sekundární hyperurikémie), případně léčba diuretiky nebo zvýšený tkáňový obrat.
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-23
 Dna je metabolické onemocnění, kdy došlo k přesáhnutí meze rozpustnosti urátu sodného, jehož
krystaly se ukládají v okolí kloubu a vyvíjí se zánětlivá reakce. Tyto krystaly mohou způsobit i
nefropatii, s možným selháním ledvin a smrtí jedince.
8.7.4. Amoniak
 Amoniak se uvolňuje v játrech z aminokyselin při metabolismu bílkovin a v proximálním tubulu
ledvin z glutaminu.
 Moderní metoda stanovení amoniaku je enzymová, s využitím enzymu glutamátdehydrogenázy (viz
stanovení močoviny).
 Preanalytická fáze je náročnější, vyžaduje se anaerobní odběr s okamžitým chlazením biologického
vzorku a následným bezprostředním zpracováním.
 Vyšetření je vyžadováno zejména u selhání jater.
8.7.5. Aminokyseliny
 Aminokyseliny jsou výchozí látky pro syntézu bílkovin tělu vlastních, mohou podléhat různým
přeměnám na biologicky významné sloučeni, mohou sloužit i jako zdroj energie pro organismus.
 Volné aminokyseliny se stanovují jako -aminodusík, spektrum aminokyselin, nebo se stanovují
konkrétní aminokyseliny.
 Alfa-aminodusík se stanovuje ninhydrinovou reakcí. Tato reakce bývá i na výstupu automatických
analyzátorů aminokyselin.
 Spektrum aminokyselin a jednotlivé aminokyseliny se stanovují chromatografickými a
elektroforetickými technikami.
 Na metabolismu aminokyselin se dobře demonstrují tzv. dědičné metabolické poruchy.
 Dědičné poruchy metabolismu aminokyselin se týkají jejich intermediárního metabolismu nebo
transportu (renálního tubulárního a střevního).
o Poruchy intermediárního metabolismu aminokyselin: fenylketonurie, alkaptonurie,
tyrozinémie (I a II), albinismus, homocystinurie
o Poruchy transportu aminokyselin: cystinurie, Hartnupova choroba
8.7.6. Dědičné metabolické poruchy
 Dědičné metabolické poruchy (DMP) jsou molekulární geneticky podmíněné choroby, které ovlivňují
metabolické dráhy v těle, protože, díky genetickému defektu, chybí v metabolické dráze určitá
klíčová součást. .Fyziologická funkce metabolické dráhy je tak narušena a vyústí v různé
patologické projevy dané choroby. Důsledkem genetického defektu je chybná tvorba příslušné
bílkoviny.
 Postižené bílkoviny mohou být enzymy, krevní bílkoviny, strukturní bílkoviny buněčné membrány,
receptor, regulační protein.
 Nejčastějším případem jsou enzymopatie, jejichž výsledkem je, že se netvoří produkt reakce
enzymem katalyzované, nebo se neodbourává příslušný substrát, nebo se substrát nemůže
přeměnit na produkt a odbourává se náhradní reakcí.
 DMP se mohou laboratorně diagnostikovat na úrovni nukleové kyseliny (moderní přístup), proteinu
nebo substrátu (původní postupy).
 Kongenitální (vrozená) choroba může být dědičná nebo získaná (v intrauterinním vývoji)
Klinická biochemie Kapitola 8. Dusíkaté látky nebílkovinné povahy
8-24
OBSAH:
Kapitola 8 Dusíkaté látky nebílkovinné povahy ............................................................................................. 8-1
8.1. Močovina ............................................................................................................................................ 8-1
8.1.1. Metody stanovení močoviny ....................................................................................................... 8-2
8.1.1.1. Neenzymové metody........................................................................................................... 8-2
8.1.1.2. Enzymové metody ............................................................................................................... 8-2
8.1.2. Klinické poznámky ...................................................................................................................... 8-3
8.2. Kreatin a kreatinin .............................................................................................................................. 8-4
8.2.1. Metody stanovení kreatininu .................................................................................................... 8-4
8.2.1.1. Reakce Jaffé........................................................................................................................ 8-4
8.2.1.2. Enzymové reakce ................................................................................................................ 8-7
UV test .............................................................................................................................................. 8-8
8.2.2. Klinické poznámky ...................................................................................................................... 8-8
8.2.3. Clearance endogenního kreatininu............................................................................................. 8-9
8.2.4. Klinické poznámky .................................................................................................................... 8-10
8.2.5. Odhad glomerulární filtrace z hodnot sérového kreatininu ...................................................... 8-11
8.3. Kyselina močová .............................................................................................................................. 8-12
8.3.1. Metody stanovení kyseliny močové ......................................................................................... 8-13
8.3.1.1. Redoxní neenzymové metody ........................................................................................... 8-13
8.3.1.2. Enzymové metody ............................................................................................................. 8-13
8.3.2. Klinické poznámky .................................................................................................................... 8-13
8.4. Některé další dusíkaté látky ............................................................................................................. 8-14
8.4.1. Amoniak .................................................................................................................................... 8-14
8.4.1.1. Metody stanovení amoniaku............................................................................................ 8-14
8.4.2. Aminokyseliny ........................................................................................................................... 8-15
8.4.2.1. Metody stanovení aminokyselin ...................................................................................... 8-16
8.5. Dědičné metabolické poruchy .......................................................................................................... 8-16
8.5.1. Principy laboratorní diagnostiky dědičných metabolických poruch........................................... 8-17
8.5.2. Poruchy metabolismu aminokyselin a jejich příčiny.................................................................. 8-18
8.6. Ostatní látky s nebílkovinným dusíkem............................................................................................ 8-21
8.7. Stručné shrnutí kapitoly.................................................................................................................... 8-22
8.7.1. Močovina................................................................................................................................... 8-22
8.7.2. Kreatinin.................................................................................................................................... 8-22
8.7.3. Kyselina močová....................................................................................................................... 8-22
8.7.4. Amoniak .................................................................................................................................... 8-23
8.7.5. Aminokyseliny ........................................................................................................................... 8-23
8.7.6. Dědičné metabolické poruchy................................................................................................... 8-23