Klasické serologické metody aglutinace / precipitace, RID, nefelometrie / turbidimetrie Vyšetření funkce komplementu Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz) Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Laboratórne vyšetrenie IN VITRO • Preanalytická fáza - Príprava pacienta, odber, spracovanie vzorky pred zahájením laboratórneho vyšetrenia - skladovanie, transport • Analytická fáza - kalibrácia a justovanie zariadení (analýza kontrol- IKK, EHK) - prevedenie lab. vyšetrenia + kontrol - spracovanie výsledkov, LIS • Postanalytická fáza - skladovanie, likvidácia materiálu - preskúmanie výsledkov, uvoľnenie, uchovávanie LIS - NIS Rozdelenie imunologických laboratórnych metód serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok, Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov Serologické metódy 1. Klasické serologické metódy - Aglutinácia (priama / nepriama) - Precipitácia (v kvapaline, v géle) 2. Imunochemické metódy s následnou detekciou - Imunofluroscencie (priama / nepriama) - Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA) - Imunoblot, imunodot 3. Metódy založené na efektorovom účinku protilátok (využívané v klinickej mikrobiológii) - Komplement fixačné reakcie - Inhibičné a neutralizačné testy Serologické metódy Reakcia antigénu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex: 1. Primárna – rýchla, nepozorovateľná voľným okom fáza – tvorba imunokomplexov Ag + Ab – vznik väzby jednotlivých epitopov s väzbovými miestami protilátok 2. Sekundárna – pomalá, pozorovateľná voľným okom fáza – uplatňuje sa multivalencia Ag a polyvalencia Ab – vznik priestorového komplexu Pokiaľ nedochádza k sekundárnej fáze reakcie, je nutné imunokomplexy vzniknuté v primárnej fáze vizualizovať – imunochemické metódy http://www.wikiskripta.eu Aglutinácia vs Precipitácia Aglutinácia (zhlukovanie) Ag + Ab → Ag-Ab aglutinogén aglutinin aglutinát makromolekulárny imunokomplex korpuskulárny nerozpustný Protilátky namierené proti epitopom antigénnych častíc vytvárajú medzi korpuskulami mostíky, ktoré vedú k vzniku zhlukov (aglutinátov) Precipitácia (zrážanie) Ag + Ab → Ag-Ab precipitogén precipitin precipitát nízkomolekulárny imunokomplex nekorpuskulárny rozpustný Reakcia medzi solubilným antigénom a protilátkou s následným vznikom precipitátu (hydrofóbne väzby – nerozpustný komplex) Aglutinácia 1. Priama - korpuskulárny Ag prirodzene nesie cieľové epitopy - identifikácia baktérií, hemaglutinácia 2. Nepriama - rozpustný antigén naviazaný na povrchu vhodných makromolekulárnych častíc (latex) - stanovenie RF, ASLO Krvné skupiny Systém AB0 Hodnotenie aglutinácie • KVALITATÍVNE - aglutinácii dochádza / nedochádza (pozitívna / negatívna) • KVANTITATÍVNE - stanovenie najvyššieho riedenia séra, kedy je ešte badateľná aglutinácia - titer (titr) = prevrátená hodnota riedenia séra (riedenie 1:32 → titer 32) Reumatoidná artritída • Symetrické zápalové ochorenie kĺbov • Infiltrácia sinoviálneho tkaniva plazmocytmi, makrofágmi, T a B lymfocytmi • Produkujú zápalové mediátory, ktoré indukujú tvorbu enzýmov degradujúcich bielkoviny, deštrukcia kĺbu • muži : ženy 1 : 2-3 • 1 % populácie • (Špecifickejší diagnostický test ako RF je stanovenie CCP (cyklické citrulinové proteíny)) Latex-fixačný test Reumatoidný faktor (RF) - autoprotilátka namierená proti Fc části IgG molekuly - prítomný asi u 80% pacientov s reumatoidnou artritídou - pozitívny je tiež u asi 5-10% chorých s inými systémovými autoimunitnými ochoreniami (autoimunitné hepatitídy, endocarditis lenta) - môže byť pozitívny i u osôb bez příznaků onemocnění (vyšší věk) - diagnosticky