1 PORUCHY HEMOSTÁZY 2 Klasická teorie srážení - 1905 ▪ 1860 – Virchow – tromby a tendence embolizace ▪ 1905 – P. Morawitz – klasický model – 4-faktorový model ▪ 1964 – koagulační kaskáda – Vnitřní – všechny faktory jsou v krvi ▪ Testováno aPTT – Vnější – vyžaduje faktory subendoteliálních buněk ▪ Testováno PT 3 Faktory zajišťující fluiditu krve ▪ změna nebo porucha v kterémkoliv z těchto faktorů (nebo kombinovaná porucha) má za následek – fyziologické srážení krve (= hemostáza) ▪ primární ▪ sekundární – patologické srážení krve (= trombóza) ▪ zvýšení rizika ▪ spontánní normální tok krve - dostatečný oběh kdy nedochází ke stagnaci v části řečiště nepoškozená cévní stěna - zachovalý endotel a dostatečná produkce jeho mediátorů normální srážlivost - vyvážená regulace pro a protisrážlivých mechanizmů zachování fluidity krve 4 Primární hemostáza ▪ endotel normálně brání hemostáze sekrecí inhibitorů agregace destiček a koagulace – oxid dusnatý – prostacyklin – trombomodulin – heparan-sulfát – tPA ▪ při poškození endotelu adherují trombocyty k vWf exprimovaném na odkrytém subendotelu prostřednictvím jejich receptorů (GPIb-IX) ▪ dochází k aktivaci destiček a uvolnění jejich mediátorů z granul – tromboxan, PAF, ADP, serotonin → aktivace dalších trombocytů (agregace), vazokonstrikce – exprese integrinů (GPIIb/IIIa) → vazba fibrinu a tvorba def. zátky ▪ trombocyty se podílí i na aktivaci sekundární hemostázy 5 Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. © The Author 2009. For permissions please email: journals.permissions@oxfordjournals.org Destička 6 Sekundární hemostáza ▪ 2 typy aktivace – vnitřní cesta ▪ nastává po kontaktu HMWK, faktorů XII a XI s negativně nabitým povrchem, např. obnažený kolagen v sub-endoteliální vrstvě cév lipoproteiny (chylomikrony, VLDL) stěna bakterií – vnější cesta ▪ tkáňová faktor (TF, fIII) uvolněný z poškozených tkání funguje jako kofaktor f VII a V vnitřní cesta vnější cesta 7 Limitace koagulační kaskády ▪ Dokonalá k vysvětlení procesu in vitro ▪ Zajímavé poznatky z kliniky: – Deficit faktoru XII ▪ asymptomatický, aPTT test je prodloužený – Defekt vysokomolekulárního kininogenu ▪ Bez krvácivé poruchy – Deficit faktoru IX a VIII ▪ Závažné krvácení i přes to, že je vnější část kaskády OK – Deficit faktoru VII ▪ Krvácení i přes intaktní vnitřní dráhu kaskády 8 Buněčný model ▪ Ústřední bod – Vznik trombinu z protrombinu ▪ Předchází však další reakce ▪ Tři fáze – Prolínají se – Překrývají se ▪ Fáze iniciace ▪ Fáze amplifikace ▪ Fáze propagace 9 Fáze iniciace ▪ TF – exprimován pouze po poškození – Subendoteliálně ▪ Buňky hladké svaloviny, fibroblasty, makrofágy, endoteliální bb – V cirkulaci ▪ Destičky – malé množství ▪ Na povrchu buněk nesoucích TF – Kontakt s faktorem VII, aktivace komplexu TF/VIIa – Aktivace faktoru X a IX – Konverze protrombinu na trombin ▪ V této fázi je vyrobeno jen malé množství trombinu – Inhibiční faktory ▪ TFPI – inhibiční komplex TFPI/Xa ▪ Antitrombin III 10 Amplifikační fáze ▪ Probíhá na povrchu detiček – Destičky adherují na vaskulání a extravaskulární struktury ▪ Von Willebrandův faktor 1) TF aktivuje destičky – Aktivace zahrnuje ▪ Nepravidelný tvar, pseudopodia (zvětšení povrchu) ▪ Exprese receptorů a vazných míst ▪ Vyplavení serotoninu, Ca, ADP, faktoru V, fibrinogen, PDGF, vWF 2) Aktivace faktoru V, VIII a XI – Faktor V je na povrchu destiček aktivován trombinem z iniciační fáze – Trombin aktivuje faktor VIII na destičkách ▪ vWF se odděluje z komplexu a umožňuje další adhezi ▪ Faktor VIII zůstává na povrchu destiček – Trombin aktivuje i faktor XI 11 Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. © The Author 2009. For permissions please email: journals.permissions@oxfordjournals.org