Prietoková cytometria a stanovenie
lymfocytárnych subpopulácií
Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz)
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Rozdelenie imunologických laboratórnych metód
serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok,
Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens
bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov
Cluster Designation (Cluster of Differentiation)
• Bunky exprimujú (vystavujú) na svojom povrchu rôzne špecifické
molekuly – znaky, ktoré môžeme usporiadať do skupín charakterizujúcich
bunečnú líniu, stav diferenciácie jednotlivej bunky a jej aktiváciu
• CD klasifikácia: znak definovanej štruktúry rozpoznateľný monoklonálnou
protilátkou je zaradený do skupiny diferenciálnych CD znakov a označený číslom
(CD1, CD2, CD3,...). V súčasnej dobe je na ľudských leukocytoch
charakterizovaných asi 400 znakov.
• Využitie:
- označenie plne definovaných molekúl
- členenie podľa funkcie
- adhézne membránové molekuly, receptory pre cytokíny, molekuly na T a B
lymfocytoch, trombocytoch a ďalších bunečných populáciách
B lymfocyty
• CD19
• CD20
7-23 %
CD19
Iga Igb
(Warnatz K, Schlesier M 2008)
T lymfocyty
• CD3 – všetky T lymfocyty 58-85 %
CD4 – TH (TH1, TH2)
30-60 %
CD8 – TC
15-35 %
http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tc
ell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm
Monocyty
• CD14
• HLA DR
0-10 %
- súčasť nešpecifickej imunity
- schopnosť fagocytózy
- tkanivová forma = makrofág
NK bunky
• CD16+
• CD56+
• CD3-
6-20%
- rozpoznávajú bunky, ktoré majú na povrchu abnormálne málo MHC I (= nádorové
a vírom infikované bunky)
- používajú cytotoxické mechanizmy (perforin, granzymy)
- Pozn. NKT bunky: CD16+ CD56+ CD3+
Pre stanovenie lymfocytárnych subpopulácií
→ odber krvi do skúmavky s EDTA
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
30min.
inkubácia
tma
lab. teplota
pretrepat
Monoklonálne protilátky
• produkt jediného klonu B lymfocytov (klony vzniknuté
fúziou buniek produkujúcich Ab a myelomových
buniek, ktoré schopnosť produkcie vlastného Ig ztratili)
• totožné a prísne špecifické proti jednému epitopu
Lýza erytrocytov
• Roztok A: 1,5 l destilovanej vody – 1,8 ml
99% kyselina mravenčí
• Roztok B: 1,5 l destilované vody 9,0 g
bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g
bezvodého Na2SO4
• Roztok C: 1,5 l PBS (pH 7-7,4) – 15 g
paraformaldehydu
Prietoková cytometria (Flow Cytometry, FACS)
Flow+cyto+metria = „meranie buniek v pohybe“
• Možnosť analýzy mnohých vlastností a charakteristík na úrovni jednej bunky
počas krátkeho časového úseku
• Meranie súčasne viac než 25 markerov na jednej bunke
➢Určovanie fenotypu buniek
➢Monitorovanie odpovede na liečbu
➢Výskum signalizačných dráh
• Kľúčový nástroj pre výskum porúch krvotvorby
Prietoková cytometria je technológia umožňujúca súčasné meranie a
analýzu niekoľkých fyziálnych a chemických vlastností jednotlivých
častíc, ktoré sú unášané v prúde kvapaliny a prechádzajú lúčom svetla
Využitie
• Klinické využitie – imunofenotypizácia
• Bunečná biológia – DNA, RNA analýza
• Mikrobiológia – rezistencia na ATB, kinetika
Čo meriame???
