Imunofluorescence Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Serologické metody Reakce antigenu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex: 1. Primární – rychlá, nepozorovatelná pouhým okem fáze – tvorba imunokomplexů Ag + Ab – vznik vazby jednotlivých epitopů s vazebnými místy protilátek 2. Sekundární – pomalá, pozorovatelná pouhým okem fáze – uplatňuje se multivalence Ag a polyvalence Ab – vznik prostorového komplexu Pokud nedochází k sekundární fázi reakce, je nutné imunokomplexy vzniklé v primární fázi vizualizovat – imunochemické metody http://www.wikiskripta.eu Serologické metódy 1. Klasické serologické metody - Aglutinace (přímá / nepřímá) - Precipitace (v kapalině, v gelu) 2. Imunochemické metody s následnou detekcí - Imunofluorescence (přímá / nepřímá) - Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA) - Imunoblot, imunodot 3. Metody založené na efektorovém účinku protilátek (využívané v klinické mikrobiologii) - Komplement fixační reakce - Inhibiční a neutralizační testy Imunofluorescence • Luminiscence Jev, při kterém látka emituje záření po absorpci excitačního záření (Fotoluminiscence) nebo při chemické reakci (Chemiluminiscence) Fluorescence emise záření krátce po excitaci (10-8 až 10-5 s) Fotoluminiscence Fosforescence emise záření trvá delší dobu (10-2 s až dni) Zdroj: www.chemiaasvetlo.sk/teoria/ chemiluminiscencia/ Zdroj: www.infobiologia.net/2017/01/bioluminiscencia-animales-bacterias.html Fluorescence Látka po absorpci excitačního záření uvolňuje emisní záření o delší vlnové délce (nižší energii) – tento jev se nazývá Stokesův posun Fluorescenční mikroskop • Zdroj světla – rtuťová výbojka, LED dioda • Excitační filtr – propouští pouze část spektra potřebného pro excitaci fluorescence a zabraňuje přechodu záření v oblasti emisní vlnové délky, která by vytvářela pozadí • Emisní (bariérový) filtr – propouští pouze emisní část spektra a zabraňuje průchodu excitačního záření • Binokulár/trinokulár • Jednoduché polarizované svetlo Brightfield, Darkfield, Fluorescencia Schéma fluorescenčního mikroskopu Imunofluorescence (IF) Přímá IF Slouží k detekci antigenů – vazba konjugátu přímo na antigen Využití: histologie – prokázání antigenu ve tkáni mikrobiologie – rychlá detekce patogenů v biologickém materiálu Nepřímá IF Používá se k detekci protilátek v séru  vazba protilátek a konjugátu v 2 krocích: 1. Na sklíčko se substrátem se nanese vyšetřovaný materiál (sérum), pokud jsou v něm přítomné hledané protilátky, naváží se na antigenní substrát na sklíčku 2. Nanese se konjugát, který se váže na protilátku příslušné izotypové třídy (IgG/IgA) Využití: důkaz specifických protilátek, nejčastěji autoprotilátek Priama IF Nepriama IF Základní princip imunofluorescence (IF) 1. Na sklíčko se substrátem (který obsahuje cílové antigeny) se aplikuje naředěné sérum pacienta (1:80 základní ředění) + vzorky pozitivní a negativní kontroly 2. Inkubace 30 min v temnu 2. Pokud je v séru přítomna autoprotilátka, naváže se na cílový antigen, který je přítomen v antigenním substrátu (řez tkáně či buněčná suspenze) 3. Promytí skel v PBS+TWEEN – 5 min 4. Aplikace konjugátu – protilátky proti pacientově autoprotilátce, je značená fluorochromem (FITC) – nejčastěji třída IgG 5. Inkubace 30 min v temnu 6. Promytí skel v PBS+TWEEN – 5 min 7. Otření hrany skla od přebytečného PBS+TWEEN, na jednotlivé pozice aplikace 1 kapky (cca 10ul) montovacího média - glycerinu 8. Usazení krycího skla, kontrola správného usazení, nutno se vyvarovat bublinám 9. Skla jsou připravena k odečtení na mikroskopu Základní princip Inkubace → promytí Inkubace → Promytí → Krycí sklíčko Imunofluorescence Antigenní substráty používané při nepřímé IF Buňky HEp2 (Human Epithelial) – detekce ANA - odvozené z linie HeLa (karcinom děložního čípku) - rychle se dělící buňky, v mitóze pozorovatelná chromatinová destička – důležitý znak pro odlišení jednotlivých typů ANA Neutrofilní granulocyty – detekce ANCA Crithidia luciliae – prvok, detekce protilátek proti dsDNA Opičí jícen – detekce EMA LKS (liver, kidney, stomach) – detekce AMA, ASMA, GPC, RET, ... - kombinace 3 krysích tkání Konjugát • Protilátka s navázaným fluorescenčním barvivem (fluorochromem) • Najčastěji používaný fluorochrom je FITC (fluoresceinizothiokyanát) excitační/emisní vlnová délka 495/520 nm (zelené světlo) • Konjugát se specificky váže jen na imunoglobuliny určité izotypové třídy (IgG/IgA) – výběrem konjugátu stanovíme protilátky jen této třídy • Pro některé autoimunitní onemocnění má klinický význam výskyt autoprotilátek v určité izotypové třídě (např. celiakie – IgA) Laboratorní postup při podezření na autoimunitní onemocnění • Celý proces začíná v ordinaci lékaře • Ordinuje vyšetření na autoprotilátky – na základě kliniky+anamnézy (může určit, zda vyšetření požaduje imunofluorescenčně nebo ELISOU/imunoblotem) • Do laboratoře přichází krev pacienta se žádankou • Příjem – příprava séra centrifugací srážlivé krve • Zamražení sér • V okamžiku, kdy laboratoř nasbírá dostatečný počet vzorků od pacientů pro konkrétní vyšetření  následuje zahájení vlastního vyšetření Pozn. Proč čekáme na dostatečný počet vzorků? Napravo je ukázka klasického sklíčka s připraveným substrátem od výrobce – zde na 8 vzorků. Sklo je nutné zpracovat plně obsazené, jinak by vyšetření bylo značně finančně nevýhodné. Při zpracování skla pouze s jednou využitou jamkou bychom o zbylých 7 přišli. Vlastní zpracování vzorku na IF – 2 různé přístupy Princip zpracování – viz. Slide č. 9 1. Zpracování manuálně 2. Zpracování automaticky – přístroj HELMED • V současné době se vzhledem k narůstajícímu množství vzorků a snaze eliminovat lidskou chybu upřednostňuje automatické zpracování IF • Výhody: • Eliminace lidských chyb • Redukce manuální práce • Nevýhody • Delší zpracování v porovnání s manuální metodou • Přístroj je náročnější na údržbu a zacházení • Manuální zpracování provádí zdravotní laborantka • Výhody: • Rychlejší zpracování v porovnání s automatickou metodou • Nevýhody: • Možnost vzniku lidských chyb, např. záměna vzorku, vznik artefaktů nedodržením návodu ANA (Anti Nuclear Antibodies) • Velká skupina protilátek • Váží se na různé antigeny v jádře (DNA, RNA, centromery, ...) • Výskyt při různých autoimunitních onemocněních (systémový lupus erytematodes, Sjögrenův syndrom, revmatoidní artritida, ...) Fluorescenční obraz v mikroskopu může vypadat stejně nebo podobně u různých protilátek – pokud vidíme určitý obraz, nevíme ještě, o jakou autoprotilátku se jedná (na jaký antigen se váže), k jejímu bližšímu určení mohou pomoci jiné metody (ELISA, ImunoBlot) ANA protilátky • Jedná se o obsáhlou skupinu autoprotilátek, které jsou zaměřeny vůči různým jaderným strukturám (např. centromera, mitotický aparát, DNA, histony..) • Výskyt u systémových autoimunitních onemocnění • Jedná o nejčastěji stanovované protilátky pomocí IF  odečítá se 5-10 skel/den • Substrátem pro stanovení ANA protilátek jsou Hep-2 buňky • Podskupinou ANA jsou ENA protilátky – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (jedná se o takové antigeny jádra buněk, které mají vyšší Mr a lze je extrahovat např. SSA, SSB, Jo-1, Scl-70…) • ENA protilátky – stanovují se ELISOU/ImunoBlotem ANA protilátky – ředění vzorků • Stanovení ANA protilátek – sérum pacienta se vždy ředí v základu 1:80 První čtení - odečtení IF při ředění 1:80 Pokud je vzorek pozitivní, odečítající VŠ indikuje vyšetření opakovat druhý den s vyšším ředěním (1:160, 1:320, 1:640, 