Test aktivace bazofilů BAT Teorie: Bazofily a žírné buňky jsou klíčové efektorové buňky časné alergické reakce I. typu. Syntetizují řadu aktivních mediátorů (histamin, heparin, leukotrieny), které jsou odpovědné za klinické příznaky alergické reakce (dilatace kapilár – otok, svědění, zvýšení motility střeva či podpora sekreční činnosti některých buněk - rýma). Bazofily na svém povrchu nesou vysokoafinitní FcɛR (receptor) pro Fc fragment IgE. Pokud dojde k přemostění více těchto receptorů antigenem (=alergenem), aktivuje se intracelulární kaskáda, jejímž důsledkem je aktivace buněk (degranulace a exprese aktivačního znaku CD63 na buněčné membráně). Principem BAT testu je inkubace plné krve pacienta s roztokem podezřelého alergenu. Současně je se vzorkem pacienty VŽDY zpracována negativní a pozitivní kontrola (BAT test nemá dány referenční meze). Ke vzorku se ještě přidává roztok IL-3, který zvyšuje reaktivitu bazofilů. Krátká preinkubace vyšetřované krve s IL-3 může zvýšit citlivost testu a to tak, že dochází k prestimulaci bazofilů a následně ke zvýšené expresi CD63 oproti expresi bez použití IL-3. Tohoto se může využít především u alergenů, které vyvolávají relativně slabou stimulaci (např. léky). Zdroj: https://raphaels7.wordpress.com/2015/08/21/basophil-activation-test/ Materiál: • Prestimulační roztok IL-3 připravený dle návodu v příbalovém letáku, kat. č. 554604, firma BD Pharmigen • PBS pro burst test • Roztok fMLP = pozitivní kontrola • Monoklonální protilátky: o Anti-IgE PE-Cy5, firma Exbio o CD63 FITC, firma Beckman Coulter o CD203c PE, firma Beckman Coulter • Alergeny: alergeny používané v alergologii pro prick testy (Stallergen) • Lyzační roztok CD63 Postup: 1) Označte vzorek na vyšetření BAT příslušným číslem, např 2BAT1 (první číslo udává den v týdnu 1=PO, 2=ÚT, 3=ST, 4=ČT, 5=PÁ), BAT je označení metody a druhé číslo je pořadové číslo pacienta stanovaného v daném dni 2) Popište zkumavky přiděleným vyšetřovacím číslem. Pozitivní kontrolu označte K+, negativní kontrolu K-, vyšetřovaný alergen názvem alergenu a ředěním 3) Příprava alergenu – viz následující tabulka. Při vyšetření alergie na léky, kdy je dodaná lékařem požadujícím vyšetření pacienta tableta, se o ředění, které se bude testovat, poraďte s VŠ nebo lékařem požadujícím vyšetření. Tablety rozdrťte a rozpusťte v 1 ml PBS a přefiltrujte = koncentrovaný alergen Zkumavka alergen PBS Ředění Naředěný alergen dávejte po 100ul do reakce 1 20ul koncentrovaného alergenu 180ul 10x 2 20ul ze zkumavky 1 180ul 100x 3 20ul ze zkumavky 2 180ul 1000x Poznámka: Při vyšetření alergie na léky, kdy je dodaná lékařem požadujícím vyšetření pacienta tableta, se o ředění, které se bude testovat, poraďte s VŠ nebo lékařem požadujícím vyšetření. Tablety rozdrťte a rozpusťte v 1 ml PBS a přefiltrujte = koncentrovaný alergen 4) Do každé zkumavky napipetujte 20ul prestimulačního roztoku IL-3 (brát vždy zmražený) a přidejte 100ul plné krve 5) Promíchejte na vortexu, inkubace 10 min, 37 °C, vodní lázeň 6) Přidejte do zkumavky: • S pozitivní kontrolou 80ul PBS a 20ul fMLP • S negativní kontrolou 100ul PBS • Pro vyšetřovaný alergen 90ul PBS a 10ul koncentrovaného alergenu nebo 100ul připraveného naředěného alergenu, viz bod 3 (tabulka) – dle požadavků lékaře 7) Promíchejte na vortexu a nechte inkubovat 20 min ve vodní lázni při 37 °C 8) Poté zastavte reakci = degranulace bazofilů - vložením zkumavek na 5 min do ledové lázně 9) Do každé zkumavky přidejte 3 následující monoklonální protilátky: • 5ul anti IgE PE-Cy5 • 10ul CD63 FITC • 10ul CD203c PE 10) Promíchejte na vortexu a nechte inkubovat 30 min ve tmě v lednici 11) Lyzujte na lyzátoru (účel - odstranění erytrocytů) následně centrifugujte 5 min při 2000ot/min 12) Slijte supernatant a sediment opatrně špičkou rozsuspendujte ve 400ul zfiltrovaného fixačního roztoku obsahujícího paraformaldehyd, v laboratoři UKIA označen jako roztok C. 13) Vzorky do změření uchovávejte v lednici (2-8 °C) 14) Měřte na průtokovém cytometru Navios EX nebo Navios pomocí worklistu BAT Hodnocení výsledků - příklady: 1) Pacient alergický na kočku (alergen Fel d1) Pozn: Nomenklatura alergenů vychází z latinského názvu biologického rodu, z něhož alergen pochází. Uvádějí se první 3 písmena (první písmeno je velké), např. Kočka = Felis → alergen Fel Lymfocyty Bazofily (IgE pozitivní) Negativní kontrola CD63 neg. Pozitivní pacient – populace exprimující CD63 Označení alergenu kočky 2) Určení alergie na včelu a vosu Zvýšení pozitivity CD63 a CD203c v porovnání s negativní kontrolou – pacient má pozitivní bazotest na včelu Není přítomno zvýšení pozitivity CD63 a CD203c v porovnání s negativní kontrolou – pacient má negativní bazotest na vosu