najdôležitejší je RF v triede IgM Princíp testu: Stanovenie ASLO nepriamou aglutináciou • ASLO - Anti StreptoLysin O antibodies • Slúži k stanoveniu protilátok v sére proti Streptolysinu O (exotoxín bakterií z rodu Streptococcus) • Diagnostika: retrospektivní průkaz proběhlé infekce, popř. sterilních následků onemocnění • Princíp testu: - streptolysin O je naviazaný na povrchu latexových častíc - pokiaľ sú v sére pacienta prítomné protilátky proti streptolysínu, dôjde k ich naviazaniu na streptolysín na latexových časticiach, aglutinácia častíc, ktorá je okom pozorovateľná Precipitácia 1. V géle - Jednoduchá RID - Dvojitá RID 2. V tekutom prostredí - Nefelometria - Turbidimetria Precipitácia v géle • Prostredie – agaroza gel • Je založená na pasívnej difúzii látok v prostredí - koncentračný gradient • Ag aj Ab difundujú gélom a v mieste, kde koncentrácie Ag i Ab dosiahnu optimálneho (ekvimolárneho) pomeru vzniká precipitát Radiálna imunodifúzia • Pomocou RID je možné stanoviť koncentrácie mnohých bielkovinových súčastí séra • Metodika sa v minulosti používala pri meraní hladín celkového IgG, IgA, IgM, zložiek komplementu alebo rôznych proteínov akútnej fáze- väčšina týchto vyšetrení je dnes automatizovaná a prevádzaná na princípe nefelometrie • Stanovenie C2 a C5 zložiek komplementu Podľa počtu difundujúcich reaktantov • Jednoduchá RID - koncentračný gradient jedného z reaktantov (väčšinou Ag) - druhý reaktant (väčšinou Ab)- rovnomerne rozptýlený v štruktúre gélu - výsledkom sú ostro ohraničené krúžka precipitátu - plocha prstenca = úmerná koncentrácii vyšetrovaného Ag - podľa konc. štandardu – kalibračná krivka • Dvojitá RID (podľa Ouchterlonyho) - sledujeme antigennú príbuznosť antigénov - gradient vytvára ako Ag, tak Ab a dochádza k protismernej difúzii oboch reaktantov - v zóne ekvivalencie – precipitačná línia, ktorá ukazuje na pozitivitu reakcie - hodnotenie: kvalitatívne Precipitácia- v tekutom prostredí • Využíva sa efekt, že pri reakcii Ag-Ab vzniká zákal- precipitát, ktorého intenzita je pri konštantnom množstve pridanej protilátky úmerná pridanej koncentrácii vyšetrovaného antigénu • Meranie intenzity zákalu: nefelometria, turbidimetria • Obe metodiky umožňujú kvantitatívne stanovenie obsahu proteínov vo vzorke odčítaním z kalibračnej krivky Precipitácia v tekutom prostredí Nefelometria - vhodná pre nižšie koncentrácie viditeľné svetlo detektor je v smere kolmom na vstupujúci lúč Meria množstvo svetla rozptýleného pri prechode lúča (množstvo svetla odrazeného od vznikajúcich komplexov) Turbidimetria - Vhodná pre koncentrovanejšie roztoky viditeľné svetlo detektor je v ose lúča Meria množstvo prechádzajúceho svetla (úbytok intenzity svetla, ktoré prešlo roztokom v kyvete) nefelometria je 5-10x citlivejšia a nákladnejšia ako turbidimetria Nefelometria a turbidimetria • Reakcie založené na meraní množstva imunitných komplexov vytvorených interakciou špecifických protilátok s antigénom • Stanovenie sérových bielkovín • Meranie prebieha v tekutom prostredí v meracej kyvete (pufr, látka urýchľujúca reakciu, Ag, Ab) • Množstvo vytvorených komplexov je úmerné koncentrácii Ag Konstrukce nefelometru Immage 800 Nefelometr – zdrojem světla je laser - vlnová délka 670nm Turbidimetr – zdrojem světla je LED dioda o vlnové délce 940nm Nefelometr – měří přírůstek odraženého světla od imunokomplexů pod úhlem 90° (Tyndalův jev) Turbidimetr – měří úbytek prošlého světla - tubiditu Beckman Coulter IMMAGE 800 • Stanovenie koncentrácie: • Stroj I: - imunoglobulíny: IgG, IgA, IgM (g/l) - proteíny akútnej fáze: CRP (mg/l) - (RF+ASLO) • Stroj II: - imunoglobulíny: IgM, IgG1,2,3,4 - zložky komplementu: C3, C4, C1q - proteíny akútnej fáze: A1AT (alfa 1 antitrypsin), OROSO (orosomukoid), A2M (alfa 2 makroglobulin), CPL (ceruloplasmin), TRF (transferin), PREA (prealbumin) www.beckmancoulter.com/en/products/protein- chemistry/immage-800 Siemens BNII • Stanovenie koncentrácie: - imunoglobulíny: IgE (IU/ml), IgD, IgA1, IgA2, IgAp (nízke koncentrácie) - zložky komplementu: C1 inhibitor • IgG: 7,5-15,6 g/l • IgA: 0,82-4,53 g/l • IgM: 0,46-3 g/l • IgE: 0-100 kU/l • CRP: 0-8mg/l www.healthcare.siemens.com/plasma-protein/systems/bn-ii-system Dynamika precipitačních reakcí Imunoprecipitační křivka (Heidelberger-Kendallova) 1) oblast nadbytku protilátky – měření přístrojem 2) Zóna ekvivalence 3) Oblast nadbytku antigenu – protilátka spotřebována, imunokomplexy se rozpadají - Hook efekt → Pro 2 rozdílné koncentrace antigenu lze získat jednu hodnotu absorbance – riziko falešně nízkých hodnot přístroje mají různé postupy, jak Hook efekt rozpoznat Měření zákalu je relevantní pouze ve vzestupné části křivky – probíhá kinetickým proměřováním vzorku s intervalem 5 vteřin Po proběhlé reakci přístroj do vzorku přidá opět antigen 1. Pokud absorbance opět stoupne (3) → měření proběhlo v oblasti nadbytku protilátky (tvoří se nové imunokomplexy) a pro výpočet koncentrace analytu lze použít naměřené hodnoty absorbance a původní ředění 2. Pokud po přídavku antigenu k nárůstu signálu nedojde (4), → protilátka byla spotřebována (mnoho antigenu) – analýza musí být opakována s vyšším ředěním vzorku Při nefelometrickém i turbidimetrickém měření musí zůstat zachována podmínka nadbytku protilátky v reakční směsi Denná prax na analyzátore ➢Provozní denník ➢Údržba analyzátorov: - denná/týždenná/mesačná ➢Kalibrácie: - 1 krát do mesiaca / pri zmene šarže reagencií - kalibračná krivka ➢Kontroly IKK: - každý deň, pred zahájením merania pacientskych vzoriek - viazané na metódu, jedno-/viac-úrovňové (hladina normální a patologická) - referenčné medze ➢Kontroly EHK (SEKK- systém externí kontroly kvality): - podľa časového plánu - zasielané z externého laboratória (nie je známa výsledná koncentrácia) - prevedie sa meranie → Výsledky sa vo forme protokolu odošlú späť organizátorovi - organizátor porovná výsledky meraní jednotlivých laboratórií a spätne ich informuje o úspešnosti - medzi-laboratórne porovnávacie skúšky IKK: Levey-Jenningsův diagram – sledování kontrol v čase Westgardova pravidla – detekce chyb v analytické proceduře (schválení x zamítnutí analytické série) Priebeh vzorky ➢Sérum = odběr srážlivé krve ➢Alikvotácia vzorky ➢Vytvorenie pracovného listu pre jednotlivé analyzátory = zoznam vzoriek ➢Analyzátor = vzorka + špecifické antisérum + pufr (stabilizácia a urýchlenie reakcie) ➢Analyzátor prepojený s LIS (laboratórny informačný systém)= získa informácie o potrebnom meraní + výsledok automaticky odošle Interpretácia výsledkov • Výsledky sú pred vydaním viacnásobne kontrolované • Pozor: ➢ falošná pozitivita (malá špecificita testu) ➢ falošná negativita (malá senzitivita testu) • Hladina imunoglobulínov IgG, IgA, IgM (g/l): ↑ - zápalové procesy infekčného pôvodu - jedna trieda = myelom; monoklonálna gamapatia - zvyšovanie s vekom ↓ - poruchy tvorby = imunodeficity - lymfomy, leukémie, myelomy, následkom liečby Interpretácia výsledkov • Hladina IgE (IU/ml): ↑ - alergické stavy prvého typu precitlivenosti - parazitárne choroby - autoimunity, imunodeficiencie • Vyšetrenie komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH) ↑ - zápalová aktivita (zriedka) ↓ - vrodená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená spotreba- tvorba imunokomplexov; hereditárny angioedém) Interpretácia výsledkov • Reaktanty akútnej fázy ↑ - akútna zápalová reakcia = opsonizační a prozánětlivý efekt - regulačná funkcia; prenášače iontov; hemokoagulácia CRP (mg/l) ↑ - bakteriálne infekcie - infarkt myokardu, pooperačné obdobie - reumatické choroby Vyšetření funkce komplementu Mgr. Julie Štíchová FN u Sv. Anny v Brně Komplement oSložka nespecifické humorální imunity - humorální oSystém několika desítek proteinů, většina tvořena v játrech oVelmi rychlá aktivace oSilné zánětotvorné a lytické účinky Komplementový systém tvoří: • Centrální proteiny C1-C9 • Komplementové receptory na buňkách • Stabilizátory komplementu • Inhibitory komplementu • Solubilní • Membránově vázané Komplement oAktivovaný komplement podporuje: o Rozvoj zánětlivé reakce (anafylatoxiny – C3a, C4a, C5a) o Opsonizace antigenních částic – podpora fagocytózy (C3b, C4b) o Chemotaxe (C3a, C5a, komplex C5,6,7) o Lýza buněčných membrán (C5b-C9 – MAC) o Odstraňování imunokomplexů z cirkulace (C3b, C4b) o Adaptivní imunita – Zesílení signalizace na B lymfocytech → imunokomplexy s C3dg – přemostění CD21 a BCR Regulace komplementu oAktivovaný komplement má silný amplifikační potenciál, nutná důsledná regulace 1) Regulátory pozitivní: o Properdin (faktor P) – stabilizace alternativní C3 konvertázy 2) Regulátory negativní a) Solubilní: • C1 inhbitor (C1INH) • Faktor H • Faktor I b) Membránově vázané: • Decay accelerating factor – DAF (CD55) • Membrane cofactor protein – MCP (CD46) • Protektin (CD59) Když ochrana chybí… oZa normálních okolností jsou RBC chráněny inhibitory komplementu, které exprimují na svém povrchu oMutace genu pro GPI kotvu v hematopoetické kmenové buňce → na povrchu BRC deficit proteinů, které jsou normálně pomocí GPI kotvy vázány o DAF (CD55) – inhibice aktivace C3 a C5 o Protektin (CD59) – inhibice aktivity MAC (C5b-C6-C7-C8-C9) oRBC citlivé ke stopovým množstvím aktivovaného komplementu Paroxyzmální noční hemoglobinurie Hereditální angioedém o Způsoben deficitem C1 inhibitoru (C1 INH) – který inhibuje serinové proteázy C1r, C1s, C1q o Důsledek: 1) aktivace klasické cesty komplementu – provokující faktor (menstruace, stomatologické zákroky, infekce…) 2) nedostatečná regulace kininového systému (C1 INH inhibuje i kalikrein) • Mechanismus: C1 INH není schopen dostatečně tlumit přeměnu prekalikreinu na kalikrein→ Kalikrein štěpí vysokomolekulární kininogen na bradykikin → vazodilatace, zvýšená permeabilita cév (lokálně)→ vznik nezánětlivého edému Hereditální angioedém • Klinický obraz: o Epizodické otoky, edémy – podkoží, pod sliznicí o Bledá barva, nesvědivé, bez lokální zvýšené teploty o Mohou být bolestivé – napětí ve tkáních o Většinou se vyvíjejí postupně – 12-36h o Otoky nereagují na antihistaminika/kortikosteroidy o Potenciálně smrtící onemocnění – otok v oblasti krku (udušení) Hereditální angioedém • Typ 1: porucha tvorby C1INH, 85% nemocných • Snížení C1INH na 12-50%, C3 v normě, snížené C2 a C4 • Typ 2: Funkční porucha C1INH • C1INH může být snížený, v normě i zvýšený, ale je funkčně neaktivní, snížené C2 a C4 • Typ 3: estrogen dependentní – mutace FXII: o bez abnormalit v množství a funkčnosti C1INH *Existuje i získaný angioedém, na který je třeba v diferenciální diagnostice myslet – snížení C1q: • 1) Zvýšený katabolismus C1 INH – některá lymfoproliferativní onemocněními • 2) Autoimunitní onemocnění – vznik autoprotilátek, které blokují aktivní místo C1 INH – ztráta funkce Deficity složek komplementu 1) Deficit C1-C4: častější výskyt pneumonií, pyogenních infekcí, systémové imunokomplexové choroby (SLE-like) 2) Deficit C3-C9: Zejména náchylnost k pyogenním infekcím Defict C9: Typické opakované meningokokové meningitidy (Neisserie) Indikace k vyšetření komplementu o Deficit některé složky o testují se hladiny složek (nefelotmetrie), dále funkční aktivita celého systému (CH50, AH50) o Monitorování zánětu o Složky komplementu se chovají jako pozitivní reaktanty akutní fáze – ↑↑ koncentrace o Monitorování imunokomplexových chorob o Silná aktivace komplementu – dochází ke konzumpci jeho složek – ↓↓ koncentrace o Podezření na hereditální angioedém: o Vyšetření C1 INH + funkční aktivita, složky C2 a C4 Biologický materiál a vyšetření komplementu o Speciální odběrové zkumavky (bez separátorů) o Zpracovat krev do 60 min o Sérum zamrazit (-20°C max. týden, -70°C libovolně beze ztráty aktivity) o Sérum nesmí být opakovaně rozmražováno a zamražováno 1. Kvantitativní stanovení složek komplementu oVyjádření výsledků – koncentrace g/l, mg/l 1) Nefelometrie – složky C3, C4, C1Q, C1-INH, MBL 2) (ELISA) 3) (Radiální imunodifuze (RID)) • Stanovení C2 a C5 složky komplementu • V gelu přítomna protilátka proti C2 nebo C5 složce • Sérum pacienta difunduje do gelu • V zóně ekvivalence se vytvoří precipitační prstenec • Čím vyšší koncentrace C2/C5, tím větší průměr prstence 1. Kvantitativní stanovení složek komplementu o C1q (100-250mg/l) o C2 (10 – 30 mg/l) o C3 (0,7 – 1,5 g/l) o C4 (0,1 – 0,4 g/l) o C5 (80 – 170 mg/l) o MBL (> 0,3mg/l) o C1 inhibitor (210 – 390 mg/l) 2. Funkční vyšetření komplementu oFunkční hemolytické testy – CH50 (CH100), AH50 o Zjištění funkčnosti klasické (CH50) nebo alternativní (AH50) cesty komplementu – formace MAC o Projeví se lýzou definované směsi RBC → nárůst absorbance v supernatantu – zbarvení dané HGB o Výsledky se vyjadřují v % aktivace o Pozor: Se vzorkem pacienta nutno zpracovat i zdravou kontrolu !! (aby bylo pacienta s čím srovnat) 2. Funkční vyšetření komplementu - Hemolytický test CH50 o Screeningová metoda o Zjištění funkčnosti klasické cesty aktivace komplementu – formace MAC o Detekce snížené funkce komplementu o Výsledky se vyjadřují v % aktivace o Sérum zpracovat do 1 hodiny o Proč CH50? Jednotka CH50 Množství séra, které za standardních podmínek způsobí 50% lýzu definované suspenze beraních erytrocytů - 30 min, 37 stupňů Princip testu CH50 baraní erytrocyt králičí protilátky (amboceptor) C1 C4bC2b C4bC2aC3b C5b MAC-lytický komplex Měření absorbance centrifugace přepipetování supernatantu 1.Hemolytický systém: Beraní RBC+ králičí protiláka 2. Aktivace komplementu (C1) 3. Formace MAC MAC-lytický komplex 4. Lýza RBC Výpočet, hodnocení CH50 - hodnocení Lýza v PBS = 0% - blank Lýza v H2O = 100% 𝐀 𝐝𝐚𝐧é𝐡𝐨 ř𝐞𝐝ě𝐧í − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 𝐀 𝟏𝟎𝟎% 𝐥ý𝐳𝐲 − 𝐀 𝐛𝐥𝐚𝐧𝐤𝐮 × 𝟏𝟎𝟎 = % 𝑙ý𝑧𝑦 𝑝𝑟𝑜 𝑑𝑎𝑛é ř𝑒𝑑ě𝑛í A = absorbance 2. Funkční vyšetření komplementu - ELISA o V některých laboratořích CH50/AH50 nahrazeno ELISA metodou o Princip – na dně jamky aktivátor určité cesty komplementu → detekce neoepitopu při formaci MAC C1-INH funkční test o Sérum nebo plazma se inkubuje s reaktantem - aktivovanou exogenní složkou C1s (je součástí setu), která je vazebným místem pro C1-INH o Pokud je C1INH funkční, naváže se na C1s o Následuje odmytí nenavázaných složek o Do jamky se následně přidá konjugát - kozí protilátka proti lidskému C1-INH značenákřenovou peroxidázou (přeměna substrátu na barevný produkt) o Spektofotometrie - určí množství navázaného C1-INH (↑ zbarvení) o Nefunkční C1INH – ke zbarvení nedojde, protože se neutvořily detekovatelné komplexy C1s-C1INH