1:1280) – ředění záleží na intenzitě fluorescence daného vzorku a vyžaduje zkušenosti odečítajícího Po zpracování skel s vyšším ředěním následuje druhé čtení. Pokud je vzorek pozitivní i při ředění 1:1280  výsledek se vydává jako „vyšší než 1280“ Výsledkový list- ANA hlavička listu Název metody Datum, kdy bylo vyšetření provedeno Název pracoviště Vzorky pacientů + kontroly Výsledky prvního odečítání skel Výsledek titrace ANA Typ fluorescence u pozitivních vzorků Je přítomna fluorescence centromer? Konečný výsledek po provedení dalších titrací vzorku Poloha kontrol/vzorků na skle Výsledkový list- ANA - pokračování Nejprve se odečítá pozitivní a negativní kontrola – zde kontroly vyšly v pořádku, proto lze pokračovat v odečítání pacientů Pacient 1: První čtení pozitivní výsledek – jemně granulární fluorescence (JG) – provedeno ředění až do 1:1280 – stále pozitivní jemně granulární fluorescence Pacient 2,4,5,6… výsledky jsou negativní Pacient 7: Je pozitivní, provedeno ředění ANA 1:320 a 1:640, fluorescence smíšená (JGCHOT) = jemně granulární, zvýrazněný chromatin + ojedinělé tečky Typy fluorescence se popisují zkratkami, např: • JG = jemně granulární fluorescence • JGCHOT = smíšená fluorescence – jemně granulární, zvýrazněný chromatin + ojedinělé tečky • H = homogenní fluorescence ANA – typ granulární, zrnitý (nemá Ch.d.,ENA) ANA – typ nukleolární (jadérkový) ANA – typ centromerický (CREST syndrom) ANA – typ homogenní (dsDNA, má Ch.d.) ANA – homogenní typ fluorescence • U homogenního typu fluorescence svítí celé jádro Hep-2 buněk • Nelze rozlišit, zda jsou přítomné autoprotilátky namířeny vůči dsDNA nebo proteinům asociovaným s DNA (histony apod.) • Proto si laboratoř může v některých případech sama doordinovat další vyšetření  znovu provede IF takto pozitivních vzorků, ale s jiným substrátem – prvok Crithidia luciliae • Pokud v prvokovi svítí pouze kinetoplast a jádro  jedná se o autoprotilátky proti dsDNA  typické pro SLE (systémový lupus erythematodus) 1. ANA protilátky – homogenní typ fluorescence 2. Sérum pacienta aplikováno na substrát Crithidium luciliae 3. Pokud je pozitivní kinetoplast a jádro  jedná se o protilátky proti dsDNA Prvok Crithidia luciliae – dsDNA neg/poz (↑specificita,↓senzitivita) V cytoplazmě HEp2 buněk je možné pozorovat i další typy fluorescence – napr. mitochondriální – AMA (antimitochondrial antibodies) – výskyt u onemocnění primární biliární cirhóza Ale hlavním substrátem pro diagnostiku primární biliární cirhózy je LKS (liver, kidney, stomach)! Zdroj: www.mayoclinic.org/diseases- conditions/primary-biliary-cholangitis-pbc Hep-2 buňky - kromě fluorescence v jádře lze sledovat i fluorescenci v cytoplazmě Substrát LKS • Kombinace 3 krysích tkání - játra (Liver) - ledviny (Kidney) - žaludek (Stomach) • Pozorujeme protilátky: - AMA (antimitochondriální) – primární biliární cirhóza - ASMA (proti hladkému svalu) – autoimunitní hepatitidy - GPC (proti parietálním buňkám žaludku) – prim. perniciózní anémie - RET (proti retikulinu) – celiakie (kontrola dodržování diety), mohou být pozitivní i u Crohnovy choroby AMA (antimitochondriální Ab) – krysí žaludek, ledviny, játra Mitochondrie jsou organely obsažené v buňkách všech tkání – proto při přítomnosti AMA protilátek bude viditelná pozitivita ve všech třech typech tkáně. ASMA (proti hladkému svalu) – krysí žaludek Při pozitivitě ASMA svítí pouze struktury obsahující hladkou svalovinu, např. • Cévy • Stěna žaludku RET (proti retikulinu) – krysí žaludek, ledviny, játra Retikulin je mezibuněčnou složkou mezenchymální tkáně se značným množstvím antigenních determinant, protilátky jsou většinou ve třídě IgG, eventuelně IgA. GPC = anti-Gastric Parietal Cell antibody Protilátky proti parietálním buňkám žaludku • Výskyt u perniciózní anemie • Vznik protilátek proti parietálním buňkám žaludku (mohou se tvořit i autoprotilátky proti vnitřnímu faktoru, který parietální buňky produkují a který je nezbytný pro transport vitaminu B12 přes střevní sliznici, popř autoprotilátky, které blokují komplex vnitřní faktor+vitamin B12) • Důsledek: • Nedostatek vitaminu B12 (=kobalamin), který je nutný pro syntézu DNA • Rozvíjí se megaloblastová anemie (viz. učebnice hematologie) • Klinické příznaky • Typické postižení jazyka – „Vyhlazený“ jazyk • Subikterus • Symetrické parestezie končetin • Nechutenství, průjmy • Perniciózní anemie bývá spojena s atrofickou gastritidou, častějším vývojem rakoviny žaludku a taktéž kolorektálního karcinomu • Léčba – suplementace chybějících vitaminů – B12+kyselina listová Substrát – krysí žaludek ANCA (protilátky proti cytoplazmě neutrofilů) • Skupina protilátek proti některým vnitřním cytoplazmatickým strukturám neutrofilů (myeloperoxidáza, proteináza 3, elastáza, laktoferin…) • Vyskytují se obecně u autoimunitních vaskulitid • Existuje několik typů pozitivity ANCA imunofluorescence (IF): • pANCA – perinukleární IF  antigenem je myeloperoxidáza (MPO) – polyarteritidy • cANCA – cytoplazmatická IF  antigenem je proteináza 3 (PR3) – Wegenerova granulomatóza • aANCA – atypická IF – různé antigeny (elastáza, lysozym…) - má vazbu na ulcerózní kolitidu • Substrát pro IF: ethanolem fixované neutrofilní granulocyty • Kromě IF se pANCA a cANCA stanovují také ELISOU ANCA (protilátky proti cytoplazmě neutrofilů) pANCA – perinukleární – antigenem je MPO (myeloperoxidáza) Atypická ANCA – různe antigeny (elastáza, lysozym, katepsin) cANCA – cytoplazmatická – antigenem je PR3 (proteináza 3) – typická pro Wegenerovu granulomatózu s polyangitidou pozitívní = vážná diagnóza = okamžite hlásit Zvláštní postavení – ASCA protilátky • Nejedná se o autoprotilátky (nejsou namířeny proti strukturám tělu vlastním) • Jedná o protilátky proti kvasince Saccharomyces cerevisiae • Stanovení ASCA slouží k diferenciální diagnostice nespecifických střevních zánětů • Crohnova choroba – ASCA pozitivní až v 81% případů (+ pANCA pouze 18%) • Ulcerózní kolitida – ASCA pozitivní jen v 22% případů (+ pANCA až 70%) • ASCA protilátky se stanovují ELISOU, ne imunofluorescencí EMA (protilátky proti endomysiu) • Na řezu opičího jícnu • Ag je TTG (tkáňová transglutamináza) (též lze stanovit ELISOU) • Výskyt u celiakie (hlavně IgA) VÝSLEDKY -Pracovní list - EMA diagnostika celiakie - screening Hlavička pracovního listu Název metody Datum provedení Název pracoviště, kde bylo vyšetření provedeno Substrát na skle – u EMA řezy opičího jícnu • Zde použit konjugát ve třídě IgA (Ve slizniční imunitě hraje třída protilátek IgA dominantní roli) • Lze stanovit i IgG – pokud má pacient diagnostikovaný IgA deficit Pracovní list –EMA Výsledky pacientů Pozitivní kontrola je nezbytnou součástí vyšetření • musí být provedena s každou analytickou sérií vzorků • Odečítá se jako první • Pokud kontrola vyjde, lze pokračovat v odečítání pacientů • Pokud pozitivní kontrola nevyjde, nelze odečíst vzorky  nutné zjistit proč kontrola nevyšla, přijmout nápravná opatření Vzorky pacientů • Pokud byl pacient vyšetřován již dříve, je u něj informace o výsledku posledního vyšetření + datum, kdy bylo toto vyšetření provedeno • Pokud je pacient nový, tato informace chybí • V této sérii vzorků je na EMA pozitivní pouze pacient 10 Odborný dohled • VŠ nelékař bez atestace může odečítat pouze pod odborným dohledem • Odborný dohled – lékař s atestací  kontroluje správnost odečtených výsledků • Pokud je vše v pořádku, správnost výsledků stvrdí lékař s atestací razítkem „odborný dohled“ + svým osobním razítkem a podpisem Diagnostika celiakie Negativní obraz Pozitivní obraz 1) Stanovení celkového IgA 2) Nepřímá imunofluorescence – EMA – protilátky proti endomysiu  jedná se o nespecifické vyšetření – odhalí autoprotilátky proti určité tkáňové struktuře – zde endomysium 3) Zda se jedná konkrétně o protilátky proti tkáňové transglutamináze – anti-TTG (třída IgA, popř. IgG u nemocných s IgA deficitem) – ELISA Imunologická laboratoř provádí pouze screening celiakie 4) Definitivní potvrzení celiakie: gastroenterolog • Enterobiopsie – odběr vzorků tkáně tenkého střeva na histologii  • Histologie - atrofie klků tenkého střeva • Histochemie - deficit enzymů kartáčového lemu enterocytů • Změny na sliznici pouze u aktivní a tiché formy celiakie • Latentní forma celiakie má pozitivní sérologii avšak normální architekturu sliznice! Imunofluorescence • Zlatý standard • Na prvním místě– každá imunologická laboratoř by měla poskytovat stanovení autoprotilátek IF metodou • Kombinace s ELISA + ImunoBlot • Interpretace výsledků: - záleží na typu - pozitivní/negativní nebo titr Ab - Pozor – hladiny autoprotilátek narůstají s věkem (zvýšené hladiny tedy nemusejí nutně znamenat autoimunitní onemocnění) - Avšak u dětí jsou zvýšené hladiny patologické vždy Imunofluorescence • Popis vzorků + sklíčka • Pracovní list – seznam pacientů → zápis výsledků • Přepis výsledků do systému (LIS/NIS) Při zpracování IF se mohou objevit problémy… 1) Když nevyjdou kontroly • Vidíme fluorescenci v negativní kontrole – nespecifická vazba konjugátu, špatné promytí skel • Nevidíme fluorescenci v pozitivní kontrole – expirovaný konjugát, nevhodně skladovaný konjugát (např. na světle), popř. zapomenutá zpracovaná skla na světle (došlo k „vysvícení“ fluorochromu - bleaching) • Pokud kontroly nevyjdou, nelze odečíst vzorky pacientů • Problém je vždy potřeba objasnit a přijmout nápravná opatření 2) Výskyt artefaktů • Stárnutí reagencií – např. v dlouho skladovaném montovacím médiu – glycerinu- se tvoří krystaly, které ve světle mikroskopu odrážejí světlo a na řezu jasně svítí  obraz připomíná „hvězdné nebe“  doporučením je vždy vzít nové montovací médium • Prachové částice Kvalifikace k odečítání imunofluorescencí • Samostatně odečítat imunofluorescence může pouze vysokoškolský pracovník (min. vzdělání – Mgr. v přírodních vědách = VŠ bez atestace) • VŠ bez atestace – min 2 roky se učí odečítat IF pod dohledem někoho s atestací (=paralerní čtení)  na výsledcích hodnocených pracovníkem bez atestace musí být jasně viditelné razítko „odborný dohled“, za správnost výsledků ručí VŠ s atestací • 5 let trvá složení magisterské atestace • Po splnění těchto podmínek může VŠ odečítat IF sám Pozn: Odečítání imunofluorescencí je velmi náročné, odečítající musí velmi dobře znát anatomii používaných tkání (substrátů) a buněk, musí dobře znát, jaké typy fluorescence se u jednotlivých tkání a buněčných suspenzí mohou vyskytnout a také musí vždy brát v potaz fluorescenční pozadí preparátů, výskyt artefaktů (nečistoty, krystaly…) a rovněž musí brát ohled na věk pacienta (s vyšším věkem narůstají hladiny autoprotilátek, aniž by starší lidé měli jakékoli klinické příznaky autoimunitních onemocnění). Kontroly kvality IF • Odečítající VŠ jsou pravidelně podrobováni kontrolám – hodnotí se, zda jsou skla správně odečítána • Interní kontroly kvality – každý měsíc probíhá kontrolní čtení • Externí kontroly kvality – SEKK • Organizátoři SEKKu do laboratoří zasílají anonymní séra • Laboratoř sérum nasadí na skla, odečte a výsledky zašle organizátorovi • Organizátor výsledky zhodnotí a laboratoři zašle výsledek + jak si daná laboratoř vedla v porovnání s jinými laboratořemi • Pokud při kontrolách došlo k chybnému odečtení skel, musí laboratoř přijmout nápravná opatření