• Odrazené svetlo a emitovanú fluorescenciu
• Častice veľkosti 0,2-150 µm
- prokaryotické a eukaryotické bunky
- virové častice, baktérie, huby
- komplexy Ag-Ab
Princíp FACS
• Pri prechode častíc laserovým lúčom dochádza k rozptylu svetla a k fluorescencii
naviazaných fluorochrómov
• Svetelné signály sú prevedené na elektrické pomocou detektorov (PMT)
• Na každej bunke je možné zmerať niekoľko parametrov zároveň
• Namerané dáta sa ukladajú a ďalej analyzujú
Tri hlavné systémy
Fluidný systém
transport častíc k laserovému lúču
Elektronický systém
prevod detekovaných svetelných
signálov na signály elektronické,
vyhodnocované počítačom
Optický systém
laser, zrkadlá,
optické filtre
Fluidika
Transport častíc v prúde nosnej kvapaliny k laserovému lúču
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
Hydrodynamická fokusácia
Vzorka Vzorka
Nízky tlak vzorky
Úzky prúd vzorky
Vhodné pre DNA analýzu
Vysoký tlak vzorky
Široký prúd vzorky
Nevhodné pre DNA analýzu
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
Optika
• Excitačná optika
laser a systém šošoviek,
ktoré zaostrujú a smerujú
laserový lúč
• Zberná optika
sústava šošoviek, ktorá
vedie a rozdeľuje svetlo do
rôznych vlnových dĺžok na
príslušné detektory
excitácia Ar-iontovým laserom (modrý) - 488 nm
FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm)
PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm)
ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm)
PerCP - perridin chlorophyl (678 nm)
PerCPCy5.5 - (696 nm)
PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm)
PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm)
excitácia He-Ne laserom/red diode (červený) - 633 nm
APC - allophycocyanin (670 nm)
APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm)
excitácia UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm
Pacific Blue (452nm),
BV421 (421 nm)
BV510 (510nm)
Optické filtre
Long Pass (LP)
Prepúšťa všetky dĺžky vyššie
ako špec. vlnová dĺžka
Short Pass (SP)
Prepúšťa všetky dĺžky
kratšie ako špec. vlnová
dĺžka
Band Pass (BP)
Prepúšťa špecifické
rozmedzie vlnových dĺžok
500LP 500SP 500/50
500±25
Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013
Dichroické filtre – umiestnené pod uhlom 45°
– časť svetla odráža pod uhlom 90°, časť prepúšťa
Elektronika
• Svetelné signály sú prevádzané na elektrické
• Detektory:
- diódy: FSC
- fotonásobiče PMT (PhotoMultiplierTube): SSC a fluorescencie
Vznik napäťového pulzu
Výška:
maximálna hodnota fluorescencie alebo scatteru
Plocha:
Integrál pulzu
Šírka:
Čas trvania pulzu
Veľkosť vs. granularita
• Light scatter: prechádzajúca častica vychýli dopadajúce žiarenie
Forward Scatter (veľkosť)
Side Scatter (granularita)
FSC vs. SSC
Lymfocyty
Granulocyty
Monocyty
RBC, debris,
mrtvé buňky
veľkosť
FSC
SSC
granularita
Diferenciálny rozpočet
Fluorescencia
Veľa buniek má rovnakú alebo podobnú morfológiu
- monoklonálne Ab značené fluorochromom špecifické k určitému epitopu
Fluorochromy
• Sú excitované vhodnou vlnovou dĺžkou
• Emitujú svetlo špecifickej vlnovej dĺžky
• I neznačené bunky môžu byť fluorescenčné vďaka slabej
autofluorescencii
Fluorochromy
• Polycyklické organické molekuly a ich deriváty
- Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, rada Alexa, Pacific a
Cascade
- AmCyan, Propidium Iodide, 7-AAD, CFSE
• Fluorescenčné proteíny
- Phycoerythríny (PE), Allophycocyaniny, PerCP, GFP,...
• Quantum Dots
Schopné absorbovať fotóny budiaceho žiarenia (napr. 488 nm) a následne (10-8 s)
emitovať fotóny s dlhšou vlnovou dĺžkou (nap. 500 – 800 nm). Fluorescenčné
žiarenie má teda inú farbu.
Intenzita
fluorescencie
Emisné
spektrá
Prekrytie spektier
• Fluorochromy typicky emitujú svetlo v širokom spektre vlnových dĺžok
• V závislosti na usporiadaní filtrov, detektory môžu zachytiť fluorescenciu od iných
fluorochromov, ktoré sú detekované v iných kanáloch (priesvit, prekrytie)
Prekrytie spekter
Vlnová dĺžka
Intenzitafluorescencie
Kompenzácie
• Priesvit je treba „kompenzovať“, tak aby detektor zaznamenal signál 1
fluorochromu
http://www.cytometry.org
Treshold (prah)
• Detektory sú extrémne citlivé = detekujú signály z rôznych zdrojov – prach, malé
častice, debris
• Eliminácia = treshold
• Nastavenie na jednom parametre (FSC)
Amplifikácia a
digitalizácia signálu (ADC
prevodník)
Analýza- pre každú bunku
hodnoty všetkých
parametrov
Analýza nameraných
dát
Dáta v LIST MODE FILE
Analyzačný softvér
Kaluza; Infinicyt; DiVa; FlowJo;
Summit
Vytvorenie štatistík
Výhody a nevýhody prietokovej cytometrie
Výhody
• Veľké množstvo analyzovaného
materiálu – veľké množstvo dát
• Analýza trvá niekoľko minút
• Kvalitatívna + kvantitatívna analýza
• Možné manipulačné operácie- napr.
triedenie buniek s vybranými
vlastnosťami (cell sorting)
Nevýhody
• Vysoká finančná náročnosť
• Zostavenie experimentu, analýza a
vyhodnotenie dát závislé na
skúsenostiach obsluhy
• Analýza vzoriek čo najskôr po odbere
• Nevidíme lokalizáciu signálu na bunke
Krvný diferenciál
Skúmavka A
Skúmavka B
Hodnotenie výsledkov
• Lýza
• Prítomné všetky MPL → boli pridané? ; pacient? ; liečba?
• Kompenzácie
• Gatovacia stratégia
• Hodnoty v norme
zvýšené/znížené →opakovať, doplniť, potvrdiť
Stanovenie absolútneho počtu lymfocytárnych
subpopulácií
Počet Leukocytov 3,6-10 x109l
Lymfocyty 20-55 %
Monocyty 0-10 %
Granulocyty – neutrofily, eosinofily, bazofily 37-75 %
Príklad: relatívny počet abs. počet
Leukocyty 5 x109l Lymocyty: 20% 1,0 x109l
CD3: 75% 0,75 x109l
CD19: 10% 0,1 x109l
CD15,56: 15% 0,15 x109l
Vyšetrenie lymfocytov periférnej krvi
ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA
LYMFOCYTECH PERIFERNÍ
KRVE (%)
CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos
signálu
58-85
CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II,
aktivace
30-60
CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I,
aktivace
15-35
CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23
CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor
adheze
6-20
HLA-DR B-lymfocyty, monocyty,
aktivované T-lymfocyty
MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na
všech B-lymfocytech),
T-lymfocyty 3-7
(na aktivovaných T-lymfocytech)
Hodnotenie nálezu jednotlivých subpopulácií
Snížení/
zvýšení
subpopulace onemocnění

CD19+, CD3+,
CD4+, CD8+
při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)
 CD19+ u některých pacientů s CVID
 CD19+ B – buněčná leukémie
 CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi
 CD3+ T – buněčná leukémie
 CD4+
u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable
immunodeficiency)
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
 CD4+ autoimunity, alergie
 CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systémový lupus erythematodes-SLE)
 CD8+
u některých pacientů s CVID
- virové infekce (EBV, CMV, HIV)
Príklady využitia FACS v praxi
Zdravá osoba
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 71 (58-85)%
•CD3+ 4+: 46 (30-60)%
•CD3+ 8+: 21 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 11 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 16 (6-20)%
46% 21%
11% 16%
71% 71%
Vplyv infekcie
Bakteriální infekce
• Počet leukocytů:  Th: CD3+ 4+: 
• Lymfocyty:  Monocyty: CD14+HLA DR+ : 
• Granulocyty: 
Virová infekce
• Počet leukocytů:  Tc: CD3+ 8+: 
• Lymfocyty:  CD3+8+HLA DR+ : 
• Granulocyty:  CD3+8+38+ : 
Bronchoalveolárna laváž (BAL)
Prevrátený pomer CD4+/CD8+ = podozrenie na sarkoidózu
Pacientka: Ž, *1957
Pacientka z reumatológie – liečba napr.
rituximabom spôsobuje depléciu B
lymfocytov (po 4-6 mesiacoch návrat k
normálnym hladinám)
SCID
Leu : 5,0x109/l
Ly: : 4,0x109/l
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 14 (58-85)%
•CD3+ 4+: 8 (30-60)%
•CD3+ 8+: 2 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 71 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 13 (6-20)%
8% 2%
71% 13%
14%
14%
Pacient: M, *1966
Leukémia
vyšetrenie CD5+CD19+ buniek
CD5+CD19+
CD5+CD19+ : 94.8%
Pacient: M, *1999
obrátený pomer CD4/CD8!
CD4+ 13,2%
CD8+ 50,9%
virová infekcia???
CD8+CD38+ 83,2%
CD8++CD38++ 92,2%
EBV infekce
DiGeorgův syndrom
• Embryonálna porucha – narušenie vývoja v oblasti 3. a 4. embryonálního oblúka
• Abnormality v arteriálnom obehu, srdci, jícne a čeľustiach
• Porucha vo vývoji thymu – znížené zastúpenie T lymfocytov
DiGeorgův syndrom
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 40 (58-85)%
•CD3+ 4+: 22 (30-60)%
•CD3+ 8+: 4 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 22 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+ : 36 (6-20)%
22% 4%
22% 36%
40% 40%
X-viazaná agamaglobulinémia
• Mutácia v géne kódujúcom Brutonovu tyrosinkinázu – důležitá pre diferenciáciu B
lymfocytov
• Ženy prenášačky, manifestáciu u mužov
• Dochádza k zastaveniu vývoja B lymfocytov
• Neprítomnosť B lymfocytov v krvnom riečišti
X-viazaná agamaglobulinémia
T LYMFOCYTY
•CD3+ : 59 (58-85)%
•CD3+ 4+: 41 (30-60)%
•CD3+ 8+: 15 (15-35)%
B LYMFOCYTY
• CD19+ : 0 (7-23) %
NK LYMFOCYTY
•CD16,56+: 34 (6-20)%
41% 15%
0%
34%
59% 59%
HLA-B27
asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou
záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a
šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a
spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé
systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc).
negativní pozitivní
Test aktivace bazofilů (bazotest)
funkční test umožňující vyšetření aktivace basofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro
na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE)
- CD203c
založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na
povrchu periferních bazofilů po jejich expozici
alergenem in vitro
ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní)
- sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno)
Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů
Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění.
Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je
zprostředkovaná protilátkami IgE.
IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace.
Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k
aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace
bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c
na aktivovaných bazofilech.
Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno