Vybrané laboratorní metody
v mikrobiologii
Obsah
1 Teoretická část . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1 Příprava mikroskopického preparátu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Stanovení inhibujících látek mikrobiologickouM metodou . . . . . . . . . . . 5
1.2.1 Jednotlivé metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3 Druhy kultivace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4 Sporotvorné mikroorganismy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.5 Biochemické vlastnosti mikroorganismů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5.1 Růst mikroba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5.2 OF – test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5.3 Zkvašování cukrů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5.4 Rozklad některých látek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5.5 Tvorba některých látek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5.6 Utilizace některých látek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.5.7 Rychlé a kompaktní testy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2 Postupy práce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1 Elementární postupy (Postupy jsou popsány pro praváka, levák je dělá
zrcadlově.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.1 Vypalování kličky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.2 Odebrání bakterií z bujonu / suspenze . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.3 Odebrání bakterií z pevné půdy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.4 Očkování na pevnou půdu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.5 Očkování do bujonu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.6 Dekadické ředění . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.7 Aplikace mikroba na povrch půdy . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.8 Aplikace mikroba do agaru . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.9 Odečtení velikosti zóny inhibice růstu . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.10 Odečtení počtu kolonií na misce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.11 Šikmení agarů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.12 Vylévání agaru na misku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2 Barvení podle Grama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3 Acidoresistentní barvení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.4 Barvení na pouzdra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.5 Barvení na spory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3 Receptury . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.1 Receptury barviv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.2 Receptury půd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3 Receptury činidel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2
Kapitola 1
Teoretická část
1.1 Příprava mikroskopického preparátu
Zdrojem preparátu mohou být mikrobiologické kultury, klinický materiál (moč, stolice,
sputum, výplachy tělních dutun, někdy koncentrované např. odstředěním), stěry z
prostředí apod.
Vzorek umísťujeme na podložní sklíčko.
V případě větších objektů (prvoci, kvasinky, houby) kryjeme preparát krycím sklíčkem.
Preparát v kapce roztoku (fyziologický roztok, živná půda apod.) kápneme na podložní
sklíčko. Na to spustíme sklíčko krycí tak, aby se dotklo jedním okrajem podložního
těsně vedle kapky a potom je přes kapku překlopíme. Tím vypudíme většinu bublin na
opačnou stranu. Nadbytek kapaliny odsajeme kouskem vaty, buničiny nebo filtračního
papíru.
Pozorování větších objektů provádíme ve vhodném roztoku. V případě, že se
jedný o živnou půdu nebo fyziologický roztok, pozorujeme živé objekty. Je ovšem nutno
mít na paměti, že vysoká intenzita světla, jaké je používáno v mikroskopu, je pro naprostou
většinu těchto objektů nefyziologická a mohou se proto chovat abnormálně. Pohyblivé
objekty (prvoci) mají tendenci utíkat ze světelného paprsku, a tedy i zorného pole. Někdy
můžeme jejich struktury zvýraznit vitálním barvením, na které většinou užíváme velmi
zředěná netoxická barviva.
Další objekty jsou umístěny ve fixačním roztoku, který je usmrcuje a současně zlepšuje
optické vlastnosti preparátu (mikroskopické houby budeme takto pozorovat v lakto-
fenolu).
Pozorování menších objektů při největším zvětšení provádíme bez krycího
sklíčka. Objekty jsou k podložnímu sklíčku fixovány a jsou vybarveny, aby vůbec byly pozorovatelné.
Pro lepší rozpoznání podrobností na preparátu je používána imerzní kapalina
(olej), která vyplní prostor mezi preparátem a objektivem. Ta svou vysokou světlolomností
zajistí optický kontrast mezi preparátem a jeho okolím. Optika objektivu je stavěna
na přechod imerze-sklo, takže některé imerzní objektivy vůbec nelze bez ponoření do
imerzního oleje zaostřit, jiné sice vytvoří ostrý, ale zpravidla nedostatečně světelný obraz.
Význam mikroskopického pozorování je různý, podle typů objektů (myšlena je
světelná mikroskopie)
*virologie – jsou vidět jen největší viry jako nepatrná tělíska, pokud se vybarvují.
Nelze je rozeznat od jiného „smetí“, které může v preparátu být. Diagnosticky
je toto bezvýznamné. Naopak cenné je pozorování virových inkluzí ve tkáních a buňkách,
patrně nejznámější jsou inkluze viru vztekliny v některých partiích mozku, které
se dodnes užívají pro diagnostiku tohoto onemocnění. *bakteriologie – rozdělení
podle typu barvitelnosti, podle základního tvaru buněk (koky – tyčky), případně
uspořádání buněk (diplokoky, tetrády, řetízky, shluky), přítomnost spór, pouzder,
případně bičíků. Určí se tím velké skupiny, které se dále dourčovávají imunologicky
nebo PCR. Můžeme kontrolovat i homogennost kultury1
*prvoci – mikroskopování
umožňuje určit zpravidla rod, někdy i druh *kvasinky – mikroskopování umožňuje
1
Toto nepodceňovat, naprostá většina „záhadných“ výsledků z dalších metod, odpovídajících „novému,
v literatuře nepopsanému druhu“, byla pořízena tak, že byla kultura jedné bakterie kontaminována jiným
druhem.
3
stanovit přítomnost některých znaků, bez jejichž znalosti je určení velmi obtížné nebo
nemožné *vláknité houby – většinou se určují především podle mikroskopických
znaků, v některých skupinách jsou cenné i znaky makroskopické (zbarvení kultury,
půdy pod ní, struktura a velikost kolonií apod.). *parazitičtí červi – nález vajíček
se provádí mikroskopováním vzorků, vajíčka obsahují znaky umožňující často určit
přímo druh.
Postup při preparátu bakteriální kultury je velice uniformní:
• Na podložní sklíčko kápneme (nejlépe mírně excentricky) malou kapku fyziologického
roztoku. (Výjimkou je barvení na pouzdra, kdy takto kápneme tuš)
• Bakterii odebereme vypálenou a ochlazenou kličkou z kolonie.
• Kličkou kvedláme v kapce, a tím suspendujeme bakterie v roztoku.
• Poté kličkou rozetřeme suspenzi na větší plochu a necháme zaschnout.1
• Po opravdu důkladném zaschnutí preparát fixujeme protažením plamenem (nanesenými
bakteriemi nahoru). Kontrolujeme pokládáním sklíčka spodní stranou na hřbet
ruky, má pálit, ale neudělat spáleniny (cca 60◦
C. Nedostatečné zahřátí vede k tomu,
že bakterie při barvení „odplavou“. Pokud preparát zahřejeme příliš, dojde ke změnám
tvaru buněk (připomínají kuličky ze zmačkaného papíru) a někdy i barvitelnosti.
• Poté barvíme podle návodu příslušného barvení. Většina barvení je založena na obecném
principu, že v první částí postupu dojde k vybarvení určitých struktur tak, že
se následně neodbarví (barvivo se k těmto strukturám pevněji váže). Ty struktury,
které se v další části postupu odbarvily, dobarvujeme na konec kontrastní barvou.
• Po skončení barvení musíme preparát nechat uschnout (zpravidla jej nakonec krátce
oplachujeme destilovanou vodou), nejlépe opřený stojící na hraně.
• Po dokonalém uschnutí (není-li dokonale uschlý, vadí kapičky vody a nejde se jich
zbavit) mikroskopujeme.
Mikroskopování preparátu bakteriální kultury je opět velmi uniformní:
• Preparát zakápneme imerzním olejem2
• Sklíčko položíme na stolek mikroskopu a připevníme.
• Vybereme nejsilněji vybarvené místo na preparátu a do něj spustíme imerzní objektiv.
Ten poznáme zpravidla podle jednoho nebo dvou prstenčitých proužků.
• Za kontroly zrakem mikrošroubem zvedáme. Můžeme mírně pohybovat preparátem
(šrouby na stolku), abychom viděli změny síly světla v zorném poli. Při zvedání sledujeme
okamžik, kdy vidíme ostrý obraz. Pokud „přeběhneme“, spouštíme objektiv
na sklíčko opět při pozorování z boku. Vzhledem k pomalému pohybu se objektiv pohybuje
značnou silou (fyzika!) a vůbec nemusíme při pohledu do okuláru a spouštění
na slepo pozorovat dosednutí na sklíčko a poznáme až jeho prasknutí. Takto se zničí
preparát, ale může dojít i k poškození objektivu!
• Když se nám podaří zaostřit, posuneme preparát na nějaké řidší místo, protože tam
jsou buňky typicky vybarveny (na přehuštěném místě mohou být špatně vybarveny).
• Po skončení mikroskopování (závěr praktika) utřeme objektiv buničinou (existují na
to i speciální tkaniny).
1
Jakékoli pokusy urychlit schnutí nahříváním nad plamenem kahanu končí zpravidla „rozvařením“ bakterií
na homogenní hmotu.
2
Pozor na to, z které strany sklíčka preparát je, mnoho preparátů, které „nejdou zaostřit“ vzniká právě
mikroskopováním z rubové strany.
4
1.2 Stanovení inhibujících látek mikrobiologickou
metodou
Inhibice mikroba účinnou látkou v kultuře se projeví zástavou jeho množení, případně
jeho úhynem. Z tohoto hlediska rozlišujeme látky inhibující a látky mikrobicidní. Některé
látky mohou mít v nižší koncentraci inhibující a ve vyšší mikrobicidní účinky.
Interakce probíhá tak, že máme známou látku a testujeme jí mikroba neznámých
vlastností, nebo máme mikroba známých vlastností (např. sbírkový kmen) a testujeme
jím přítomnost látek, které by ho mohly inhibovat.
V klinické mikrobiologii se provádí především testování izolovaných bakterií a dalších
původců infekcí známými antibiotiky a chemoterapeutiky za účelem stanovení jejich citlivosti
a nasazení správné (případně korekce stávající) terapie. Postupy, při nichž se pomocí
velmi citlivých balkterií sledovalo např. pronikání antibiotik do hnisu, likvoru apod. byly
zcitlivěním a poklesem ceny fyzikálně chemických analytických metod vytlačeny dříve,
než se dostaly do běžné praxe.
V potravinářské mikrobiologii se jako obecně inhibující účinky materiálu (extraktui
z něj) sleduje výskyt antibiotik a chemoterapeutik např. v mléce nebo mase. Nejde jen
o ochranu zdraví konzumenta, ale i o to, že uvušlechtilá mikroflóra, používaná k výrobě
některých masných i mléčných fermentovaných potravin je zpraviodla velice citlivá na
antibiotika a chemoterapeutika. Ty mohou narušit technologii i v koncentracích, které by
obecně pro konzumenta nebyly rizikové.
Historicky byly užívány uvedené metody též ke stanovování některých mykotoxinů,
protože řada z nich má antibiotické účinky.
Uvedené metody lze s úspěchem využít i v potravinářských provozech, jednak na kontrolu
účinnosti používaných desinfekčních prostředků vůči standardní mikroflóře (normy
definují konkrétní druhy a někdy i sbírkové kmeny, které mají být k testování účinnosti
desinfečkčních prostředků použity). Takovýto postup zachytí např. hrubé chyby při přípravě
desinfekčních roztoků (někdo se splete v desetinném čísle), záměnu surovin na jejich
přípravu apod. Lze testovat i přímo mikroorganismy, které byly v prostředí výroby zachyceny
(tento postup je náročnější, ale zachytí např. vznikající nebo už vzniklou rezistenci
na používané desinfekční prostředky).
1.2.1 Jednotlivé metody
Obecně se dělí tyto mikrobiologické metody na dvě skupiny. První jsou metody diluční ,
při nichž je mikrob aplikován do řady roztoků, získaných ředěním původního materiálu,
a sleduje se, zda roste nebo ne. Druhou jsou metody difúzní , které jsou založeny na difúzi
látky od místa aplikace půdou, na níž roste mikrob. Se vzdáleností od místa aplikace klesá
koncentrace látky a výsledkem je zpravidla (na Petriho miskách) vytváření zóny inhibice
růstu mikroba. Její velikost je úměrná1
množství aplikované látky, resp. její koncentraci
v roztoku. Velikost zón silně závisí i na tloušťce půdy v misce.
Diluční metody nejčastěji vychází z dekadicky ředěné základní koncentrace. Ředění
provádíme v bujonu vhodném pro růst užitého mikrobiálního kmene. Do jednotlivých
roztoků přidáme identické množství kultury mikroba a sledujeme růst (nejčastěji vznik
zákalu, usazeniny nebo blanky). V některých případech je možné odečtení usnadnit zavedením
vhodného biochemického testovacího systému (viz dále), který indikuje růst kmene
např. změnou barvy půdy.
1
Průměr zóny zhruba lineátně koreluje s logaritměm množství nanesené inhibující látky.
5
V případě sledování pouze letálního účinku mikroby z roztoků po stanovené době
expozice (zpravidla minuty až hodiny) vyočkujeme na růstové médium a sledujeme, ze
kterých koncentrací se ještě podařilo vyočkovat životaschopné buňky.
Výsledkem uvedených testů je minimální inhibiční koncentrace, zkratka MIC.
Komínková metoda je historicky nejstarší metodou. Na povrch půdy v Petriho
misce se postaví duté válečky, „komínky“. Buď se spolehneme na jejich přilnutí k podložce,
nebo agar s nimi přelijeme další vrstvou agarové půdy „top agar“. Do nitra válečků aplikujeme
vzorky. Agar je buď předem potřen kulturou mikroba, nebo je mikrob suspendován
v top agaru. Sledujeme zóny inhibice růstu.
Jamková metoda spočívá ve vykrojení jamek do agaru (zpravidla do nich musíme
následně kápnout kapičku rozehřáté půdy, aby roztok z jamky nevytékal škvírou mezi
půdou a dnem misky). Po aplikaci mikroba na povrch půdy do jamek aplikujeme vzorek.
Protože difúzní metody jsou obecně citlivější tím víc, čím je půda tenší, hodí se tyto
metody na takové vzorky, kterých je zapotřebí aplikovat velice málo (setiny ml).
Disková metoda spočívá v aplikaci testovaného vzorku na povrch půdy nasáklého
do disku z filtračního papíru vhodného průměru a síly1
Mikrob je buď předem rozetřen
po povrchu půdy, nebo je zakomponován do top agaru.
Disková metoda se standardně používá ke stanovení citlivosti kmenů, zachycených
z klinického materiálu. Mnoho výrobců dodává standardní antibiotické disky, které se
buď kladou na povrch půdy ručně, nebo se používají vhodné aplikátory (někdy i takové,
které vloží na povrch současně více různých disků). Někdy se setkáme i s proužky, na
nichž koncentrace antibiotika plynule narůstá od jednoho konce ke druhému. Vzniká zóna
inhibice růstu zhruba trojúhelníkového nebo lichoběžníkového tvaru a podle místa, kde
překročí zadanou šířku, se stanovuje citlivost mikroba.
Řada výrobců též doporučuje konkrétní kmeny ze světových sbírek na testování svých
disků (kmen má kolem disku s konkrétním antibiotikem za stanovených podmínek vytvožit
zónu inhibice růstu v zadaném rozmezí průměrů).
Metoda je v některých skupinách bakterií používána i jako diagnostický test, protože
např. původci kapavky a původci meningitidy se od podobných G- diplokoků (nepatogenních,
ale také se vyskytujících v klinickém materiálu) liší citlivostí na některá antibiotika.
Více než sto let je známa vysoká citlivost Straptococcus pneumoniae na chemoterapeutikum
optochin a disky s touto látkou se užívaly k jeho diagnóze. Pokud se očekávala
přítomnost tohoto patogenu, vkládaly se už do křížového roztěru při primárním záchytu.
1.3 Druhy kultivace
Z hlediska vztahu ke kyslíku se bakterie dělí na:
*aerobní využívají kyslík ke svému metabolismu a bez jeho přísunu zastavují
růst a množení *fakultativně anaerobní mají schopnost jak aerobního tak i anaerobního
metabolismu *aerotolerantní přítomnost kyslíku jim nevadí, ale nevyužívají
ho ve svém metabolismu *anaerobní kyslík je pro ně jedovatý
Z praktického hlediska ještě rozeznáváme skupinu mikroaerofilní , které rostou při
snížené tenzi kyslíku. Patří sem jak některé fakultativně anaerobní, tak i některé aerotolerantní
nebo nikoli striktně anaerobní bakterie.
Aerobní kultivaci provádíme běžně v termostatu.
1
Pro semikvantitativní stanovení někdy stačí, když známe nasáklivost roztoku vzorku do materiálu z
něhož je dosk tvořen (vztaženou zpravidla na cm2
), a známe plochu disku. Poté stačí disky namáčet ve
vzorku a po okápnutí pokládat na povrch půdy.
6
Mikroaerofilní kultivace se provádí v běžných anaerostatech (a existují dokonce i
vaky s vyvíječem plynu na jednoduchou „anaerobní“ kultivaci. U klasických termostatů
se používala k odstranění části kyslíku svíčka (hořlaviny jako etanol by byly nevhodné,
protože v závěru hoření by v prostoru vznikal aldehyd a kyselina s baktericidními účinky).
Obdobného efektu (lze to kombinovat) se dosáhne směsí pyrogallol - hydroxid sodný (v
silně alkalickém prostředí pyrogallol oxiduje a odebírá na tento proces kyslík z prostředí).
Existují i speciální bujony s látkami pohlcujícími kyslík, které nality do vyšší vrstvy
ve vysoké zkumavce (sloupec půdy vyšší než 10 cm) zajišťují při hladině anaerobní a při
dně mikroaerofilní prostředí. Promíchávání půdy zajišťuje malý přídavek agaru (menší než
u půd na pohyblivost). Aerobní × anaerobní prostředí je indikováno vhodnými látkami,
které v přítomnosti kyslíku mění barvu.
Fortnerovy plotny představují utěsněné Petriho misky, z jejichž vnitřního prostředí
je kyslík vypotřebován bakterií Serratia marcescens. V klasickém provedení se misky
položily na skleněné destičky a utěsnily směsí vazelíny a parafinu, přičemž na část plochy
půdy v misce se vysadila Serratia a na zbytek vzorek nebo kultura. Lze též spojit dvě
dna misek, nebo půdu pro Serratii vylít na víčko. Těsnění se dá provést ponořením do
parafinu (opakovaným), který je pevnější než směs s vazelínou.
Hluboko anaerobní podmínky jsou dosahovány ve speciálních anaerostatech, které
jsou dlouhodobě proplachovány směsí plynů (CO2 a některé další). Materiál je do nich a
z nich přenášen skrze turnikety a očkuje se přímo v nich kličkami vypálenými elektrickým
proudem.
V malém lze podobného efektu dosáhnout kultivací v lahvičkách od injekcí (s gumovým
uzávěrem), půda v nichž je probublávána z bomby (lze použít i Kippův přístroj)1
Na závěr (probublávání trvá až desítky minut) se hrdlo lahvičky i se zátkou opakovaně
ponoří do roztaveného parafinu.
Pro uvedené silně anaerobní podmínky se používají speciální půdy, u nichž je počítáno
s vysokou koncentrací oxidu uhličitého (normální půdy by se neúnosně okyselily). Tyto
půdy jsou růstově velice bohaté, obsahují řadu vitamínů a dalších růstových faktorů; velice
častou složkou půd pro kultivaci extrémních anaerobů z trávicího ústrojí je bachorová
tekutina z krávy.
1.4 Sporotvorné mikroorganismy
Přestože existuje dále popsané barvení na spory, pro detekci výskytu spor v potravinářských
vzorcích se nepoužívá. Spory jsou detekovány na základě obecného postupu,
kterým zlikvidujeme vegetativní formy mikrobů a to, co přežije a vyroste, jsou organismy
vyklíčené ze spor.
Obecně se používá teplota 70 ◦
C, a expoziční doba (pro vzorek ve zkumavce) 30
minut, v odůvodněných případech lze použít i vyšší teplotu a delší expozici.
Detekce životaschopných spor má v potravinářských výrobcích význam tam, kde
potravina nebo potravinová surovina je uchovávána při teplotách umožňujících růst mikroorganismů
a současně neobsahuje látky inhibující vyklíčení spór (např. kyselina octová
nebo kyselina mléčná).
1
Uzávěr tedy musíme probodnout dvěma jehlami, jednou, která jde co nejhlouběji do kapaliny v lahvičce,
aby došlo k porobublávání a strhávání kyslíku z půdy, druhou jen skrze zátku, aby plyn z lahvičky odcházel.
7
1.5 Biochemické vlastnosti mikroorganismů
Biochemické vlastnosti mikroorganismů jsou zajišťovány enzymy, které jsou genovými
produkty. Z toho plyne, že mají vztah ke genetickému materiálu mikroorganismu. Některé
biochemické vlastnosti jsou posléze natolik specifické, že se vyskytují pouze (nebo
především) u některých skupin mikroorganismů a mohou být z tohoto důvodu využity k
jejich diagnóze.
Testy jsou jednak klasické (které byly rozvíjeny ve druhé polovině 19. a ve 20. století),
jednak různé rychlotesty, vyvíjené od poloviny 20. století dosud.
Klasický test představuje kultivaci mikroba na půdě vhodné pro jeho růst, přičemž
tato půda obsahuje substrát vhodný pro sledovanou biochemickou reakci (v několika málo
případech jsou jím standardní komponenty půdy) a v řadě případů i činidlo, které změnou
barvy signalizuje proběhnutí (neproběhnutí) reakce.
1.5.1 Růst mikroba
Již samotný růst mikroba může být diagnosticky užitečný. Rozeznává se zpravidla růst
při chladničkové (4 ◦
C) – pokojové (20 ◦
C) a tělesné (37 ◦
C) teplotě. Růst zpravidla detekujeme
pohledem jako vznik viditelných kolonií do určité doby. Růstem při chladničkové
teplotě se vyznačují např. listerie. Naopak meningokoky a gonokoky mají úzké pásmo
teploty růstu kolem 37 ◦
C, takže vznik nárůstu zachycených mikrobů při teplotě 20 – 25
◦
C vede k závěru, že izolát nepatří k uvedeným patogenům.
Pohyblivost může být chápána jako vlastnost související s růstem. Detekuje se na
půdách rosolovité konzistence (0,1 – 0,2% agaru), v nichž nepohyblivé mikroby vytvoří
masívní nárůst v místě očkování (půdy bývají ve zkumavkách a očkují se hlubokým
vpichem) a zbytek půdy je sklovitě čirý, zatímco pohyblivé se aktivně rozlézají půdou a
vyvolají její opalescenci až zákal. I pohyblivost může být limitována teplotou (nejčastěji
se testuje při 37 ◦
C, ale někdy má diagnostický význam různá pohyblivost při pokojové
a tělesné teplotě.
Růst v přítomnosti inhibujících látek často používaným testem u G- tyček je
růst v půdě s obsahem KCN. Některé koky a G+ bakterie se diagnostikují na základě rezistence
nebo naopak vnímavosti vůči některýcm antibiotikům nebo chemoterapeutikům.
Různé růstové nároky skupin mikrobů způsobují, že pro jednotlivé skupiny musí
být základ diagnostických půd různý, pro růstově náročnější skupiny bohatší, protože
jinak dojde k falešně negativním výsledkům (mikrob na půdě nenaroste a jeho vlastnosti
se neprojeví). V případě pochybností je nutné vyzkoušet na základu půdy, bez substrátu
a indikátoru, zda mikrob na takovéto půdě vůbec roste.
1.5.2 OF – test
Do bujonu s glukosou (tu jsou schopny zpracovat prakticky všechny organismy, které nějak
zpracují sacharidy) dáme indikátor změny pH a polovinu bujonů převrstvíme parafinovým
olejem. Testované kmeny vyočkováváme do jedné zkumavky bez oleje a jedné s olejem.
Pokud naočkovaný mikrob změní pH v obou zkumavkách, tak fermentuje i na vzduchu, i
bez, pokud jen ve zkumavce bez parafinu, potřebuje k metabolismu vzduch, pokud jen pod
olejem, pak je anaerobní a fermentuje. Pokud nezmění pH nikde a přitom roste (dělá se
zákal), patří mezi nefermentující organismy, které se určují podle speciálních testů. Pokud
není nárůst, může se jednat o organismus s vyššími nároky než splňuje náš bujon, nebo
natolik striktního anaeroba, že mu pouhé překrytí bujonu parafinovým olejem nestačí1
.
1
To bychom ovšem měli být schopni určit podle způsobu jeho zachycení.
8
1.5.3 Zkvašování cukrů
Zkvašování cukrů je obligátně detekováno na základě změny pH, indikátorem pH komponovaným
přímo do půdy. Protože existují biochemické alternativní cesty zkvašování,
přičemž při jedné vzniká paralelně s kyselými odpadními produkty plyn a ve druhé ne,
bývá u některých cukrů paralelně detekována tvorba plynu.
Nejčastěji se zkvašování provádí v živném bujonu, do něhož bylo přidáno 1% testovaného
sacharidu a indikátor pH (nejčastěji bromthymolová modř).
1.5.4 Rozklad některých látek
Rozštěpení močoviny Rozštěpením močoviny vzniká oxid uhličitý a amoniak. Výsledkem
je alkalizace půdy, detekovaná opět indikátorem pH.
Dekarboxylace aminokyselin Některé aminokyseliny jsou charakteristicky dekarboxylovány
jen určitými skupinami mikrobů, opět za vzniku alkaličtějšího pH. K diagnostickým
účelům jsou užívány především aminokyseliny arginin, lysin a ornitin.
Rozklad želatiny Klasické testy připravovaly směs živné půdy se želatinou na
Petriho misce. Po několika dnech kultivace (charakteristicky 5) se půda polila roztokem
sublimátu (HgCl2) ve vodě a narušená želatina se odlišila od nenarušené (mimo kolonie).
Později byly vyráběny želatinové disky s aktivním uhlím. Kultivovaly se v peptonovém
bujonu cca dva dny a v případě pozitivity (rozklad želatiny) se zatřepáním uhlí uvolnilo
a vytvořilo černý zákal. Protože tento test trvá velice dlouho, používá se jen výjimečně.
1.5.5 Tvorba některých látek
Tvorba sirovodíku je podmíněna přítomností vhodného substrátu (nejčastěji thiosíran
sodný). Detekce je možná solemi železa nebo olova. V obou případech vzniká šedé až
černé zabarvení, dané vznikem příslušného sirníku. Výrazný rozdíl je v citlivosti. Soli
železa zachytí výraznou produkci sirovodíku, zatímco octan olovnatý šedne i při malých
kvantech. Proto pro oba detekční systémy existují oddělené tabulky.
Tvorba indolu nepotřebuje nějaký speciální substrát, postačuje i peptonový bujon.
Pro indol bohužel neexistuje činidlo, které by se přidalo přímo do půdy, ale po ukončení
růstu do půdy (používají se bujony nebo rosolovité půdy) přidáme Ehrlichovo nebo
Kováczovo činidlo1
Neutralizace vznikajících kyselin tvorbu alkalických produktů je schopna zachytit
reakce s metylenovou červení po ukončení růstu.
Tvorba acetoinu signalizuje kvašení bez výrazné změny pH. Detekuje se Voges Proskaurerovou
reakcí po ukončení kultivace.
1.5.6 Utilizace některých látek
Utilizace některých organických látek je detekována jejich nabídkou jako jediného zdroje
uhlíku. Je užívána jednak utilizace organických kyselin, jednak některých cukrů.
Utilizace citrátu je detekována na půdě podle Simmonse, která má vybalancované
pH. Spotřebováním citrátové zložky z citrátu sodného se médium alkalizuje.
Utilizace cukrů je nečastěji detekována pomocí auxanogramů. Větší uplatnění než
u bakterií nachází u kvasinek. Agar na cukrové auxanogramy neobsahuje žádný zdroj uhlíku.
Je vylit na Petriho misce. Na jeho povrch je masívně rozetřena kultura, po vaschnutí
1
Složení je podobné, liší se především rozpouštědlem p-dimetylaminobenzaldehydu, v Ehrlichově činidle
je etanol (proto se mísí s vodou), v Kováczově amylalkohol (nemísí se s vodou). Dle mých zkušeností je
odečítání zbarvení Kováczova činidla snadnější.
9
inokula dáváme na povrch malé hromádky jednotlivých cukrů (na misku se jich vejde 6
- 7)1
Umístění cukrů si označíme na spodní straně misky. Po cca 5 – 7 dnech je vidět
kolem utilizovaných cukrů nárůst jako zakalení povrchu půdy.
U kvasinek lze podobným způsobem vytvářet auxanogramy na zdroje dusíku nebo i
některé vitamíny.
1.5.7 Rychlé a kompaktní testy
Pro některé vlastnosti byly vyvíjeny „rychlotesty“ už hluboko ve 20. století. Poslední
čtvrtina minulého století přinesla soustředění testů na kompaktní destičky, umožňující
současné určení celé baterie testů a u více kmenů současně. Uvedené sady jsou vyráběny
řadou výrobců2
v různých úpravách. Testy jsou zpravidla vyráběny pro konkrétní skupinu
(enterobakterie a příbuzné, g+ koky, g+ tyčky apod.). Bakterie se vyočkovávají masívně
(v některých případech je zapotřebí jejich předpěstování v čisté kultuře) ze suspenze
ve fyziologickém roztoku. Některé testy se zakapávají parafinovým olejem pro zajištění
mikroaerofilních podmínek. Na konci inkubace při 37 ◦
C se do některých testů přikapávají
činidla, která jsou součástí sady.
Vyhodnocením testů obdržíme pro „ruční práci“ číselný kód, který porovnáváme s
kódy v dodávaném manuálu. Další možností je nasazení výpočetní techniky, která nachází
nejlepší shodu výsledků s databází. V takovém případě je výsledkem často „nabídka“
více mikrobů s pravděpodobností vyjádřenou v procentech. V některých případech lze
dohledat i neprovedené testy, které by mezi nabízenými mikroby rozhodly.
Důležité je, že tabulky pro výše uvedené klasické testy a pro mikrotesty nejsou zcela
zaměnitelné, především klesá pravděpodobnost pozitivity některých testů pro pomaleji
metabolizující druhy, které pak na destičkách vycházejí negativní a v klasických testech
mohou být pozitivní. Nejsou ani zcela převoditelné sady a vyhodnocovací prostředky
(tabulky, počítačové programy) mezi různými výrobci.
1
Hromádky skutečně musejí být malé, tak 1 - 2 mm3
, jinak dojde k vytažení vody z agaru a rozlití
sirupovité kapaliny po jeho povrchu a slití jednotlivých nárůstů.
2
Na trhu se udržela i Lachema Brno, spolupracující s Českou sbírkou mikroorganismů, spadající pod naši
univerzitu.
10
Kapitola 2
Postupy práce
2.1 Elementární postupy (Postupy jsou popsány pro
praváka, levák je dělá zrcadlově.)
Kahan má proti přívodu plynu kohout K. Tím je regulována velikost plamene. Při jerho
dotažení zůstane hořet jen věčný plamínek VP na horní části kahanu. Přávod vzduchu
je řízen kruhovým uzávěrem V. Kahan zapalujeme při uzavřeném přívodu vzduchu a po
zapálení teprve přidáváme vzduch dle potřeby
11
Nejníže nad ústím kahanu je oblast, v níž je pouze plyn A. Zde je nejnižší teplota. S
ní sousedí oblast B, kde je naopak teplota plamene nejvyšší. V oblastíé C výše je teplota
plamene nižší.
12
2.1.1 Vypalování kličky
Kličku ručně vypalujeme vždy v poloze šikmo dolů, aby se částečně ožehla i kovová část
rukojeti B. Zrakem kontrolujeme její rozžhavení do rudého žáru. Poloha A je špatně,
protože je klička ve chladné oblasti plamene. Nedržíme ji vodorovně (poloha C), v tom
případě je její část v plameni kahanu příliš krátká. Polohu D používají některé automaty
na vypalování kliček. Je ± ekvivalentní poloze B.
2.1.2 Odebrání bakterií z bujonu / suspenze
Kličku namočíme do bujonu, aby byl ponořený celý zatočený konec. Při velkém objemu
bujonu (mimilitry) ji můžeme ponořit ihned po vypálení. Při malém objemu (kapka)
musíme nechat kličku několik sekund vychladnout, protože jinak bychom zahřáli kapalinu
až na teplotu neslučitelnou s přežitím vegetativních buněk.
13
Zkumavku s bujonem uchopíme do pravé ruky. Mezi malíček a dlaň sevřeme zátku a
vytáhneme. Odzátkovanou zkumavku uchopíme mezi palec a ukazováček a pravou rukou
s kličkou z ní můžeme nabírat.
Zazátkování provedeme buď v opačném gardu (zkumavku uchopíme tou rukou, v níž
držíéme kličku), nebo zkumavku postavíme do stojánku a zazátkujeme.
Je vhodné se před tímto manévrem, ještě než vypálíme kličku, přesvědčit o tom, že
zátka není připečená a pokud je, tak ji uvolnit oběma rukama.
2.1.3 Odebrání bakterií z pevné půdy
Vypálenou kličku nejprve ochladíme v holém (bez nárůstu) kousku půdy. Potom nabereme
kousek kolonie.
Pokud odebíráme z pevné půdy ve zkumavce (šikmý agar) postupujeme při jejím
otevírání a zavírání jako výše1
Petriho misku nejlépe položíme dnem vzhůru. Do levé ruky uchopíme dno misky,
zvedneme, otočíme, nabereme bakterie, hned misku položímer zpět na víčko. Tím se
redukuje riziko kontaminace kultury spadem ze vzduchu.
1
Není-li šikmý agar úplně zaschlý, je na dolním konci půdy kondenzovaná pára, která může vytéci ze
zkumavky stejně jako bujonová kultura.
14
2.1.4 Očkování na pevnou půdu
Na pevné půdě provádíme nejčastěji křížový roztěr (viz obrázek). Kousek kolonie rozetřeme
do 1 – 2 cm čárky při okraji misky. Poté kličku vypáléme. Ochladíme ji na místě
bez roztěru a křížem přes prvotní roztěr provedeme druhotný. Opět kličku vypálíme,
ochladíme a provedeme roztěr třetího řádu, případně stejně i čtvrtého.
Na šikmý agar ve zkumavce očkujeme „hadovitým“ roztěrem, který ukončujeme vpichem
do dolní části půdy (není-li to nějaká speciální půda, vyžadující zvláštní techniku
očkování).
Petriho misky i zkumavky otevíráme stejně jako misky a zkumavky s kulturou a
jen na nejkratší nutný okamžik, aby do nich nenapadaly vzdušné mikroby. Bakteriální
a kvasinkové kultury většinou kultivujeme víčkem dolů, vláknité mikroskopické houby
víčkem nahoru.
15
2.1.5 Očkování do bujonu
Zkumavky otevíráme jako zkumavky s kulturou a stačí ponoření kličky do bujonu.
2.1.6 Dekadické ředění
Nachystáme příslušný počet zkumavek. Obsahují 0.9 potřebného objemu. (Pokud se jedná
o neběžnější bakteriologické zkumavky, rozpiprtujeme do nich 4,5 ml roztoku, který používáme
k ředění (bujon, fyziologický roztok). Do první zkumavky přidáme 0.1 potřebného
objemu vzorku / kultury (nebo něčeho jiného, co ředíme). (V případě zkumavek po 4,5 ml
to bude 0,5 ml.) Obsah zkumavky dobře promícháme (několikerým nasátím do pipety a
vypuštěním), potom stejný objem přepipetujeme do následující zkumavky, promícháme,
přepipetujeme do další atd.
Naprosto stejně můžeme dělat i třeba binární ředění nebo ředění v jiném poměru,
nicméně dekadické se užívá zdaleka nejčastěji.
2.1.7 Aplikace mikroba na povrch půdy
Potřebné množství suspenze mikroba napipetujeme sterilně na povrch půdy (nejlépe
zhruba uprostřed) a sterilní hokejkou důkladně a opakovaně rozetřeme po celém povrchu.
Při aplikaci větších objemů necháváme někdy povrch půdy vyschout s pootevřeným víčkem
v neprašném prostředí (nejčastěji v termostatu).
2.1.8 Aplikace mikroba do agaru
Na střed prázdné misky napipetujeme potřebné množství suspenze (kultury apod.). Zalijeme
agarovou půdou ochlazenou na 45◦
C (teplejší by mohla usmrtit vegetativní buňky).
Krouživým pohybem opatrně rozmícháme (kritické je jednak dostatečné rozmíchání, jinak
vznikne „ostrov“ slitého nárůstu, jednak vylití kapalné půdy přes okraj misky.
2.1.9 Odečtení velikosti zóny inhibice růstu
Přes střed místa, kde byla aplikována testovací látka (střed disku, komínku, jamky) měříme
tři průměry od nejbližších vyrostlých kolonií na jedné straně k nejbližším vyrostlým
na straně protější, průměry svírají úhel cca 60◦
, z naměřených hodnot vypočteme průměr.
2.1.10 Odečtení počtu kolonií na misce
Na spodní straně dna Petriho misky si fixem na sklo děláme pod koloniemi značky, vždy
devětkrát tečku a jednou kolečko. Nakonec spočteme kolečka (desítky) a připočteme, co
nám zbylo do již nenamalovaného kolečka (jednotky). U velmi hustých nárůstů počítáme
16
jen na čtvrtině dna (rozdělíme kolmicemi před střed). Pokud se zjevně nevejdeme do
rozmezí 50 - 500 u bakterií a 50 - 150 u plísní, nemá většinou cenu počítat U menších
počtů je větší zátěž chybami v ředění apod., u velkých zase dochází k inhibici mikrobů a
tomu, že některé kolonie nenarostou do viditelné velikosti.
2.1.11 Šikmení agarů
Agar zpravidla již před sterilizací rozplníme do zkumavek. Po sterilizaci ještě tekutý
ukládáme do téměř vodorovné polohy (aby vznikla silně našikmená hladina), opřením o
vhodný předmět (ideální je tyčka cca 2 cm vysoká se zářezy na jednotlivé zkumavky). Po
ztuhnutí ukládáme do lednice nebo očkujeme.
2.1.12 Vylévání agaru na misku
Baňku s půdou uchopíme do ručníku nebo utěrky, držíme za smotanou látku. Misky
si připravíme do řady podle kraje stolu. Při vylévání vždy jen nadzdvihneme víčko a
vylejeme půdu (zpravidla odhadem). Pro nalévání přesného množství použijeme sterilní
odměrný válec. Vyléváme-li do skleněných misek, můžeme následně odstranit bubliny na
povrchu půdy jeho přejetím plamenem kahanu, na plastových to nejde.
Misky i agary vždy popisujeme – na jednotlivé kusy druh půdy a alespoň na balení
(sáček se zkumavkami nebo miskami) i datum.
2.2 Barvení podle Grama
Gramovo barvení představuje základní barvení v bakteriologii. Veškeré bakterie se dělí
na tři skupiny:
1. Gram pozitivní (G+) Mezi něž patří bakterie s poněkud jednodušší stavbou buněčné
stěny. Tato stěna obsahuje polysacharidy, které vytvářejí s gencianovou violetí
a jodem komplexy nerozpustné v etanolu (acetonu).
2. Gram negativní (G-) Tyto bakterie mají složitější stavbu buněčné stěny a obsahují
v ní více lipidů. Genciánová violeť se na ně nenaváže a vymyje se.
3. Gram nebarvitelné Několik málo skupin bakterií se nevybarví žádným z barviv
zahrnutých do tohoto barvení 1
a musí být zobrazovány pomocí velice speciálních
zobrazovacích postupů.
Gramovo barvení je důležité i pro diagnostiku, včetně rozhodování o tom, jaké další
kultivační a diagnostické postupy budou použity. Jeho bezpečné zvládnutí patří k základům
laboratorní práce v mikrobiologii.
Používá se k diagnostice čistých kultur, jednotlivých kolonií, i surového materiálu,
jako jsou výtěry z tělesných otvorů, vzorky patologických tekutin apod.
Urtčitá zkušenost je nutná nejen při barvení, ale i při vyhodnocování preparátů. Velmi
mladé a velmi staré kultury se mohou vybarvovat „Gram labilně“ (G±), tj. v preparátu
vidíme buňky G+ i G-, případně buňky strakaté.
Postup práce:
1. Preparát převrstvíme Gram I na dobu 20 sekund
2. Gram I slijeme, preparát splachujeme Gram II pokud se dělá zlatavá vrstvička, pak
necháme stát na preparátu do úhrnné doby 20 sekund
3. Kapeme na šikmo držené – položené sklíčko etylalkohol nebo aceton do té doby, než
přestane odtékat barva, resp do 20 – 30 sekund
1
A žádným z dalšách běžných barviv.
17
4. Opláchneme vodou
5. Přelijeme na 30 – 60 sekund Gram IV
6. Osušíme a prohlížíme
V mikroskopu můžeme vidět velké eukaryontníé buňky, i s více jádry (vpravo dole),
dvojité bakterie (diplokoky) vpravo nahoře, řádky různě velkých koků uprostřed a vlevo
nahoře i tyčinkovité bakterie (vlevo dole).
2.3 Acidoresistentní barvení
Barvení je založeno na principu tepelné fixace barviva do bakteriální stěny, která je tak
pevná, že vzdoruje i následnému vymývání kyselým etanolem (proto acidoresistentní)
Acidoresistentní barvení má především klinický význam. Historicky se používalo ke
hledání mykobakterií v klinickém materiálu (především Mycobacterium tuberculosis). To
má svůj význam i teď, protože kultivační a další techniky průkazu těchto bakterií mají
sice vyšší záchytnost, ale trvají déle (i několik týdnů), zatímco příprava a prohlédnutí
preparátu jsou otázkou desítek minut a v případě pozitivity je možné ihned zahájit cílenou
léčbu.
Vedle mykobakterií se acidoresistentně vybarvují i některé zralé askospory. Vhodným
modelovým objektem (i např. pro výuku na středních školách) jsou kultury Saccharomyces
cerevisiae (tedy kvasinek pekařského droždí), protože jde o nepatogenní organismus.
Kultury je nutno pěstovat cca týden na speciálním agaru, aby dobře vysporulovaly.
Postup práce: Preparát se doporučuje umístit na sklíčko k jednomu konci
1. preparát po tepelné fixaci převrstvíme karbolfuchsinem s fenolem, třikrát po sobě
zahříváme tak dlouho, až z něj začne jít pára, celkem 3 – 5 minut1
2. preparát se opláchne kyselým alkoholem (postup oplachování se stejný jako u Gramova
barvení)
3. preparát se opláchne vodou
4. preparát se převrství na 10 – 30 sekund roztokem malachitové zeleně
1
Tomuto postupu se říká „moření“.
18
5. znovu se opláchne vodou
6. osuší se stáním na hraně na teple
Moření preparátu
2.4 Barvení na pouzdra
Pouzdra (jejich přítomnost nebo nepřítomnost) mají diagnostický význam uvnitř některých
skupin bakterií (např. rod Klebsiella). Pouzdra se skládají ze slizovitých látek, které
se uplatňují v potravinářství. Zajišťují zahušťění výrobku a „mastnou“ chuť i u nízkotučných
výrobků.
„Školskou“ bakterií s pouzdry je Azotobacter sp., který patří k běžné půdní mikroflóře.
Jeho záchyt se provádí na speciálním agaru bez zdrojů dusíku (protože bakterie
je schopna využít dusík ze vzduchu, takže roste i zde, na rozdíl od konkurence). Tyto bakterie
jsou symbionty některých bobovitých rostlin a zajišťují jejich realtivní nezávislost
na přítomnosti sloučenin dusíku v půdě.
V zimním odobí, na něž toto praktikum připadá, bývají s izolací azotobakterů problémy
a izolace z květináčů od pokojových rostlin nebývá jistá.
Pro potřeby praktik jsme vyzkoušeli jako velmi dobrý model bakterie z povrchového
mazu sýrů (typu Zlato nebo Romadur) nebo syrečků.
Postup práce (původní, z literatury):
1. suspendovat kulturu v kapce destilované vody na sklíčku
2. přidat nigrozin (tuš)
3. tence rozetřít druhým sklíčkem
4. nechat zaschnout, protáhnout plamenem
5. barvit metylénovou modří s KOH 3 – 5 min
6. slít barvu a kapátkem ve vodorovné poloze dest. vodou opláchnout sklíčko, nechat ve
svislé poloze uschnout
V praxi se nám při práci s kulturami osvědčilo body 1 – 3 spojit a suspendovat kousek
kolonie v kapce tuše a kapku nakonec přímo kličkou rozetřít na větší plochu. Oplachování
(bod 6) je kritické v tom, že pokud je příliš razantní, vrstvička zaschlé tuše odplave i
s bakteriemi. Pouzdra jsou nejlépe viditelná na středně hustých místech preparátu jako
světlé (někdy narůžovělé) dvorce kolem modrofialově vybarvených buněk.
2.5 Barvení na spory
Sporotvorné bakterie mají značný význam v potravinářství, spočívající v tom, že spory
přežijí běžné konzervační postupy a mohou následně znehodnotit hotový výrobek nebo
polotovar. Tvorba spor za definovaných podmínek je rovněž cenným dignostickým zna-
kem.
19
Barvení na spory se užívá na detekci spor v bakteriální kultuře. Není možné ho
použít na detekci spor v běžných potravinách, leda by na nich byl natolik mohutný
nárůst, že by měl vlastnosti prakticky stejné jako čistá kultura.1
Na detekci jednotkových
počtů spor v obsahu konzervy mikroskopování užít nelze.
Spory jsou někdy vidět i v Gramově barvení jako odlišně vybarvené části buněk
(spora je G+, odumírající zbytek vegetativní buňky je G±). Případně vidíme větší zbytky
vegetativních buněk a mezi nimi menší spory.
Spora se na začátku svého vzniku vyznačuje odlišnou barvitelností. Na závěr může z
buňky vypadnout a zanechat po sobě nevybarvovanou díru.
Při barvení na spory se mohou spory vybarvovat s různou intenzitou v závislosti
na stádiu jejich vývoje. V preparátech, kde se spory teprve tvoří, vidíme zbarvenou část
buňky, ve velmi starých preparátech zase vidíme již jen spory, protože vegetativcní buňky
se rozpadly.
Postup práce
1. Připravit preparát z kultury, raději k jenomu konci sklíčka a fixovat
2. Přelít 5% roztokem malachitové zeleně a třikrát zahřívat do výstupu par, podobně
jako u acidoresistentního barvení
3. opláchnout vodou
4. přelít 5% roztokem eosinu
5. opláchnout vodou, osušit
1
Měl jsem možnost asi dvakrát v životě vidět konzervu – rybí maso v oleji, kde v oleji plavaly cca 2 – 3
mm velké kuličky, kolonie bakterií, které obsah konzervy znehodnotily.
20
Kapitola 3
Receptury
Přestože většinu barviv a půd lze v dnešní době nakoupit jako komerční produkty, uvádím
složení alespoň některých. Úplně všechny z uvedených materiálů se běžně nedají nakoupit
a navíc je vhodné v případě nějakých „záhadných“ problémů porovnat se zakoupeným
výrobkem výrobek vlastní, vyrobený ze základních surovin.
3.1 Receptury barviv
Metylénová modř s KOH. Smísíme
1. Nasycený roztok metylénové modři v etanolu1
30 ml
2. Destilovaná voda 99 ml
3. Vodný roztok KOH 1%
Metylénová modř pro vitální barvení. Odvážit přesně 10 – 20 mg (na desetiny
mg) metylénové modři, rozpustit ve vodě (cca 5 × ml, kolik bylo mg metylénové modři),
po rozpuštění a filtraci přidat vodu tak, aby výsledný objem roztoku byl desetkrát tolik
mililitrů, kolik bylo metylénové modři miligramů.
Barvení podle Grama
1. Gram 1
• Krystalová nebo genciánová violeť 5 g + 96% etanol 200 ml
Nechat stát přes noc v termostatu v dobře uzavřené láhvi, druhý den zfiltrovat
a přidat:
• 1% roztok šťavelanu amonného v dest. vodě 800 ml
2. Gram 2 (solutio Lugol)
• Jód 1 g + 1% roztok KJ v dest. vodě 200 ml
Lugolův roztok je nestabilní na světle, nelze ho delší dobu (týdny) uchovávat
v plastových lahvičkách.
3. Gram 3
Spiritus cum benzino nebo aceton2
4. Gram 4
2,5% roztok safraninu v 96% etanolu 10 ml + dest. voda 100 ml
Barvení podle Ziehl – Neelsena
1. Karbolfuchsinový roztok:
• Komponenta a: 10g fuchsinu rozpustit v 100 g (!) 96% etanolu
• Komponenta b: 50g krystalického fenolu rozpustit ve 200 ml dest. vody a po
rozpuštění doplnit na 1000 ml
Po filtraci obou komponent smísit 1 díl a a 9 dílů b
1
Stačí Spiritus cum benzino, nasycený roztok vznikne tak, že ve směsi rozpouštědla a rozpouštěné substance
zůstává část substance trvale nerozpuštěna.
2
Vzhledem k razantnímu zdanění (a tím i zdražení) i denaturovaného lihu vychází aceton nyní levněji.
21
• Kyselý alkohol1
• HCl 25% 3 ml
• etanol 96% 97 ml
2. Roztok malachitové zeleně
1,2% roztok malachitové zeleně ve vodě
Barvení na pouzdra
• Roztok nigrozinu: nigrozin 10 g + voda dest. 100 ml
Místo originální receptury se nám více osvědčuje rýsovací tuš
• Metylénová modř s KOH (viz výše)
Barvení na spory
• 5% roztok malachitové zeleně ve vodě
• 5% roztok eosinu ve vodě
3.2 Receptury půd
Půda pro Paramecium caudatum
Pšeničné zrno v bakt. zkumavce přelijeme 10 ml vodovodní vody, necháme nabobtnat
a autoklávujeme 20 min. při 1 atmosféře. Očkujeme semisterilně – v kultuře jsou zároveň
bakterie, kterými se Paramecia živí. Kultivujeme při teplotě 24 – 30 ◦
C.
Půda pro Eugleny a Tetrahymeny
2% roztok peptonu ve vodovodní vodě, rozplnit do zkumavek po 10 – 15 ml a autoklávovat
30 minut při 1 atm., pokud potřebujeme urychlit růst, přidáme 0,05-0,1%
kvasničného autolyzátu (nebo sušeného droždí).
Ashbyho agar pro Azotobacter
Manitol 10g
NaCl 0,1g
CaSO4 0,1g
K2HPO4 0,2g
MgSO4 bezv. 0,2g
rozpustíme v litru dest. vody, v roztoku necháme nabobtnat 20g agaru před autoklávováním
přidáme 5g CaCO3, autoklávujeme 15 min. při 1 atmosféře, před vyléváním
důkladně mícháme, aby se CaCO3 suspendoval rovnoměrně do všech misek.
Půda je selektivní pro baktérie přijímající vzdušný dusík, po vyočkování hlíny (v
zimním období raději z květináčů) vyrostou především azotobactery. Kultivace při 30 ◦
C,
trvá týden.
Acetát askosporový agar
Octan draselný 10,0g
Glukóza 1,0g
Kvasničný autolysát 2,5g
agar 30,0g
Voda 1000,0 ml
1
Existují různé varianty, původní receptura obsahovala kyselinu sírovou a etanol 1:1, některé příručky
uvádějí ještě přídavek NaCl (5%).
22
Octan draselný, kvasničný autolyzát a glukózu rozpustíme ve vodě. Přidáme agar,
necháme nabobtnat (cca půl hodiny) a autoklávujeme 15 min. při 1 atmosféře.
Kvasinky pekařského droždí vytváří spóry po cca týdenní kultivaci při teplotě 30 ◦
C.
Urea - H2S - Pb acetát
Pepton 0,5 g
Enzymatický kaseinový hydrolyzát 0,5 g
NaCl 0,5 g
Bromthymolový indikátor 1,5 ml
Agar 1,5 g
Voda do 95 ml
Autoklávovat, současně autoklávovat 2 g urey v lahvičce a 5 ml vody v jiné lahvičce
a 0,1 g glukózy v další lahvičce. Sterilní vodou po autoklávování obojí rozpustit a sterilně
přidat do roztoku, dále přidat 0,8 ml Na2S2O3 25% roztok a plumbum aceticum 0,8 ml
10 % roztok. pH upravit sterilním roztokem NaOH na „semaforovou zeleň“.
Pufrovaný fyziologický roztok pro pomnožení Yersinia enterocolitica dle dr.
Aldové
Na2HPO4 . 12 H2O 18,1 g
KH2PO4 1,83 g
NaCl 8,5 g
Voda do 1000 ml
Rozplnit po 5 ml do bakteriologických zkumavek - pH zkontrolovat a upravit na 7,2.
Autoklávovat při 120 ◦
C 30 min.
Kultivovat v lednici, vyočkovávat z pufru 1., 2. a 3. týden (je možné zachytit pozitivní
růst i po dvou předchozích neúspěšných vyočkováních) na DC agar, ten kultivovat 48 hod.
při pokojové teplotě. V pufru ale mohou růst i jiné G- tyčky!
Stanovení štěpení lysinu nebo argininu nebo ornithinu
Pepton 0,5 g
Beef extract 0,5 g
Roztok bromkresolové červeně 1:500 v etanolu 0,5 ml
Roztok kresolové červeně 1:500 v etanolu 0,5 ml
Pyridoxin (=vitamin B6) 0,5 mg
Glukóza 0,05 g
Voda do 100 ml
Smísit, vařit a filtrovat přes filtrační papír.
Následně přidat 1% (W/V) l-lysinu (dihydrochlorid) nebo l-argininu (monohydrochlorid)
nebo l-ornithinu (dihydrochlorid). pH upravitna 6 a rozplnit po 0,5 ml do sterilních
mikrozkumavek (sérovky, velké plynovky), převrstvit 0,25 ml parafinového oleje a sterilizovat
15 minut v autoklávu.
Masívně inokulovat. Pozitivní je přechod ze žluté do rudofialové.
MIU - pohyblivost, indol, močovina
Trypton (nebo enzymatický kaseinový hydrolyzát) 30 g
NaCl 5 g
KH2PO4 2 g
Agar 3 g
Voda do 1000 ml
23
Rozvařit, pH upravit na 6,9 a přidat 2 ml 0,2% roztoku fenolčerveně. Ze zásobního
roztoku odlít 50 ml a po schladnutí na 50 ◦
C přidat 50 ml 20% roztoku urey (močoviny)
ve vodě sterilního, rozplnit do do sterilních zkumavek.
Očkuje se hlubokým vpichem. Pohyblivost se posuzuje: Růst jen okolo vpichu, nebo difúzní
zákal, zčervenání znamená štěpení urey, produkce indolu se testuje na závěr (kultura
se tím usmrtí) přilitím Ehrlichovým nebo Kovaczovým činidlem. Tato činidla nabudou s
indolem do několika minut červenou až červenofialovou barvu.
Peptonová voda
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Voda 1000 ml
Rozvařit, rozplnit do zkumavek a autoklávovat.
Lze použít pro stanovení produkce indolu, na umístění želatinových disků (rozklad
želatiny), přidáním 1 % sacharidu a bromthymolového indikátoru získáme bujon pro
stanovení zkvašování cukrů vhodný pro růstově méně náročné členy skupiny Enterobac-
teriaceae
Bujon pro fermentaci sacharidů
Živný bujon 100 ml
Bromthymolový indikátor 1,5 ml
Sacharid 1 g
Jako „živný bujon“ lze vzít peptonovou vodu, peptonovou vodu obohacenou 0,5 – 1
% masového extraktu, komerční živný bujon apod.
Bujony se sacharidy nelze autoklávovat, musejí se sterilizovat frakcionovaně v proudící
páře. Druhou možností je přídavek sterilního roztoku sacharidu o vyšší koncentraci (10
– 20 %), který lze autoklávovat (nebo sterilizovat filtrací). Přídavek sterilního roztoku
sacharidu do sterilního bujonu je nutno technicky dobře zvládnout!
Agar s octanem olovnatým
Živný bujon 1000 ml
Agar 15 g
Plumbum aceticum Pb(CH3COO)2.3H2O 1 g
Voda destilovaná sterilní 6 ml
Druhou složku přidáme do první, sterilizujeme, vlejeme třetí rozpuštěnou ve čtvrté,
rozplníme do zkumavek po 3 ml a necháme ztuhnout. Očkujeme vpichem, zešednutí až
zčernání znamená produkci sirovodíku.
Přidáním sterilního roztoku 20 g urey a 1 g glukózy a 1,5 ml bromthymolového indikátoru
získáme půdu, v níž vedle produkce sirovodíku detekujeme štěpení urey (zmodrání
půdy).
Sterilní roztoky octanu olovnatého a urey s glukózou můžeme připravit frakcionovanou
sterilizací, bromthymolový indikátor můžeme přidat k bujonu.
Agar podle Hajny
Tento agar existuje v různých úpravách, jeho podstata je však vždy stejná: Laktóza a
sacharóza v množství detekujícím jejch zkvašování, malý přídavek glukózy (pro lepší růst
bakterií), thiosíran sodný jako substrát pro tvorbu sirovodíku a sůl dvojmocného železa
jako indikátorový systém pro sirovodík.
24
Agar 15 g
Pepton 20 g
NaCl 5 g
Voda 1000 ml
Laktóza 10 g
Sacharóza 10 g
Glikóza 1 g
Na2S2O3.5H2O 0,2 g
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g
1% roztok fenolčerveně 2,5 ml
Klasická receptura sterilizuje směs prvních čtyř látek a následně frakcionovaně sterilizuje
hotový výrobek; komerční půdy (např. TSI agar) lze zpravidla autoklávovat. Vylévá
se do zkumavek do vyšší vrstvy a šikmí, očkuje se jako šikmý agar a následně vpichem
až ke dnu zkumavky. Zežloutnutí značí zkvašování laktózy nebo sacharózy, trhání půdy
kolem vpichu zkvašování s tvorbou plynu, černání tvorbu sirovodíku.
Půda se používala jako rychlý orientační test na salmonely, které nezkvašují uvedené
sacharidy a tvoří sirovodík. Se zvyšováním podílu atypických salmonel, které mohou laktózu
nebo sacharózu zkvašovat, a poklesem potřeby detekovat Salmonella typhi, která na
této půdě roste typicky (červená se zčernáním) význam této půdy poklesl a používá se
spíše jen na detekci tvorby sirovodíku.
Agar pro stanovení utilizace citrátu
NaCl 5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
K2HPO4 1 g
NH4H2PO4 1 g
Agar 20 g
Voda dest. 1000 ml
Po rozpuštění uvedených solí ve vodě přidáme 40 ml 0,2% roztoku bromthymolové
modře, 5 g citronanu sodného, promícháme, rozplníme do zkumavek, frakcionovaně sterilizujeme
a šikmíme. Test vyšaduje velmi masívní vyočkování.
25
3.3 Receptury činidel
Bromthymolový indikátor
1g bromthymolové modře do 16 ml 0.1N NaOH, rozpustit, přidat vodu do objemu
500 ml dát na 24 hodin do termostatu (případně poté zfiltrovat)
Běžně dávat 1,5ml do 100 ml půdy.
Ehrlichovo činidlo
p-dimethylaminobenzaldehydum 5 g
HCl koncentrovaná 25 ml
Etanol (stačí lihobenzin) 75 ml
Smísit, uchovávat potmě.
Kovaczovo činidlo
p-dimethylaminobenzaldehydum 2,5 g
HCl koncentrovaná 15 ml
Amylalkohol 75 ml
Smísit, uchovávat potmě.
26