v
Celed' Enterobacteriaceae
Enterobakterie náleží k velice často izolovaným bakteriím z klinického materiálu. Jsou to
Gramnegativní tyčinky obligátně patogenní, jiné jsou součástí normální flóry zažívacího
traktu, ale mimo zažívací trakt mohou být patogenní.
S enterobakter.emi se můžeme setkat při vyšetření stolice, močí, sputa, hnisu, likvoru, výtěrů
z ran, z pochvy. Mohou vyvolávat infekce postihující kterýkoli orgán.
Mikroskopie: mikroskopický průkaz má význam u těch druhů klinických materiálů, kde se
enterobekterie běžně nevyskytují ( likvor, krev, punktáty, hnis apod. ).Stolice se mikroskopicky
nevyšetřuje.
Kultivace: kolonie si jsou na krevním agaru velmi podobné. Bývají relativně velké ( až 5 i
více mm ), lehce vypouklé, hladké, lesklé. Část kmenů může vykazovat ~ hemolýzu. Pokud
kmen tvoří pouzdro, např. u klebsiell, mívá kolonie mukózní charakter. Kolnie většiny kmenů
rodu Proteus mají charakteristický plazivý růst ( Raussův fenomén ).
Pro kultivaci používáme krevní agar a selektivně diagnostické půdy, zejména Endova půda,
MacConkey agar, půdy l\1AL (maltóza, arabinóza, laktóza), XLD (xylóza, laktóza, deoxycholát
).
Identifikace: Enterobakterie mají velmi pestrou biochemickou aktivitu. Mezi základní biochem.aktivity
patři - schopnost fermentace glukózy
negativní oxidázová a většinou pozitivní katalázová reakce
schopnost redukovat nitráty na nitrity
Pro hrubé určení stačí Švejcarova izolační plotna .. Je použitelná pro identifikaci bakterií, které
neštěpí laktózu. U bakterií štěpících laktózu jsou kolonie červené na celé Endově půdě a nelze
hodnotit štěpení manitolu a sacharózy.
Pro podrobnější identifikaci je určen Enterotest Lachema.
II
Laboratorní diagnostika hemofilů
ROD HAEMOPHILUS
Jedná se drobné gramnegativní tyčinky s vysokými kultivačními nároky. U člověka působí
komplikace hlavně virových infekcí dýchacích cest, středního ucha a vedlejších dutin. Jsou
významným původcem meningitid.
Mikroskopie: drobné štíhlé, gramnegativní tyčinky, opouzdřené ineopouzdřené.
Kultivace: Hernofily jsou kultivačně velmi náročné. Vyžadují růstové faktory V ( nikotinamidadenindinukleotid
) a X ( hemin ), které jsou obsaženy v eytrocytech, ale hemofily je nedokáží
sami uvolnit. Kultivují se na čokoládovém nebo Levinthalově agaru, kde jsou růstové
faktory z erytrocytů uvolněny teplem. Aby půdy byly selektivní, přidává se bacitracin.
Čokoládový agar - šedé, průhledné kolonie
Levinthalův agar - průhledné lesklé kolonie.
V obou případech se půdy nechávají kultivovat 48 hodin za zvýšené tenze CO2.
Krevní agar - hemofily je možné kultivovat pouze s kmenem Staphylococcus aureus.
který svými hemolyziny uvolní z erytrocytů růstové faktory: Hemofily rostou v zóně hemolýzy
nebo v její těsné blízkosti, tomuto jevu se říká satelitový fenomén.
Identifikace: podle růstu na kultivačních půdách. Různé druhy hemofilů lze odlišit podle
nároků na růstové faktory. Používáme půdy, které neobsahují ani stopy růstových faktorů,
např. živný agar. Půdy se naočkují vyšetřovaným kmenem a na povrch se umístí tři pairové
disky. Jedenje nasycen X-faktorem, druhý V-faktorem, třetí směsí faktorů XrV. Pro kontrolu
se kmen naočkuje i na krevní agar k ověření, zda skutečně vykáže satelitový fenomén. Po
inkubaci se druhý den zjišťuje, kolem kterého z disků kmen vyrostl:
X+V H. influenzae
H.haemolyticus
~-r • V H.parainfluenzae
'i.~"I X H. ducreyi
, H.aphrophilus ( dovede syntetizovat hemin.takže nemá striktní
požadavky na růstové faktory )
Haemophilus inf1uenzae vyvolává různě závažné respirační infekce ( sinusitidy.otitidy ), u
dětí hnisavou konjuktivitidu, Z opouzdřených kmenů H.inf1uenzae se nejčastěji izolují serotypy
baf. U dětí do 5 let jsou nejčastějším původcem hnisavé meningitidy a epiglotitidy.
Haemophilus parainfluenzae se považuje za normální mikrot1óru horních cest dýchacích. Může
však vyvolat sinusitidu, bakteriémii, endokarditidu.
Haemophilus aphrophilus je normálním obyvatelem horních částí respiračního traktu.
Haemophilus ducreyi je původcem klasické pohlavně přenosné choroby, měkkého vředu (
ulcus molle ). Choroba se projevuje bolestivými vředy na sliznicích urogenitálu.
Nepřímý průkaz.metodou ELISA stanovení hladiny protilátek proti H.inf1uenzae typ b pro
- I I . (....' _....... I ť
,l'.I.k.~,\f~,N, rl'..",TlU)I/v..ov:i;: ())!UV,~pl Pc ,,'í?'/(OVAftN. 1/,(; ).J: ,.' i', :
;',~!/:/i" r • l,,·t ll',it' ,<o/'Ii.,,; ',/ ~;, '" "~")I pAF.,..-\.t' b -:'>;'f c: ·,F· ; •. 1·' Pí ,.
J ~~,i~, r ;i-):,.";. l{J,.! ~Pflff."!::,, VJTfJ,";':"- "j//" 4
. ,I" I I _. ! .
1/0,«(",'<- i., I' ~l)!f'I' J, !lr!1 Vlij. s ~:-;''f ~I)
I
Jr· I.') II
Zpracování hemoku!tur
Sepse je klinický stav těžké infekce spojený s výskytem bakterií v krvi. Pro vznik sepsí
má velký význam iinfekce pooperačních ran, vliv poškození tkáně permanentními katetry,
popáleniny a infekce podkožních tkáni. Sepse se stávají komplikaci základního onemocnění,
které snížilo celkovou rezistenci organismu (např. tumory, diabetes ..).
K bakteriémii dochází v důsledku vytvoření ložiska, ze kterého se občas nebo stále vyplavují
bakterie do krve. V případě sepsí vyvolaných grampozitvnimt bakteriemi je vstupní
branou kůže nebo sliznice. U sepsí vyvolaných gramnegativními bakteriemi je ložisko
nejčastěji v močovém nebo dýchacím traktu .Gramnegativní bakterie se často usazují na
stěnách kanyl, zavedených do žil.
Nejlepší výsledky dávají odběry provedené před nasazením antibiotik. l.vzorek je třeba
odebírat na začátku teploty či třesavky a pokud teplota stoupá pravidelně v určitou denní
dobu, pak asi 1hod. před tímto vzestupem Další vzorky se odebírají podle teplotní křivky.
