PROTEOMIKA
DOC RNDR SABINA ŠEVČÍKOVÁ, PHD
UPF
PROTEOM
• KOMPLETNÍ SADA PROTEINŮ PŘÍTOMNÝCH V DANÉM OKAMŽIKU V BUŇCE
NEBO TKÁNI, ZAHRNUJÍCÍ VEŠKERÉ JEJICH MODIFIKACE, VZÁJEMNÉ INTERAKCE,
LOKALIZACI A METABOLICKÝ OBRAT.
GENOM
• ÚPLNÁ GENETICKÁ INFORMACE DANÉHO ORGANISMU
PROTEOM
• PRVNÍ DEFINICE VŮBEC: MARC WILKINS,1994
• „PROTEOM JE SOUBOR PROTEINŮ KÓDOVANÝ PŘÍSLUŠNÝM GENOMEM“
• DNEŠNÍ DEFINICE VŠAK VÍCE ZDŮRAZŇUJE DYNAMICKOU POVAHU PROTEOMU
• „PROTEOM JE ČASEM A MÍSTEM VYHRAZENÝ SOUBOR PROTEINŮ KÓDOVANÝ
PŘÍSLUŠNÝM GENOMEM“
• KVANTITATIVNÍ A KVALITATIVNÍ CHARAKTERIZACE ÚPLNÉ SADY BÍLKOVIN
PROTEOM
• PROTEOM (NA ROZDÍL OD GENOMU):
• LIŠÍ SE ORGÁN OD ORGÁNU, TKÁŇ OD TKÁNĚ, BUŇKA OD BUŇKY...
• JE ZÁVISLÝ NA ŠIROKÉM SPEKTRU VNITŘNÍCH A VNĚJŠÍCH FAKTORŮ
(PROSTŘEDÍ, VĚK, POHLAVÍ, NEMOC ATD.)
GENOM VS PROTEOM
• GENOM PROTEOM
• KOMBINACE 4 BÁZÍ KOMBINACE 20 AA
• STATICKÝ DYNAMICKÝ
• CCA 22 000 GENŮ NÁSOBNĚ VĚTŠÍ POČET PROTEINŮ: RNA EDITACE,
ALTERNATIVNÍ SESTŘIH, POSTTRANSKRIPČNÍ
MODIFIKACE
SOUHRN SKUTEČNĚ FUNKČNÍCH MOLEKUL
PROTEOMIKA
• STUDIUM KOMPLETNÍ SÍTĚ PROTEINŮ SPÍŠ NEŽ STUDIUM JEDNOTLIVÝCH
PROTEINŮ
• FUNKCE A STRUKTURA A 3D MAPA
FUNKCE PROTEINŮ
• ENZYM
• STRUKTURNÍ PROTEIN
• TRANSPORTNÍ PROTEIN
• POHYBOVÝ PROTEIN
• SIGNÁLNÍ PROTEIN
• RECEPTOR
• REGULAČNÍ PROTEIN
PROČ PROTEOMIKA?
• FUNKCI PROTEINU NELZE URČIT NA ZÁKLADĚ GENOVÉ EXPRESE
• VĚTŠINOU NEKORELUJE HLADINA MRNA A HLADINA PROTEINU
• MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY NEPOPÍŠEME GENOMIKOU
• 200 TYPŮ POSTTRANSLAČNÍCH MODIFIKACÍ
• ALTERNATIVNÍ TRANSLACE
• FENOTYP JE TVOŘEN PROTEINY !!!!!
CENTRÁLNÍ DOGMA MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
OD RNA K PROTEINU
• GENETICKÝ KOD JE TRIPLETOVÝ – 3 NT V RNA – 1 AA
• RNA – A, U, G, C
• AUG STARTOVNÍ KODON
• UAA, UAG, UGA –STOP KODONY
• KOD DEGENEROVANÝ – 1 AA KÓDOVÁNA NĚKOLIKA TRIPLETY
• GENETICKÝ KÓD UNIVERZÁLNÍ
TRANSLACE V EUKARYOTICKÉ BUŇCE
• STRUKTURNÍ GEN – PREMRNA-MRNA
• MRNA OPOUŠTÍ JÁDRO
• NA RIBOZOMECH TRANSLACE – POLYPEPTIDOVÝ ŘETĚZEC
• STOP KODON – KONEC TRANSLACE
• POLYPEPTID SE UVOLNÍ
POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE
• PŘIPOJENÍ FUNKČNÍCH SKUPIN
• MODIFIKACE AMINO SKUPIN
• STRUKTURNÍ ZMĚNY
• ALTERNATIVNÍ SESTŘIH
• ALTERNATIVNÍ ZAVINUTÍ
Proteome
Interakce s okolímFáze buněčného
cyklu
???
Teplota
Fyziologický stav buňkyBuněčně specifická
genová exprese
Stres
Genom
Faktory ovlivňující proteom buňky
Proteom se dynamicky mění v průběhu
buněčného cyklu, vývoje, v reakci na
změny v metabolismu, prostředí, …
Sledování množství a lokalizace proteinů
(nejen proteomické)
Detekce konkrétních proteinů
- Imunodetekce - proteinová elektroforéza (SDS-PAGE), Western blot
- Sledování aktivity proteinu (použitelné pouze pro enzymy)
Studium lokalizace proteinu
- Translační fúze s reportérovým genem (GFP) – viz dříve
(+ transformace rostlinných buněk)
Studium proteomu
- Dvourozměrná elektroforéza (2D)
- „Gel-free“ metody
Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE)
Imunodetekce konkrétního proteinu
Přenos proteinů z gelu na membránu
= Western blot
Detekce proteinu protilátkami
(primární = rozeznává detekovaný protein
sekundární = rozeznává protilátky z určitého
organismu
Vizualizace pomocí barevné reakce,
fluorescence či chemiluminiscence
Sekundární protilátky konjugované
s enzymem či fluorescenční značkou
membrána s navázanými proteiny
Primární
protilátka
W. blot
Analýzy celého proteomu
nutná separace jednotlivých proteinů (popř. peptidů):
– 2D elektroforézou či gel-free metodami (chromatografie aj.)
Princip dvourozměrné (2D) elektroforézy
IEF: isoelektrická fokusace
SDS-PAGE
Každá skvrna představuje jeden protein (při záměně či modifikaci
aminokyseliny zpravidla dochází ke změně pI a posunu pozice na gelu)
První rozměr IEF
(isoelektrická fokusace):
- separace proteinů dle
isoelektrického bodu
- proteiny putují do místa, kde pH gelu odpovídá
jejich isoelectrickému bodu (pI), tam ztrácejí
náboj a zastavují se
= dělení proteinů podle náboje v pH gradientu
Druhý rozměr SDS-PAGE
- separace denaturovaných obalených proteinů dle velikosti v
síti polyakrylamidového gelu
Princip 2-rozměrné (2D) elektroforézy
IEF: isoelektrická fokusace
pH 3 pH 10SDS-PAGE
200 kD
20 kD
+ -
-
+
BARVENÍ PROTEINOVÝCH GELŮ
• COOMASSIE BLUE
• STŘÍBREM (CITLIVÉ, ALE NENÍ KVANTITATIVNÍ)
• FLUORESCENČNÍ BARVIVA (DIGE)
• RI (ZNAČENÍ IN VIVO)
DIGE: DIFFERENCE
IN GEL ELECTROPHORESIS
- POROVNÁVÁNÍ PROTEOMŮ
NA PROTEINY Z KAŽDÉHO VZORKU
NAVÁZÁN JINÝ FLUOROFOR - STEJNÉ
VLASTNOSTI PŘI IEF A SDS-PAGE,
(SMÍCHÁNÍ, SEPARACE, DETEKCE)
Blue Native Gel Electrophoresis
SDS-PAGE
Analýza proteinových komplexů
- dělení nativních komplexů (obalených Coomassie BB) dle velikosti
v gradientovém gelu (gradient koncentrace akrylamidu = hustota sítě)
IDENTIFIKACE PEPTIDŮ HMOTOVOU SPEKTROMETRIÍ:
1) „PEPTIDE FINGERPRINTING“
- PŘESNÉ ZMĚŘENÍ VELIKOSTÍ DEFINOVANÝCH ŠTĚPŮ PROTEINU A
POROVNÁNÍ S PREDIKOVANÝMI ŠTĚPY PROTEINŮ V DATABÁZÍCH
• DEFINOVANÉ NAŠTĚPENÍ
TRYPSINEM ČI JINOU PROTEÁZOU
(SPECIFICKÉ, REPRODUKOVATELNÉ ŠTĚPENÍ
PROTEINU)
• HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE
NAPŘ. MS - MALDI/TOF
• MATRIX-ASSISTED
• LASER DESORPTION /
IONISATION
• TIME-OF-FLIGHT ANALYSIS
MALDI
Matrix-assisted
Laser desorption /
ionisation
ToF
Time-of-flight
– změření doby
letu k detektoru
DNA (i EST), proteinová databáze
generování teoretických trypsinových
štěpů ze známých či předpokládaných
proteinových sekvencí
protein a: 3, 5, 9, 12 kD
protein b: 2, 7, 9 kD
protein c: 4, 8 kD
protein d: 3, 9, 12 kD
protein e: 2, 6, 8 kD
MALDI ToF
Srovnání experimentálně stanovených
velikostí peptidů s teoretickými štěpy
Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting”
protein I (12 kD)
2 fragmenty (4 kD, 8 kD)
protein II (16 kD)
3 fragmenty
(2 kD, 6 kD, 8 kD)
protein I
protein II
m/z
m/z
4000 8000
2000 80006000
štěpení proteázou (trypsinem)
– výběr peptidu (na základě primární TOF)
– fragmentace peptidu (v dráze peptidu např. zařazena
„kolizní komora“ s nižším vakuem)
– sekundární ToF analýza vzniklých fragmentů
2) MS/MS „sekvenování“ peptidů
např. MALDI TOF/TOF (MALDI MS/MS)
Přednostní fragmentace peptidové vazby
- rozpad na dva fragmenty
HMOTOVÉ SPEKTRUM PEPTIDOVÝCH FRAGMENTŮ
Směs proteinů ----- protein ----- peptid ---------- fragmenty peptidu = identifikace
př. 2D trypsin MS/kolize/MS sw Mascot
ANALÝZY MS SPEKTRA
Postup:
- rozštěpení proteinů z každého vzorku na peptidy
- modifikace peptidů chemickou skupinou neovlivňující jejich
separaci - každý vzorek jinak, ale různě modifikované peptidy stejné
sekvence se chovají při další separaci stejně = „jdou“ společně
(= chemická struktura připojené skupiny identická a MW taktéž!)
- smíchání vzorků, postupná frakcionace (pro snížení komplexity –
aby do každé MS analýzy vstupoval jen malý počet peptidů
(směs různých peptidů z různých proteinů, ale současně stejné peptidy
z různých vzorků – označené připojenou skupinou)
- analýza MS/MS
- identifikace jednotlivých peptidů (fragmentační spektrum)
- určení poměru množství paptidu v jednotlivých vzorcích
(po odpoutání reportérové skupiny)
iTraq isobaric tags for relative and absolute quantitation
„Gel free“ metoda pro hledání a kvantifikace rozdílů v proteomech
iTraq značení
Ross P L et al. Mol Cell Proteomics 2004;3:1154-1169
(každý vzorek samostatně)
Modifikace
aminoskupin
iTraq činidly
(každý vzorek jiným
činidlem)
např. isoelektrická
fokusace peptidů
smíchání
LC
MALDI TOF/TOF
(identifikace peptidů +
zastoupení z jednotlivých
vzorků)
4-(8) x
Schéma modelového experimentu
frakcionace směsi peptidů
Identifikace peptidů (fragmentační spektrum) +
relativní zastoupení v jednotlivých
vzorcích (množství jednotlivých tagů)
iTRAQ - omezené množství vzorků (max. 8)
(TMT - podobný princip - až 10 vzorků)
- snižuje rozdíly mezi variantami
(kontaminace jinými peptidy – reportérové skupiny)
Label free metody
- nezávislá analýza vzorků za plně
identických podmínek
- technicky náročné
- vnitřní kalibrace
- náročné počítačové zpracování
Kvantifikace rozdílů v proteomech
FLOWCYTOMETRIE
• ANALÝZA POVRCHOVÝCH ALE I VNITŘNÍCH
PROTEINŮ POMOCÍ FLUORESCENČNĚ
ZNAČENÝCH PROTILÁTEK
• BUŇKY PROCHÁZÍ V SUSPENZI
• MĚŘÍCÍM BODEM PROJDE VŽDY JEN JEDNA
BUŇKA
• BUŇKY OBARVENÉ SPECIFICKÝMI
PROTILÁTKAMI SE SPECIFICKÝMI
FLUOROCHROMY
ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN
• BUNĚČNÝ CYKLUS
• ANALÝZA ZLOMŮ DNA
• INKORPORACE BRDU
• EXPRESE CYKLINŮ
• ANALÝZA DENATURACE DNA
STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ
• VIABILITA
• STANOVENÍ INTRACELULÁRNÍHO PH
• ANALÝZA ORGANEL A CYTOSKELETU
• STANOVENÍ MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU
• OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ
• STANOVENÍ INTRACELULÁRNÍHO CA2+
• STANOVENÍ INTRACELULÁRNÍCH CYTOKINŮ
ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU
• IMUNOFENOTYPIZACE POMOCÍ CD ANTIGENŮ
• (DETEKCE DIFERENCIAČNÍCH A NÁDOROVÝCH MARKERŮ)
• DETEKCE CYTOKINOVÝCH RECEPTORŮ
ANALÝZA BUNĚČNÉHO CYKLU
ANALÝZA KREVNÍCH BUNĚK
DETEKCE MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY