Imunoelektroforéza Imunofixace Mgr. Julie Štíchová ÚKIA-FNUSA Klasická elektroforéza - screening • Separace proteinů na základě rozdílné pohyblivosti v el. poli • Médium – agarózový gel • pH = 8,6 → anodická pohyblivost (většina proteinů izoel. bod kolem pH 5 - 6) • Rozdělení do 5 základních frakcí • Odečítání – většinou denzitometrie • Imunologie – zájem o gamafrakci Pozn. Detailní princip elektroforézy lze najít v učebnicích klinické biochemie nebo instrumentální techniky Klasická elektroforéza - screening ↓ ↑ ↑ ↑ Nevýhoda – detekce pouze velkých změn v proteinových frakcích Zánět Hypergamaglobulinemie (monoklonální gamapatie) Hypogamaglobulinemie ↓ ↓ ↑↑ Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů • Vyšetřovaný materiál: sérum, moč, likvor Hyperproteinémie: • Zánět • monoklonální gamapatie (v moči – Bence-Jonesova bílkovina) • chronické dlouhotrvající infekce (zvýšená syntéza imunoglobulinů) Hypoproteinémie - většina chorobných stavů: • porucha syntézy bílkovin v játrech • nadměrné ztráty – nefrotický syndrom (vyšetření moči – zvýšené koncentrace bílkovin) • poruchy výživy – malnutrice • poruchy trávicího traktu – maldigesce a malabsorpce – nespecifické střevní záněty (Crohnova choroba, ulcerózní kolitida) • Rozsáhlé popáleniny • Hyperhydratace – dochází k naředění bílkovin séra – těhotenství (fyziologicky), nevhodně podaná infuze Využití elektroforézy v klinické praxi screening chorobných stavů Likvor (CSF) + sérum (S) současně • Izoelektrická fokusace: kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů • Intratékální syntéza protilátek v centrálním nervovém systému pochází z perivaskulárních infiltrátů B lymfocytů, které lokálně proliferují, dozrávají v plazmocyty a produkují příslušné protilátky • Diagnostika roztroušené sklerózy – průkaz oligoklonálních pásů v likvoru (pozitivita až v 98% případů) • Obrázek vpravo: oligoklonální pásy jsou přítomny pouze v likvoru (CSF), zatímco v séru chybí – jedná se o intratékální syntézu Ig – tento nález je pro roztroušenou sklerózu poměrně typický Modifikace elektroforézy • Zvýšenou (i sníženou) koncentraci gamaglobulinů je nutno vždy dále došetřit • Metody kvalitativní • Imunolektroforéza (dle Graba a Williamse) • Protisměrná elektroforéza • Metody kvantitativní • Raketková imunoelektroforéza (dle Laurella) • Dvourozměrná elektroforéza Tyto metody jsou v dnešní době zastaralé a využívají se pouze výzkumně (pocházejí z dob, kdy nebyl znám proces výroby monoklonálních protilátek a používala se tedy pouze polyklonální směsná antiséra) Pozn. Pro účely zkoušky je třeba důkladně znát klasickou elektroforézu, imunofixaci a imunoblot, ostatní metody jsou pouze rozšířením znalostí. Imunoelektroforéza • 2 fáze: 1) Rozdělení proteinů klasickou ELFO 2) Aplikace antiséra do podélně vykrojeného žlábku → difuze do gelu • V místě ekvivalentní koncentrace obou složek se vytvoří obloukovitá precipitační linie Imunoelektroforeogram normálního lidského séra • Použito polyspecifické antisérum → až 35 precipitačních obloučků (každý oblouček = 1 protein) • Obloučky mají charakteristický tvar a umístění na imunoelektroforeogramu vzorek vzorek Imunoelektroforegram normálního lidského séra: žlábek a polyspecifické antisérum proti lidským sérovým proteinům žlábek b monospecifické antisérum proti IgG žlábek c monospecifické antisérum proti IgM žlábek d monospecifické antisérum proti IgA http://biochemie.upol.cz/doc/skripta/imch/8.%20Imunoelektroforeza.pdf Nevýhody: • Okometrické odečítání • Výsledky pouze kvalitativní • Nutná zkušenost odečítajícího – různé monografie, atlasy Protisměrná elektroforéza • Imunodifuze urychlená el. polem (výsledek za 30 min) • Využívá opačných pohybů Ag a Ab v el. poli • 2 jamky • Jedna blíže anodě – pipetujeme protilátku • Druhá blíže katodě – pipetujeme antigen • V el. poli se bude antigen pohybovat k anodě a protilátka ke katodě → v místě ekvivalentní koncentrace obou složek se tvoří precipitát • Kvalitativní průkaz antigenů s anodickou pohyblivostí Raketková imunoelektroforéza • Umožňuje kvantitativní hodnocení, citlivost od 0,1 mg/l • Imunodifuze probíhající v el.poli • Rozdíl od předchozí metody – protilátka (antisérum) se přimíchá do agarózového gelu • Migrace proteinů – střetávají se s molekulami protilátky v gelu – v místě ekvivalentní koncentrace obou složek se tvoří precipitát • Díky pohybu proteinů získává tvar píku – „raketky“ Raketková imunoelektroforéza Dvourozměrná (2D) elektroforéza • Kombinace elektroforézy s raketkovou imunoelektroforézou • Krok 1: klasická elektroforéza séra • Krok 2: Po ELFO slouží gel s rozdělenými proteiny jako start elektroimunodifuze – gel se otočí kolmo a k němu se doplní nový gel (obsahující polyvalentní antisérum) → elektroimunodifuze probíhá ve směru kolmém na gel se separovanými proteiny • Vznik píků, jejichž plocha / výška je úměrná koncentraci daného proteinu • Poloha píku charakterizuje druh antigenu • Lidské sérum – touto metodou lze stanovit až 50 různých proteinů Dvourozměrná (2D) elektroforéza Imunofixace • Použití: • Identifikace paraproteinu- sérum, moč a likvor • paraprotein = monoklonální imunoglobulin • produkován 1 klonem B-lymfocytů • stav, kdy má pacient v séru paraprotein se nazývá paraproteinémie nebo monoklonální gamapatie Monoklonální gamapatie • Onemocnění s výskytem monoklonálního imunoglobulinu v séru • Monoklonální gamapatie nejasného významu (MGUS) • Mnohočetný myelom • Plazmocytom • Waldenströmova makroglobulinemie • AL amyloidóza • Nemoci těžkých řetězců • Imunofixace slouží k: • Diferenciální diagnostice gamapatie • Sledování vývoje onemocnění v čase • Sledování terapie • Vyšetření séra + moči současně!! Imunofixace - postup Imunofixace - postup Imunofixace - postup Imunofixace - postup Imunofixace - postup Imunofixace - postup Odečítáme typ monoklonálního Ig – v jednotlivých drahách pátráme po proužcích se shodnou polohou na elektroforeogramu Imunofixace – odečítání výsledků Polyklonální Ig – zdravý člověk Pacient s paraproteinem IgG λ a lehkými řetězci λ Pacient s paraproteinem IgA κ Imunofixace – odečítání výsledků Pacient s paraproteinem IgM λ Pacient s paraproteinem IgM κ MOČ Volné lehké řetězce λ Biklonální gamapatie IgG κ + IgM λ Imunoblot oSlouží k diagnostice autoprotilátek oPříprava blotů (výrobce): o Proteiny elektroforeticky rozděleny v gelu – přenos (otisk) na nitrocelulózovou membránu (bloting) o Membrána je rozstříhána na jednotlivé diagnostické proužky o každý protein má na proužku definovanou polohu o Výrobce v kitu dodává i šablonu, podle které se bloty odečítají Imunoblot o Princip stanovení: o Pokud je autoprotilátka proti určitému proteinu (antigenu) přítomna v séru, naváže se na tento protein (antigen) imobilizovaný na stripu o Detekce vazby autoprotilátky pomocí diagnostických protilátek značených enzymem o Enzym přemění substrát na barevný produkt o Výsledkem je vznik barevného proužku na stripu Imunoblot o Jednotlivé barevné proužky se porovnávají s kontrolní šablonou o Hodnotí se přítomnost kontrolních proužků (interní kontrola) o Odečet vizuálně nebo denzitometricky (% pozitivity – semikvantitativní stanovení) o Imunoblotem se vyšetřují pacienti, které nelze vyšetřit jinou metodou (ELISA) o Diagnostika – zejména roztroušená skleróza