Doc. RNDr. Sabina Ševčíková, PhD BMS ÚPF LF MU Buňka Jádro a chromozomy Buněčný cyklus http://www.youtube.com/watch?v=C6hn3sA0ip0&feature=related Fáze mitózy  Profáze  Metafáze  Anafáze  Telofáze Joe Hin Tjio (1919 - 2001) Tjio, T.H., Levan, A.: The chromosome number of man. Hereditas 42:1, 1956 Člověk 23 párů chromozomů, celkem tedy 46 chromozomů Albert Levan (1905 -1998) Počet lidských chromozomů Karyotypizace  Počet, velikost a tvar chromozomů  Černo-bílé analýzy Karyotyp - schéma Karyotyp - doopravdy XY muž Možnosti vyšetření karyotypu člověka  Metafázní cytogenetika – vyšetření buněk v metafázi  Interfázní cytogenetika – vyšetření buněk v interfázi  Cytogenetika založená na izolaci DNA Metafázní cytogenetika Metafázní cytogenetika Trizomie 21. chromozomu Down syndrome Interfázní cytogenetika  Vyšetření interfázních jader pomocí fluorescenčně značených sond V. Vránová FISH- fluorescenční in situ hybridizace SKY karyotypizace  Vizualizace všech chromozomů  Každý chromozom jiná barva  Knihovna krátkých prob, které se vážou na specifická místa na chromozomu SKY spektrální karyotypizace K detekci translokací SKY Cytogenetika založená na izolaci DNA Komparativní genomová hybridizace (CGH) Science, 1992 Komparativní genomová hybridizace Modifikace klasických metod ke zjištění zisků a ztrát v rámci celého genomu Klasická FISH normální DNA → udělat probu úseku→ nabarvit abnormální target → identifikace abnormálního targetu Komparativní genomová hybridizace normální DNA → udělat probu (celý genom) → kvantifikace na normální target → kvantifikace abnormálního genomu C A C C C CC CCA AAATG GG GTT TT G G G G GC CTA G G GC CTA G G GC CTA C zelená - zisk červená - ztráta Referenční DNA Testovaná DNA Komparativní genomová hybridizace (CGH) ▪ umožňuje během jedné hybridizační reakce stanovit ztráty (delece) či zisky (duplikace, amplifikace) sekvencí DNA v celém genomu bez ohledu na mitotickou aktivitu buněk ▪ rozlišovací schopnost – 10 Mb, klonální zastoupení – 50 % ▪ nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných buněk Array-CGH postup Příprava DNA čipů pro aCGH 5. Scanner www.agilent.com • DNA o dobré kvalitě a množství z •Periferní krve •Kostní dřeně •Solidních nádorů •amniocytů c > 100 ug/ml, A260/A280 = 1,8 Referenční DNA – zdravý muž, žena Požadavky pro aCGH Rozlišení metod  a) Cytogenetika  Karyotyping > 10 Mb kompletní genom  Traditional CGH > 2 Mb kompletní genom  FISH (interphase) ≥ 20 Kb specifické proby  FISH (metaphase) ≥ 100 Kb specifické proby  b) aCGH  BAC 100 Kb kompletní genom  cDNA 2 Kb jen geny  Oligo (60-mer) 0,06 Kb kompletní genom Využití aCGH  Klinická cytogenetika (prenatálně, postnatálně)  Nádorová cytogenetika Mnohočetný myelom  Krevní nádorové onemocnění  10% krevních nádorů  Medián věku 60 let  4/100 000  Infiltrace plazmatických buněk do kostní dřeně  Osteolytické leze  Monoklonální IgM v séru nebo moči Genomické metody  Array CGH (DNA)  GEP (RNA)  Real-time PCR (RNA) GEP  Množství RNA transkribované v buňce  Pro stanovení high-risk pacientů  Rozdělení MM na několik podskupin podle exprese cyklinu D  High-risk pacienti- exprese 17 genů GEP Array CGH  celogenomové komparativní genomové hybridizace na čipech  Analýzy chromozomových změn v celém genomu  Lepší kvalita i množství dat  Detekce chromosomálních aberací kolem 2kb v jediné reakci Využití aCGH v MM J. Smetana Hledání kandidátních genů pro prognózu J. Smetana Real-time PCR  Polymerase chain reaction  Pro ověření exprese genů z GEP  Detekce fluorescenčního signálu v reálném čase  Kvantitativně množství templátu Neuroblastom Charakteristika TYP I (LR) Typ II (IMR) TYP III (HR) N-myc normální normální amplifikováno 1p36 LOH ne ±ano obvykle ano Ploidie hyper2n / 3n 2n / 4n 2n / 4n Věk* obvykle < 1rok obvykle = 1 rok obvykle 1-5 let Stadiumo obvykle 1, 2, 4s obvykle 3, 4 obvykle 3, 4 Pravděpodobnost přežití 3 roky 95% 25-50% < 5% ▪ pevný dětský nádor sympatického nervového systému ▪ 5–10 případů /106 dětí/rok ▪ 10 % rakoviny v dětském věku; 50 % do 2 let; 90 % do 6 let G.M.Brodeur et al., 1995: Molecular Basis for Heterogeneity in Human Neuroblastomas V. Vránová Význam array CGH u dětských pacientů s neuroblastomem Mentální retardace (MR): příčiny  Výskyt MR u 2-3 % populace  17- 20% pacientů s idiopatickou PMR kauzální nebalancované aberace celogenomový screening pomocí array-CGH Častý nález CNV - mikrodelecí/mikroduplikací v genomu - mohou být postiženy různé chromozomy V. Vránová Děkuji za pozornost