Kultivace
Kultivaci provádíme v automatickém analyzátoru. Do specielních Iahviček pro aerobní
nebo anaerobní bakterie naočkují přímo na oddělení injekční stříkačkou asepticky asi 5 ml
krve. Lahvičky se umístí do termostatové skříně analyzátoru. Teplota kultivace se pohybuje
mezi 35 - 37°C a délka kulti~f:~peby měla činit ~dnů. Při růstu bakterií vzniká CO2,
jehož působením zežloutne terčík-na°dnč-Iahviček.Tento proces je každých 10 minut monitorován
a vyhodnocován. Pozitivní vzorek je signalizován světelně, zvukově, písemně.
Z pozitivní hemokultury se připraví nátěr a obarví dle Grama. Na základě mikroskopického
nálezu se očkují vhodné pevné půdy a .zakládají orientační diskové citlivosti na
vhodná antibiotika
Etiologické agens infekce představují z běžně izolovaných mikrobů Staphylococcus aureus,
Fscherichia coli.Pseudomnnas aeruginosa, enterokoky a Candida alhicans,
34
Laboratorní diagnostika anaerobních bakterií
Zpracování hnisu
Nejběžnějšim vzorkem odebíraným u hnisavých infekci je stěr z rány či abscesu na tamponu.
Stěr z rány musí být zanořen do transportní půdy, jinak během dopravy do laboratoře materiál
na tamponu vysychá a hynou v něm anaeroby.
Při odběru materiálu z hnisavého ložiska je nejlepší odebrat injekční stříkačkou hnis jako
tekutinu, nechat nasazenou jehlu a tu zahodnout do sterilní gumové zátky. Stříkačku s hnisem
zaslat do laboratoře.
Z hnisu se připraví mikroskopický preparát, který se obarví dle Grama.Očkuje se na krevní
agar se stafylokokovou čárou, selektivně diagnostickou půdu na enterobakterie (raději půdu
Mac Conkeyho než Endovu kvůli potlačení plazivého rostu protea ) a selektivní půdu pro sta
fylokoky ( např. krevní agar s 10% NaCI ).Na pomnoženi se očkuje do tekutého aerobního
buj6nu. Rozhodně je však třeba hnis kultivovat i anaerobně, a to na krevním agaru obohaceném
suplementy pro růst anaerobů ( lze na něm odstínit gramnegativní flóru
např.amikacinovými disky) a v kvalitním bujonu pro anaeroby ( např. VL bujon ).
Anaerobní kultivace
Anaerobní bakterie nemají enzym peroxidázy, který by je chránil před toxickými sloučeninami
kyslíku. Proto je musíme kultivovat v atmosféře bez kyslíku nebo v médiich obsahujicích
redukující sloučeniny.
Oxidoredukční potenciál ( Eh )je napětí vyjádřené v mV, které vzniká jako výsledek nerovnováhy
mezi oxidačními a redukčními produkty v médiu. Měří se rnilivoltmetrem nebo podle
barevných indikátorů.
Masopeptonový bujón má Eh asi +300m V, zatímco anaerobní bakterie začínají růst při hodnotách
-100m V.
Půdy pro anaerobní bakterie obasahují redukující látky ( cystein.glukózu ... ). Půdy se před
pužitím musí regenerovat. Tekuté půdy povařením, aby se vypudil kyslík, tuhé půdy vložením
do anaerostatu. Půdy bývaji ve vysokých sloupcfch nebo vrstvách.
Anaerobní prostředí pro růst bakterií je možno dosáhnout:
zabráněním vniknutí kyslíku do média
nahrazením kysliku v atmosféře jiným plynem
vyvázáním kyslíku chemickými nebo biologickými reakcemi
Přístupu kyslíku zabráníme již při odběru materiálu, kdy vzorek k vyšetření zašleme přímo
v injekční stříkačce, z níž byl vytlačen vzduch ajejfžjehlaje zabodnuta v gumové zátce. Tekuté
půdy převrstvujeme malým množstvím sterilního parafinového oleje. Půdy pro kultivaci
anaerobních bakterii obsahuji redukční činidla. která snižují redox potenciál. I
Nahradit vzduch můžeme některým jiným plynem. Ideální je směs -{,do ~l-410~IoHl oJ l~fj~•.Nz
Používá se ve zvlášť konstruovaných tennostatech, ve kterých rostou bakterie v .ideálníanaerobní
atmosféře. .
16
Kultivace za anaerobních podmínek dnes snadno dosahujeme v tzv. anaerostatech. Anaerostatje
válcovitá nádoba s víkem, do které vložíme až 12 Petriho misek; sáček s vhodnými
chemikáliemi ( směs hořčíku, kyseliny vinné a uhličitanu sodného) a katalyzátor. Do sáčku
přidáme vodu. Chemickou reakcí vzniká vodík a CO2. Vodík se za přítomnosti katalyzátoru
sloučí s kyslíkem za vzniku vody. Katalyzátor obsahující paladium ukládáme v podobě kovového
polštářku pod víko anaerostatu.
Novější soupravy nepotřebují vodu, katalyzátor je již obsažen v sáčku. Další průběh reakce je
shodný. Jsou vyráběny také soupravy, kde vkládáme jen jednotlivé Petriho misly do sáčku
z plastu a přidáme menší množství uvedených chemikálií.
Zpracování hnisu
Odběr materiálu
Nejběžnějším vzorkem odebíraným u hnisavých infekcí je stěr z rány na odběrovém
tamp6nu. Stěr z rány musi být zanořen do transportni půdy, jinak během dopravy do laboratoře
materiál na tamp6nu vysychá a hynou v něm anaeroby. Stěr zaslaný v transportni
půdě se nehodí k přípravě mikroskopického preparátu.Doporučuje se zaslat stěry dva, jeden
v transp.půdě ke kultivaci, druhý na suchém tampónu k přípravě mikroskop.preparátu.
Při odběru materiálu z hnisavého ložiska je třeba odebrat injekční stříkačkou hnís jako
tekutinu. nechat ve stříkačce s nasazenou jehlou, tu zabodnout do sterilní gumové zátky a
stříkačku s hnisem zaslat do laboratoře.
Mikroskopie
Preparát se barví podle Grama
Kultivace
Očkujeme na krevni agar se stafylokokovou čárou. selektivně diagnostickou půdu na
enterobakterie (raději půdu MacCobkeyho než Endovu kvůli potlačení plazivého růstu
protea) a selektivní půdu pro stafylokoky (KA + 10% NaCI) na pomnožení bakterii očkujeme
do tekutého aerobního bujónu. Rozhodně je třeba hnis vždy kultivovat i anaerobně
a to na krevním aga obohaceném suplementy pro růst anaerobů (lze na něm odstínit
gramnegativní flóru např.amikacinovými disky) a v kvalitním buj6nu pro anaeroby.
Příčinou infekcí ran bývá především Staphylococcus aureus, beta-hemolytické streptokoky,
c1ostridia. Popáleniny často infikuje Pseudomonas aeruginosa.
Lab.diagnosti a TBC,zpracování sputa na BK
Rod Mvcobocterium zahrnuje acidorezistentní tyčinky často vyžadující dlouhodobou
kultivaci. Nejdůležitější pro člověka jsou tuberkulózní mykobakteria Mycobacterium
tuberculosis ( bacil Kochův, BK ) a M.bovis a původce malomocenství M./eprae.
Odběr materiálu
TBC je tzv. specifická infekce, která může postihnout prakticky kterýkoli orgán. U
nejčastější formy plicní odebíráme sputum nebo laryngeální výtěr. Dále odebíráme
různý materiál podle lokalizace infekce, např. moč, punktáty, likvor.
Mikroskopie
Mykobakteria se pro přítomnost velkého množství lipidů ve své stěně nebarví podle
Grama. Klasickou technikou barvení na acidorezistentní tyčinky je barvení dle Ziehla-
Neelsena.
Postup barvení:
1. Příprava fixovaného preparátu
2. Barvení koncentrovaným karbolfuchsinem. Sklíčko s preparátem se přeleje
karbolfuchsinem a plamenem kahanu se zahřeje 3x do výstupu par. Nesmí
vařit+'Barví se 3-5 minut.
3. Odbarvování kyselým alkoholem ( alkohol s kys.sírovou nebo chlorovodíkovou)
Sklíčko se drží v ruce šikmo a přelévá se kys.alkoholem. Po odbarvení se preparát
opláchne vodou.
4. Kontrastní barvení. Preparát se barví metylenovou modří nebo malachitovou zelení
asi 30 s.
5. Opláchnutí vodou a osušení preparátu.
Po obarveni jsou acidorezistentní mikroby a útvary červené. Pozadí je modré nebo
zelené ( podle použitého barviva ).
Kultivace
Vzorky normálně sterilní (likvor, biopsie ) lze kultivovat rovnou. Většina vzorků (
např sputum ) obsahuje tzv. nespecifickou mikroflóru: rozmanité druhy jiných
mikrobů, které by mykobakteria rychle přerostly a půdu znehodnotily. Tyto vzorky
musíme ostatních mikrobů zbavit. Tento dekontaminační postup se nazývá moienl
Korku. Pomořený vzorek se zkoncentruje centrifugací a teprve pak se vyšetřuje
mikroskopicky a kultivačně.
Vyšetřovaný materiál hornogenizujeme a přelejeme zředěnou Hana 30 minut. Během
této doby usmrtíme včechny ostatní bakterie, zatímco mykobakteria, která jsou acidoalkalirezistentní,
přežijí. Po neutralizaci NaOH očkujeme na speciální živné půdy.
Kultivujeme současně na 3 - 4 tekutých i pevných půdách. Půda LowensteinJensenova
a Ogawova jsou tuhé, zeleně-žluté vaječné půdy, nalévané do zkumavek jako
šikmý agar a uzavřené gumovými zátkami, aby během dlouhé kultivace nevyschly .
••
Mykobakteria na nich vyrůstají v koloniích připomínajících malé růžice květáku. Půdy
Šulova a Baničovajsou tekuté nažloutlé půdy, kde mykobakteria rostou v zrnitém
sedimentu. Půdy se odečítají za 1,3,6, a 9 týdnů kultivace při 37°C.
Pokus na zvířeti
Je indikován zejména tam, kde se jedná o materiál vzácný a neopakovatelný, jako je
likvor, hnis nebo bioptické vzorky a o němž se předpokládá, že obsahuje málo
Kochových bacilů.
Vzorek se očkuje morčeti pod kůži obou zadních končetin na vnitřní straně stehna pod
třísly. Přibližně za 14 dnů se v místech vpichu může vyvinout vřed a asi po 2 měsících
zvíře hyne. Při pitvě nalézáme ložiska ve slezině a játrech a někdy i v plicích.
Novější (rychlé) postupy v diagnostice mykobakterií
Dlouhé trvání klasické kultivace na BK vede ke snahám dobu vyšetření co nejvíce
zkrátit. Byl vyvinut systém, který v poloautomatickém přístroji dovoluje detekovat
pomnožená mykobakteria na základě uvolňovaného radioaktivního CO2 do 14 dnů; .
často i mnohem dříve.
Vysoce citlivé, a proto využitelné k průkazu genomu mykobakterií přímo v klinickém
materiálu, jsou metody využívající amplifikace nukleových kyselin -polymerázová
řetězová reakce (peR).
epřímý průkaz tuberkulózy
Průkaz pozdní přecitlivělosti tuberkulinovým kožním testem se užívá před očkováním
proti tuberkulóze ( kalmetizací ) jako test dle Mantoux. Tuberkulin se v malém
množství vstříkne intradermálně. Jedinci, kteří se s infekcí setkali, zůstávají léta
přecitlivělí a v místě podání se u nich vyvine zánětlivá reakce. Očkuji se pouze ti, kteří
zůstali tuberkulinnegativní. Při pozitivním testu se od očkování musí upustit pro
možnost zvýšené reakce po podání BCG-vakcíny.
Lab.diagnostika TBC,zpracování sputa na BK
Rod Mycobacterium zahrnuje acidorezistentní tyčinky často vyžadující dlouhodobou
kultivaci. Nejdůležitější pro člověka jsou tuberkulózní mykobakteria Mycobacterium
tuberculosis ( bacil Kochův, BK ) a M.bovis a původce malomocenství M.leprae.
Odběr materiálu
TBC je tzv. specifická infekce, která může postihnout prakticky kterýkoli orgán. U
nejčastější formy plicní odebíráme sputum nebo laryngeální výtěr. Dále odebíráme
různý materiál podle lokalizace infekce, např. moč, punktáty, likvor.
~
Mikroskopie
Mykobakteria se pro přítomnost velkého množství lipidů ve své stěně nebarví podle
Grama. Klasickou technikou barvení na acidorezistentní tyčinky je barvení dle Ziehla-
Neelsena.
Postup barvení:
1. Příprava fixovaného preparátu
2. Barvení koncentrovaným karbolfuchsinem. Sklíčko s preparátem se přeleje
karbolfuchsinem a plamenem kahanu se zahřeje 3x do výstupu par. Nesmí
vařit! !Barví se 3-5 minut.
3. Odbarvování kyselým alkoholem (alkohol s kys.sírovou nebo chlorovodíkovou)
Sklíčko se drží v ruce šikmo a přelévá se kys.alkoholem. Po odbarvení se preparát
opláchne vodou.
4. Kontrastní barvení. Preparát se barví metylenovou modří nebo malachitovou zelení
asi 30 s.
5. Opláchnutí vodou a osušení preparátu.
Po obarvení jsou acidorezistentní mikroby a útvary červené. Pozadí je modré nebo
zelené ( podle použitého barviva ).
Kultivace
Vzorky normálně sterilní (likvor, biopsie ) lze kultivovat rovnou. Většina vzorků (
např. sputum ) obsahuje tzv. nespecifickou mikroflóru: rozmanité druhy jiných
mikrobů, které by mykobakteria rychle přerostly a půdu znehodnotily. Tyto vzorky
musíme ostatních mikrobů zbavit. Tento dekontaminační postup se nazývá maření
vzorku. Pomořený vzorek se zkoncentruje centrifugací a teprve pak se vyšetřuje
mikroskopicky a kultivačně.
Vyšetřovaný materiál homogenizujeme a přelejeme zředěnou Het na 30 minut. Během
této doby usmrtíme včechny ostatní bakterie, zatímco mykobakteria, která jsou acidoalkalirezistentní,
přežijí. Po neutralizaci NaOH očkujeme na speciální živné půdy.
Kultivujeme současně na 3 - 4 tekutých i pevných půdách. Půda LowensteinJensenova
a Ogawovajsou tuhé, zeleně-žluté vaječné půdy, nalévané do zkumavek jako
šikmý agar a uzavřené gumovými zátkami, aby během dlouhé kultivace nevyschly .
..
Barvení dle ZlEHLA NEELSENA:
druhé nejrozšíi'enějši barvení
:~oužíváme k průkazu acidorezistentních mikrobů (TBC) o
dCldoreslstence Je vlastnost především m koba t o, v , o
spor a některých kvasinek, y c ern, nekterych aktmomycet, bakteriálních
Tvto mikroorg. přij ímají barvivo velmi špatně, ale přijaté barvivo si zachovávají i při
odbarvováni kyselinami, alkoholem ajinými odbarvujícímiprostředky
pii tomto barvení se používají koncentrované barvící barviva, kterými se barví za tepla
odbarvujerne pomocí kyselého alkoholu nebo kyselinou sírovou a pozadí dobarvujeme
pomocí kontrastního barviva
acidorezistentni bakterie se karbolfuksinem barví do růžova a kontrastují s modrým
nebo zeleným pozadím, které tvoří bb. elementy a neacidorezistentní bakterie
prohližirne 50 zorných polí meandrovitě
postup:
1 preparát přelejeme koncentrovaným karbolfuksinem a ze spodu zahříváme až do výstupu
par. opakujeme 3x 3 - 5 min.
oplach vodou
2 odbarvujcme kyselinou sírovou a nebo kyselým alkoholem dokud odchází barva
oplach vodou
') dobarvujernc roztokem metylenové modře nebo malachitové zeleně 10 - 30 sekund
oplach vodou + osušení
Pozorujeme imerzí, vyšetřujeme 50 zorných polí v pěti rtlzných místech preparátu.
Acidorezistentní tyčinky jsou růžové, pozadí preparátu (v případě barvení sputa tvoří
pozadí preparétu leukocyty, epitelie, mikroby jiné než acidorezistentnf a hlen)
modré nebo zelené.
Laboratorní diagnostika kvasinek a plísní
Vyšetřovací metody v lékařské mykologii se odlišují od metod používaných v bakteriologii.
Princip mykologické diagnostiky je stejný: přímý, nepřímý.
Za infekčníagens považujeme takové kmeny mikromycet, které byly u pacienta izolovány
opakovaně.
ODBĚR A ZPRACOVÁNÍ MATERIÁLU
Do mykologické laboratoře jsou zasílány nejrůznější materiály - výtěry na tamponech,
sputum krev, hnis, punktáty (při podezření na systémové mykózy ), šupiny kůže či nehtů,
vlasy a chlupy ( při podezření na povrchové mykózy ).
Kožní šupiny
Materiál je odebírán výhradně z okrajové části ložiska, nikoli z jeho středu. V oblasti
přechodu zdravé a postižené tkáně je životaschopnost původce největší. Místo odběru
dekontaminujeme 70% alkoholem. Odběr provádíme seškrabáním jemných šupinek kůže
sterilním skalpelem nebo eventuelně tamponem navlhčeným ve fyz. roztoku.
Vlasy a chlupy
Nutné vytáhnout i s kořenovými váčky a vložit do sterilní zkumavky.
Nehty
Odběr provádíme po odstranění povrchových částí ( bývají kontaminovány). Po desinfekci
alkoholem seškrábneme drobné částečky do sterilní zkumavky.
Při zasílání materiálu na původce povrchových mykóz nejsou nutná žádná zvláštní opatření
( původci jsou schopni v šupinách přežít řadu dní ).
Při zasílání materiálu na původce systémových mykóz platí stejné zásady jako u bakteriolog.
vyšetření. Je nutné při odběru zhotovit 2 nátěry (Gram, mykologické či histologické barvení).
PŘÍMÝ PRŮKAZ PŮVODCŮ MYKOTICKÝCH ONEMOCNĚNÍ
Mikroskopické vyšetření
Mikroskopie má v lékařské mykologii velký význam. Umožňuje v krátké době po dodání
materiálu do laboratoře rozlišit, zda se jedná o mykózu, případně, ze které skupiny
mikromyccr původce pochází.
Louhové preparáty
Částečky šupin kůže či nehtů, vlasy, chlupy, umístěné na podložním skle zakápneme 10-40°;;)
KOH. Preparát přikryjeme krycím sklíčkem a necháme působit 30-60 min. Tato doba je
dostačující na projasnění preparátu, které umožní rozeznání mykotických elementů,
Preparáty s inkoustem Parker
Stejný princip jako u louhových preparátů, lnkoustové barvivo ( 20% KOH + 10%inkoustu
Parker) výrazně probarvuje mykotické elementy, nikoli ostatní materiál. Výsledkem je
podstatně snažší a přesnější odlišení probarvených mykotických struktur.
Preparáty s Lugolovým roztokem
Připravují se 7, tekutých materiálů ( sputa, punktáty, likvor) jejich smícháním s Lugolovým
roztokem " poměru 1: I na podložním skle. Po překrytí krycím sklíčkem odečítáme. Vhodné LI
předpokládané přítomnosti rychle rostoucích vláknitých hub ( aspergily, penicilia ).
IDENTIFIKACE KV ASINKOVÝCH MIKROMYCET
Spektrum druhů kvasinek, které mohou způsobit infekce se rozšiřuje. V současné době je
prokázáno~ejméně 16 zástupců rodu Candida , ale i některé druhy z rodů Cryptococcus,
Rhodotorula, Sacharomyces, Trichosporon ...
Jednoznační původci onemocnění: Candida albicans, C. crusei, C. tropicalis, C
pseudotropicalis, Trichosporon beigelii, T. capitatum.
Mikroskopie
U preparátu barveného dle Grama nalézáme G+ oválné nebo kulaté buňky, často pučící a
tvořící pseudomycelia.
Kultivace kvasinek
Je možná na běžných půdách - KA, Sabouraudův agar. Kvasinky tvoří většinou lesklé,
vypouklé kolonie bělavé až smetanové barvy. Některé kmeny produkují růžové až červené
pigmenty.
Druhová identifikace izolovaných kvasinek není snadná. Rozdíly v biochemických testech
jsou někdy poměrně jemné. Při určování izolovaného kmene kvasinkovité houby bývá
odlišení nejfrekventovanějšího druhu Candida albicans. Kmeny tvoří více než 80% všech
nátěrů kvasinek v klinickém materiálu.
K rozlišení C. albicans používáme Candiselect, Chromagar.
Klasickou metodou odlišení C. albicans se tzv. germ-tube test (test tvorby klíčních vaků či
zárodečných klíčků). Test provádíme na agarové půdě obsahující Tween 80, tence nalité na
podložním skle nebo Petrino misce. Zkoumané kmeny se naočkují čarou a přikryjí krycím
sklem. Po 3 - 4 hodinách inkubace při 37°C se naočkované čáry prohlíží objektivem bez
imerze. Kmeny C. albicans tvoří zárodečné klíčky vyrůstající z kvasinkových buněk.
Další možností je kultivace kmene na kukuřičném nebo rýžovém agaru s Tweenem 80
3 dny při 28 - 30°C, kde C. albicans opět tvoří zárodečné klíčky.
Ostatní kandidy na půdě s Tweedem 80 zárodečné klíčky netvoří a dourčují se podle
biochemické aktivity.
Auxanogram: testování asimilace - využití dusíkatých látek k růstu jako zdrojů uhlíku.
Zymogram: testování štěpení cukrů.
V současné době lze využít i identifikační systémy užívaných k druhovému určování
kvasinkových mikromycet - API 20 C, Auxacolor.
NEPŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROMYCET
Nejčastěji užívanými reakcemi bývají: aglutinace, vazba komplementu,
dvojitá imunodifuse, imunoelektroforéza a ELISA.
Lab.diagnostika kvasinek a plísní
Odběr. ' ·-,jálu
Do myx , rogické laboratoře bývají zasílány nejrůznější materiály - výtěry na
tarnpónech, sputum, krev, hnis, punktáty (při podezření na systémové mykózy ) nebo
též šupiny kůže či nehtů, vlasy a chlupy ( při podezření na přítomnost původců
povrchových mykóz )
Vlikroskopie
Má v lékařské mykologii velký význam, neboť umožňuje v krátké době po dodání
materiálu do laboratoře rozlišit, zda se jedná o mykózu. Nejčastěji se používají
následuj ící druhy preparátů.
Louhové preparáty připravíme tak, že částečky šupin na podložním skle zakápneme 10 -
40 % KOH. Preparát přikryjeme krycím sklíčkem a necháme působit 30 - 60 minut.
Tato doba je dostačující k dokonalému projasnění preparátu, které umožní rozeznat
mvkotické elementy v preparátu.
Preparáty s Inkoustem Parker. Výhodou je snažší a rychlejší odlišení modře zbarvených
mykotickych elementů.
•
Kultivace
Materiál zaslaný na mykologické vyšetření očkujeme převážně na tuhé půdy, šikmo
nahté \'C zkumavkách. Univerzální půdou je Sabouraudův agar s 2% glukózy a
antibionky
Doporučuje se každý vzorek materiálu očkovat nejméně do 2 zkumavek a mkubovat při
28 - 30" C Délka kultivace závisí na druhu mikromycety. Kvasinky a pravé plísně
rostou obvvkle ? - 5 dnů, dermatofyty vyrůstají do 4 týdnů.
Rod Candida
Diagnostika kvasinkových infekcí je poměrně snadná, protože je lze kultivovat i na
běžných půdách.
Mikroskopie
Odečítáme z preparátu barveného podle Grama, kde nalézáme oválné nebo kulaté G-;
buňky, často pučící a tvořící pseudomycelia.
Kultivace
Je možná na běžných půdách. Zcela postačuje krevní a Sabouraudův agar, na nichž
kandidy tvoří většinou lesklé, vypouklé kolonie bělavé až smetanové barvy Některé
druhy produkují růžové nebo červené pigmenty.
Identifikace
Klasickou metodou odlišení Calbicans je test tvorby zárodečnych klíčku.
Na pudu s Tweenem očkujeme čarou test. Kmen, přikryjeme krycím sklíčkem a
lnkllrLiI,~mť !jh teplotě 37°C Za 3-18 hod. vytvoří většina kmenů C.albicans zárodečné
kl ičk~. ktere lze pozorovat při zvětšení bez imerze. Ostatní kandidy na půdě s Tweenern
80 zárodečné klíčky nevytvářejí a lze je dourčit podle jejich biochemické aktivity
V současné době je k dispozici několik identifikačních systémů užívaných k druhovému
určení kvasinkových mikromycet, např. Auxacolor firmy Sanofi-Pasteur.
k )/F,i;(l~i:.},}(/;·?fl l/'vAv~;/J/~1it/k ítv1{r / (~If/~[jAAI()',M. v
R ť?ffA./;J()/r-. (l.!;.(')/V·' .';/'1),"/). :
I ~'\ /fff) '!'JI.~ f .' ~ .' "./ - 'I, " • r , oJ.!
k' .: k,;/-j tnJ'it: r ,K,F/}a./rfl-! IP'. H(:)f)U~/~lJ~1f/ !J.{))()iJ; /~Wý ,
Zpra ování vzorků na izolaci viru
V diagnostice virů rozeznáváme průkaz přlmý, kam patří izolace viru nebo průkaz
jeho antigenů ve vyšetřovaném vzorku, a průkaz nepřlmý, serologický, čili průkaz
tvorby protilátek.
Odběr krve na virologickou serologii
K nepřímému průkazu se odebírá asepticky asi 7 ml krve do zkumavky. U dětí 2 - 3
ml. Ke zkumavce se přikládá řádně vyplněná žádanka, z níž musí být patrné, jaké
vyšetření se požaduje a příznaky, které k požadavku vedou.
Za 10 - 14 dnů po prvním vzorku se odebírá další vzorek a zřetelně se označí jako
druhý. Někdy je výhodné po domluvě s laboratoří za dalších 14 dnů poslat vzorek třeti.
Odběr materiálu k přímému průkazu viru
Vzorky určené k přímému průkazu odebíráme:
./ Jen ve skutečně indikovaných případech. Vyplatí se předem se poradit s laboratoři
./ Ve vhodnou dobu. Naději na úspěch má odběr v prvních dnech příznaků, čím dříve,
tím lépe .
./ Z vhodného místa, kde předpokládáme přítomnost největšího množství viru .
./ Asepticky a za použití vhodných odběrových pomůcek. Pokud možno se vyhýbáme
použití dezinfekčních prostředků, aby jejich stopy nemohly virus inaktivovat.
Přehled vzorků k virologickému vyšetření
./ Výtěry
./ Výplach z nosohltanu
v/ Výplach z nosu
,; Stolice
./ Likvor
,,/ Tekutina z puchýřků
Zasílání materiálu určeného k izolaci viru
Úspěch izolačního pokusu nezávisí jen na správném odběru, ale i na správném
transportu vzorku do laboratoře.
První zásadou při transportu materiálu k izolaci viru je dopravit jej do laboratoře co
nejrychleji.
Druhou zásadou je omezit inaktivaci virů snížením teploty. Ideální by bylo ihned po
odběru vzorek zmrazit a udržet jej zmrazeny až do okamžiku jeho úpravy k očkování.
Hodnocení výsledků virologického vyšetření
Hodnocení serologických nálezů
Nález protilátek svědčí pouze o tom, že se nemocný během svého života s příslušným
virem již setkal. Kdy k setkání došlo, zda na začátku choroby nebo dříve, nám poví
sledování charakteru protilátek a dynamiky jejich titru.
O protilátkách IgM se domníváme, že se tvoří obvykle na začátku styku s antigenem
Jejich nález tedy většinou svědčí pro nedávnou nebo právě probíhající infekci.
---- --
Protilátky IgG se tvoří na začátku imunitní reakce.
Ke sledování dynamiky titru je třeba vyšetřit paralelně dva vzorky séra. Pro diagnózu
nedávno proběhlé virové infekce svědčí negativní nález protilátek v prvním vzorku a
pozitivnít ém nebo nejméně 4x vyšší titr protilátek ve druhém vzorku.
Hodnocení výsledku přímého průkazu viru
Výsledky přímého průkazu viru by měly být doplněny alespoň serologií.
Izolace viru z orgánů za normálních podmínek sterilních svědčí pro etiologickou
souvislost mezi izolovaným virem a vyšetřovaným onemocněním ( např.infekce CNS izolace
viru klíšť.encefalitidy ).
TKÁŇOVÉ (BUNĚČNÉ) KULTURY
Slouží k pěstování většiny virů. Označujeme tak buňky, tkáně a orgány pěstované in vitro a
postupy umožňuj ící toto pěstování. V rutinních laboratoří používáme jen buněčných kultur i
když přetrvá- á název kultur tkáňových.
V laboratořích elmi přísná kontrola pro mytí skla. Technika, kterou se sklo myje je jiná
než pro ostatm laboratoře. K vlastní kultivaci používáme silnostěné krátké zkumavky a Rouxláhve
( rú ) ploché s rovnými stěnami. Mohou být skleněné či umělohmotné najedno použití.
Živná média pro tkáňové kultury:
Živiny k růstu in vitro dodáváme v podobě tzv. médií pro tkáňové kultury. Jde o pufrované
solné roztoky obsahující glukózu, aminokyseliny, vitaminy, růstové faktory a indikátor pHťenolovou
červeň. Pro zamezení bakteriální kontaminace, přidáváme do médií antibiotika
( obvykle penicili a gentamicin ).
iejznámější médium je Parkerovo a Eaglovo minimální esenciální ( MEM ). Dodávají se
komerčně jako koncentráty.
K množení buněk je potřeba k médiu přidat 2-20% bovinního prekolostrálního séra. Takové
médium se nazývá růstové. Narostlé kultury pěstujeme v médiu udržovacím ( bez séra ).
Příprava tkáňových kultur:
Buňky smícháme s růstovým médiem, rozplníme do jednotlivých zkumavek a pořádně
uzavřou gumovými zátkami. Kultivují se při 35 - 37°C a pod úhlem 5° ( téměř leží ).
Buňky klesnou ke stěně, přichytí se na ni a pomalu se rozrůstají, až na skle vytvoří souvislý
povlak. zvaný monolayer =buněčný list.
Druhy buněk
P.-imární kultury:
Jde o buňky odebrané přímo z orgasnismu. Často se dají několikrát pasážovat = přenášet do
nových nádobek. a vznikají z ních kultury sekundární.
lejcastěji se používají buňky opičích ledvin. Ledviny se vyndají ze zvířete a rozstříhají na
kousíčky, Vystaví se účinkům trypsinu, který tkáň rozloží na jednotlivé buňky. Ty se poté
zasílají jednotlivým laboratořím.
Použití: izolace enterovirů - polioviry, echoviry, coxackieviry A9, B l-B6, parachřipka,
chřipka A,B, parotitis, HSV, vakcinie, RSV.
Buněčné linie:
Dají S~ pasážovat donekonečna. Mají změnněný počet chromosomů ( heteroploidní karyotyp )
a pocházejí ze tkání maligních i normálních.
Nejznárnějši jsou HeLa buňky, získané z karcinomu děložního čípku. Izolují se na nich
adenoviry, ale mohou na nich růst i některé enteroviry, HSV a vakcinie.
Další známe buňky jsou lidské Hep-2 a opičí Vero.
Diploidní kmeny:
Lze je udržovat po několik desítek pasáží. Mají přitom diploidní karyotyp normálních buněk.
ejběžněji užíváme buňky z lidských embryonálních plic ( LEP ).
Použití: izolace enterovirů, adenovirů, HSV, vakcinie, VZV, CMV.
Očkování tkáňových kultur:
Jakmile je vytvořen monolyaer, očkujeme viry nebo zkoumaným materiálem. Inokulum
nesmí obsahovat mikroby, proto se přidávají antibiotika (PNC + GEN ). Do každé zkumavky
očkujeme O.2ml tekutiny obsahující virus.
Denněse prohlíží při malém zvětšení v mikroskopu a sleduje se změna.
Při množení \ iru se buňky mění. Tomuto jevu se říká cytopatický efekt - CEP.
CEP HA V ( pu.omavirů ) - přítomnost drobných zakulacených buněk, silně světlolomných,
rychle hynoucích. Médium je alkalické - změna pH, barva médiaje fialová.
CEP adenovirů - vznik větších shlukujících se buněk, které médium okyselují - změna barvy
média na oranžovou.
CEP RSV - vytváření mnohojaderných útvarů.
Jakmile se objeví CEP, použijeme tekutinu z tkáňové kultury ka dalším pasážím a testům.
Zůstanou - li buňky nezměněny, pokusíme se o jednu až dvě pasáže slepé.
Určení zachyceného viru:
Řídíme se podle vzhledu CEP.
Hernadsorpce - jev podobný aglutinaci. Buňky, ve kterých se pomnoží hemadsorpční virus,
na svůj povrch nachytají suspenzi přidaných erytrocytů.
Např: virus chřipky, parachřipky, parotitis.
Interference - jev, kdy jeden virus brání množení viru druhého.
1MF- na podložní sklo kápneme suspenzi kultury s pomnoženým virem, necháme zaschnout
a po sfixování uděláme imunofluorescenci. Buňky, ve kterých se virus pomnožil,
\ mikroskopu fluoreskují. Např. HSVl,2 CMV.
LABORATORNÍ DG. INFEKCÍ ŽENSKÉHO GENlTÁLU
Vulva, pochva a dnoŽT1Í hrdlo zdravé ženy jsou osídleny tzv. normálni flárou. Složení nonnálni
flóry pro jednotlivé části těla je charakteristické. To platí i pro osídlení pochvy. Složení flóry je
dáno složením kožní mikroflóry, zaž. traktu a mikroby, které jsou vneseny zvenčí.
Děloha, vejcovody a vaječniky jsou sterilní.
Základem normální flóry poševní sliznice je Doderleinova flóra ( laktobacily ).
"LACTOBACOJ/llS = DODEH ..LAINUY BACIL
G+ tyčinka, netvoři spory
v pochvě má ochrannou funkci, chrání před množení jiných bakterií, chrání tím, že
vytváří kyselé prostředí ( nízké pH ) v pochvě a to tak, že štěpí cukry na kyseliny
vysoká odolnost proti kyselému prostředí
většinou nekultivujeme, růst aerobní nebo anaerobní podle druhu
častější vyšetření mikroskopické poševního sekretu - MOP
Ochranné mechanismy pochvy jsoi, v období plodnosti ženy = fertilní období, zde jsou tvořeny
hormony= estrogen, který z~<..;c~ 'je ukládání glykogenu v buňkách poševní sliznice. Ten je
mikroby ( laktobacily ) metabol.zo .án na kyselinu mléčnou ( pH nízké 3 - 3,5 ). Tvorbou
kyseliny mléčné a látek antibiotic cého charakteru tak ovlivňují laktobacily složení vaginální
mikroflóry fertilní ženy,
Kyselost poševního sekretu je do určité míry velkým ochranným mechanismem.
V sekretu zdravé fertilní ženy je přítomno až deset na devátou bakteriálních buněk v 1ml.
Nízké pH u" adherence mikrobů ovlivcuje, je horší
Vysoké DH - adherence je lepsi.
Pro diagnostiku infekcí ženského genitálu se odebírají materiály ze zadní klenby poševní, vytěr
z endoccrvixu a materiály odebrané během operací nebo během porodu. Běžně vyšetřovaným
-nateriáiern je plodová voda od, íraná v průběhu porodu nebo po artefi.ciá1ní dirupci plodových
blan
I ejčastěji bývá vyšetřován výt ": z pochvy. Velmi významnou součástí bakteriologického
vyšetření pochvy je MOP ( mil: 'cbní obraz poševní). Jedná se o nátěr poševního sekretu na
podložním skle. Nátěry se piipr : ují tiva. Jeden se barví podle Grama ( bakteriologické
vyšetřeni )a druhý podle Giems. ( průkaz Trichomonas vaginalis )
MOPL
pH pod 4 - 5
mikrobní obraz se pova ~'~za ncrmálni fyziologický obraz pochvy zdravé ženy. Sekret je
čirý, hlenovitý a může o _ -ahov •.rt bělavé vločky, V mikroskopu jsou vidět epitelie,
leukocyty nejsou přítor.r ,,Z b..kterií je možno nalézt pouze G+ tyčky ( laktobaci1y )
~IOr n.
p+l nad 4 ., 5
sekret je mléčně zkalený až nažloutlý. Mikroskopicky je možno nalézt epitelie, menší
množství leukocytů, různé bakterie a laktobacilů je méně. Jedná se o bakteriální výtok
nehnisavy
MOP III.
pH zásadite
výtok je hustý, bělavý až žlutavý. Epitellije málo, leukocyty jsou hojné. Laktobacily
obvykle chybí, zato jsou přítomny jiné bakterie. Bakteriálnt výtok hnisavý.
MOP IV.
obraz u kapavky. Výtok je hustý, žlutozelený. Hojně jsou zastoupeny leukocyty a
gramnegativní diplokoky. Obraz je závislý na tom, zda se jedná o kapavku akutní nebo
chronickou
MOPV.
trichomonádovy výtok je charakterizován řídkým, zpěněným sekretem. Trichomonády
jsou dobře zbarveny Giemsovým barvením, Jsou přítomny leukocyty a bakterie ( tyčky i
koky ).Dod. f1óraje potlačena
MOP Vl.
u vaginálnich mykóz může být obraz hnisavý i nehnisavý. Přítornny jsou leukocyty,
epitelie a různé bakterie. La.ktobacily mohou být nalezeny
kvasinkovy
Mikroskopické vyšetřeni i ostatních materiálů pocházejících z ženského genítálu ( plodová voda,
endocervikálni sekret) je důležitou složkou postupu.
Kultivačni vyšetřeni se provádí na běžných půdách za aerobních i anaerobních podmínek, a to na
KA ( 5% CO a staf. čára), ENDO, NaCI, bujón, u těhotných selektivní bujón pro streptokoky,
VLA. VLB. Chceme-li kultivovat náročnější mikroby jako jsou mykoplazmata a Gardnerella
vagínalisje nezbytné použít speciální půdy.
K záchytu - GO - neselektivní čokoládový agar OC a Č3
- Gard. vaginalis - gardnerelový agar
- mykoplazmat a ureoplazrnat - bujón
Za nejvyzmamnějši původce vybraných infekcí ženského genitálu jsou považovány:
VAGINITIDA:
Staphylococcus aureus, streptokoky skupin A, B, a D, Candida albicans, Neisseria
gonorrhoae, Trichomonas vaginalis, Listeria monocytogenes
ENDOMETRITIOA
streptokoky, enterobakterie, STAU, Bacteroides fragilis, Campylobacter fetus, G.
vaginalis, chlamydie, mykopla.zmata
POPORODNí a POOPERAČNÍ INFEKCE
streptokoky, STAU, enterobakterie, Bacteroides fragilis
Sy~ DROM TOXICKÉHO ŠOKU
---_._Barvení
dle GIEMSY ( GIEMSY - ROMANOWSKÉHO )
Používá se při barvení krevních nátěrů, k důkazu prvoků, rickettsií, chlamydií, spirochét,
mykop lazmat ...
-nefixovaný bakteriální nátěr a zaschlá krev v podobě tlusté kapky se pokape koncentrovaným
Giemsovým barvivem 1 - 2 min.
- přidá se asi lOnásobný objem destilované vody a opatrně smíchá s barvivem 2 - 5 min.
- opatrně opláchneme vodou a nechá se uschnout
Výsledek:
bakterie - tmavě modré
pozdra - světle modré
slizová vrstva - růžová
Tlustá kapka se barví Giemsovýrn roztokem 30-60minut.
Ostatní preparáty ( MOP) se fixují 2 min. methanolem a barví čerstvým Giemsou (1: lOs destil.
vodou) 30min. - 3hod. u spirochet i přes noc.
Výsledek: jádra parazitů - karmínová jejich cytoplasma - bleděmodrá
jádra leukocytů - fialová cytoplasma - nafialovělá
Trichomonóza
Trichomonas vagin alis (bičenka jJo.Š:e\'fIí) je bičíkovec u nás hojně rozšířeny Přenáší se
pohlavnim stykem, klinicky se projevi onemocněnimnohem častěji u žen než u mužů, kteři JSou
.obvykle bezpřiznakovi přenašeči
.l! žen odebíráme výtěr z pochvy nebo z uretry, u mužů výtěr z uretry nebo exprimát
z prostaty Trichomonády jsou viditelné v nativním preparátu i bez barvení, výhodná je fázově
kontrastní mikroskcpie, kde lze ozorovat živé, pohyblivé prvoky. Zasíláme-li materiál do laboratoře,
děláme nátěr na 2 podložni skla (ledl1Q. pak v laboratoři barvíme podle Giernsy, kde hl.9dáme
trichornonady. druhé barvíme podle Grama pro průkaz bakterií a kvasinek) _TrichQll1.Q!lády lze
také kultivovat \ e speciálním Diamondově médiu K dispozici je rovněž odběrová soupruva
.c..-I r obsahujícl tampon ve zkumavce a v rezervoárku nad zkumavkou pak transportní a kuh ivacrn
medium pro trichomonády a kvasinky.
V preparátu hledáme prvoky oválného tvaru, obsahující kapkovité jádro, kteří jsou vybaveni
celltrální lyčlf7ko/l (axostylem) a 4 dlouh}ll17i bičík).'; Vehkost trichomonad značně kollsá ..
U"akutnIch forem činí 1O ~Lm, u chronických forem až 30 bLm Prvok je pohyblivý, po 48 hodinách
kultivace však snadno autolyzuje. Po obarvení odle Giems nacházíme červenofialové kapkovilc
)a 1'0, s\'ělle modro/l cyfop1asI11lL zatímco epitelie pochvy jsou zbarveny tmavěli a maji čtvercovitý
tVE~..:.P~ř~i~b:.::a::..rv~en:..:.í7c:;::~a=.;s::..:t-=o~d=-o=-c:.:h.:..:á=z:.:..í..:.k.:..r:..:o~z::.rp~a:..:.d:..:.u;....t.:....r;....ic.:....h....:o_m_o.:...n_a:.....·d:....,:....t_a_k_ž_e_v--!;.p_re...Jp;....a_r_á_tu--,-p_a_k_l_z_e_v_i_d_ět.-!-J-.'_o__
fragmenty jejich buněk.
Trichomonas
vaginalis
PARAZITI
Parazité jsou nejčastějšími původci inf. onemocnění na světě. V teplém podnebním pásmu vyvolávají
vážná, život ohrožující onemocnění. V našich klimatických podmínkách způsobují parazité mírněji
probíhající onemocnění. S rozvojem cestovního ruchu se i u nás začínají vyskytovat parazité
importované zciziny.
Identifikace: u exoparazitů lze diagnostikovat dle makroskopického vzhledu. Nejvýznamnější
metodou u většiny parazitů je podle mikroskopie. V nativním preparátu pozorujeme prvoky a jej ich
cysty, některé červy ajejich vajíčka. Lépe jsou ale vidět po obarvení.
Kultivace je možná jen u některých agens ( trichomonády, patogenní améby).
Velice výhodnou metodou je průkaz antigenu. Průkaz protilátek (toxoplasmosa, toxokarosa ) má
menší diagnostickou hodnotu.
NEJČASTĚJI ODEBÍRANÉ DRUHY MATERIÁLU
STOLICE
Odebíráme velikosti vlašského ořechu do odběrové soupravy. Uchováváme v chladu - nemrazíme!!!
Odběr opakujeme v intervalech 24 - 72 hodin alespoň 3x. Více odběrů v jednom dni není vhodné!
Při podezření na amoebiózu musíme vyšetřit do 30 minut, jinak autolyzují.
Ve stolici hledáme celé červy nebo jejich části (články tasemnice)v nativním nebo obarveném
preparátu hledáme vajíčka červů, prvoky nebo jejich cysty.
PERlANÁLNÍ STĚRY A OTISKY, ANÁLNÍ VÝTĚRY
Provádíme výhradně při podezření na infekci vyvolanou roupy nebo tasemnicemi. Je nutné, aby si
pacient 8-12hodin ( obvykle přes noc) neomýval oblast konečníku. Provedeme otisk pomocí
průhledné lepící pásky, na které ulpí vajíčka roupů. Pásku nalepíme na podložní sklo a
mikroskopujeme. Tato metoda se nazývá Grahamova.
SPUTUMABAL
Odebíráme do širokých umělohmotných sterilních zkumavek ( kvůli centrifugaci ). Hledáme larvy
Ascaris lumbricoides ( škrkavka) , Paragonimus sp.( plicní motolice) nebo háčky Echinococcus
granulosus ( měchožil zhoubný - tasemnice). BAL odebíráme do několika sterilních větších
zkumavek a diagnostikujeme v něm Pneumocystis carinii.
VÝTĚR Z POCHVY, URETRY, EXPRlMÁT Z PROSTATY
Z uretry odebíráme 3 vzorky sterilními tampony na drátě. 2 natřeme skla - jedno barvíme dle Grama
druhé dle Giemsy. 3 tampon ponoříme do média ( C.A.T. Swab ) pro kultivaci Trichomonas vaginalis.
KREV NA SEROLOGICKÁ VYŠETŘENÍ ( srážlivá )
Sérum centrifugujeme 3min při 30000t. Přepipetujeme do sterilní zkumavky, zamrazíme nebo
skladujeme při chladničkové teplotě. Ze séra stanovujeme protilátky různých tříd ( Toxopl. Toxocar. )
KREV NA MIKROSKOPICKÁ VYŠETŘENÍ
Nativní preparát - kapka krve smíchaná s fyz. roztokem a natřená na podložní sklo - nám slouží pro
diagnostiku Trypanosomy ( přenos mouchou tse-tse = spavá nemoc) nebo některých mikrofilárií larvy
kolující v krvi.
U barveného preparátu připravujeme tenký krevní rouěr nebo tzv. tlustou kapku. Na čisté odmaštěné
podložní sklo kápneme kapku periferní krve z bříška prstu a hranou druhého podložního skla ji
rovnoměrně roztahneme po celém podložním skle.
Takto pozorujeme např. malárii ( odběr nutný v horečnatých záchvatech - parazité jsou vyplavováni
do krve), kde pátráme po vývojových stádiích malárie ajiných krevních parazitů. .
Zpracování stolice na parazity
Odběr materiálu
Stolici odebíráme velikosti vlašského ořechu do přiměřeně velké odběrové nádobky,
např. do zkumavky z umělé hmoty s lopatičkou v zátce. Odběrová souprava nemusí být
sterilní. Nelze - li vzorek dodat v krátké době do laboratoře, umístíme jej v chladu.
Odběr opakujeme v intervalech 24 - 72 hodin alespoň 3x. Odběr stolice na tampon pro
diagnostiku parazitů nestačí.
Ve stolici hledáme celé červy nebo jejich části ( např. články tasernnice ), v nativním
nebo obarveném preparátu hledáme vajíčka červů, prvoky nebo jejich cysty.
Při podezření na infekci vyvolanou roupy nebo tasemnicemi provádíme perianální
stěry a otisky. Okolí análního otvoru se přelepí průhlednou lepicí páskou, na které ulpí
vajíčka roupů. Pásku nalepíme na podložní sklo a přes pásku pak mikroskopujeme.
Mikroskopické vyšetřovací metody pro diagnostiku parazitů
Příprava tzv. tlustého nátěru dle Kato
Metoda je vhodná pro diagnostiku střevních prvoků. Do kapky destilované vody na
podložním skle rozmícháme malé množství stolice a rozetřeme je do plochy asi 2 x 2
cm. Aby preparát nevyschnul, překryjeme jej celofánovou fólií velikosti asi 3 x 3 cm,
namočenou do glycerínu a meth)'letllWé zeleně. V takto připraveném preparátu hledáme
v mikroskopu při zvětšení lOOx nebo 400x.
I1QV;eJf&fTVt'IJ /
Koncentrační metoda dle Fausta
Poněvadž vajíček parazitických červů nebývá v přímých nátěrech mnoho, užívá se
.koncentračních metod. Stolici nejprve homogenizujeme ve vodě a poté zcentrifugujerne.
Pak resuspendujeme sediment v nasyceném roztoku ZnS04 ( asi 33% ) a znovu
zcentrifugujeme. Lehčí vajíčka a cysty vyplavou po centrifugaci na povrch. Materiál na
povrchu přeneseme na krycí sklíčko a rnikroskopujeme při zvětšení lOOx až 400x.