Destička 12 Amplifikační fáze II 3) Tenázový komplex – Aktivovaný faktor IXa se váže na VIIIa – tenázový komplex (VIIIa/Ixa) ▪ Konvertuje faktor X na aktivní Xa 4) Protrombinázový komplex – Aktivovaný faktor Xa tvoří komplex s Va 5) Tvorba trombinu – Protrombináza konvertuje protrombin na velké množství trombinu ▪ 300 000 účinější než faktor Xa 13 Propagační fáze ▪ Další produkce trombinu ▪ Trombin konvertuje fibrinogen na fibrin ▪ Tvorba stabilní fibrinové sítě – Účast faktoru XIIIa 14 Funkce trombinu 15 Fibrinogen - fibrin ▪ 3 páry polypeptidů ([A-α][B-β][γ])2 – 340kDa ▪ trombin (serinová proteáza) odštěpuje fibrinopeptidy A a B a generuje monomery fibrinu (α-β-γ)2 ▪ monomery spontánně agregují a vytváří fibrinovou síť ▪ trombin rovněž aktivuje fXIII (transglutamináza), který tvoří příčné vazby mezi polymery fibrinu 16 Regulační mechanizmy srážení krve ▪ rychlost toku krve ▪ koncentrace inhibičních faktorů – (1) kontrola na úrovni trombinu ▪ antitrombin III (a heparan-sulfát) inhibuje rovněž fVII, X, XI a XII ▪ a2-makroglobulin ▪ heparin kofaktor II ▪ a1-antitrypsin – (2) kontrola na úrovni faktoru Xa ▪ protein C + trombomodulin ▪ protein S ▪ aktivita fibrinolýzy 17 Fibrinolytický systém ▪ plazmin (serinová proteáza) cirkuluje jako neaktivní proenzym (plazminogen) – volný plazmin rychle inhibován α2- antiplasminem ▪ aktivace plazminogenu pomocí tPA (endotel. bb.) a ukokinázy (epitel. bb.) na plazmin ▪ degradace fibrinu na degradační produkty ▪ aktivita tPA inhibována PAI-1 18 Heparin vs. Warfarin 19 Budoucnost 20 Poruchy krevního srážení ▪ (A) hypokoagulační stavy (krvácivé diatézy) – defekt primární hemostázy ▪ poruchy cévní stěny (senilní purpura) ▪ trombocytopenie a trombocytopatie ▪ von Willebrandova choroba – koagulopatie ▪ hemofilie A a B ▪ chronické jaterní onemocnění ▪ (B) hyperkoagulační stavy (trombofilie) – hereditární ▪ activated protein C resistance (APCR) – získané ▪ (C) kombinované – syndrom diseminované intravaskulární koagulace (DIC) 21 Defekty primární hemostázy ▪ projevy: petechie, purpura, epistaxe, krvácení z dásní či do GIT, hematurie, menoragie ▪ (1) poruchy cévní stěny (vaskulopatie) – vrozené ▪ telengiectasia hereditaria (m. Rendu-Osler) AD, oslabení úseků stěny cév → telengiektazie (kůže, sliznice, plíce, urogenitální trakt) ▪ Ehlers-Danlos a Marfanův syndrom defekt struktury pojiva (kolagen) – získané ▪ senilní purpura ▪ bakteriální toxiny (spála, spalničky) ▪ karence vit. C (scorbut) ▪ imunokomplexy (Henoch-Schönleinova purpura) ▪ (2) trombocytopenie ▪ (3) trombocytopatie ▪ (4) von Willebrandova choroba 22 Trombocytopenie a trombocytopatie ▪ počet trombocytů 150 – 400 000/μl (1.5–41011/l) ▪ v cirkulaci přežívají cca 8-10 dní ▪ (A) trombocytopenie = snížení počtu ▪ <50 000/μl - zvýšené riziko krvácení ▪ <20 000/μl – významné riziko ▪ <5 000/μl – extrémně vysoké riziko – primární nebo sekundární – etiologie ▪ snížená produkce  aplastická anemie  myelodysplastický syndrom  myelofibróza ▪ destrukce  autoimunitní - idiopatická trombocytopenická purpura (ITP)  poléková  hypersplenismus ▪ zvýšená spotřeba  DIC  trombotická trombocytopenická purpura (TTP) ▪ (B) trombocytopatie = porucha funkce – porucha adheze a agregace ▪ Bernard-Soulierův syndrom (porucha receptoru GPIb-IX) ▪ Glanzmannova trombastenie (porucha receptoru GPIIb-IIIa) – porucha degranulace ▪ Heřmanského-Pudlákův syndrom ▪ Chédiak-Higashiho syndrom 23 von Willebrandova nemoc ▪ nejčastější vrozená porucha koagulace ▪ skupina stavů vedoucích k snížení hladiny vWf v plazmě – porucha adheze trombocytů, tedy primární hemostázy – vWf je rovněž plazm. nosič fVIII (bez něho je nestabilní a rychle degradován) → tedy i porucha sekundární hemostázy ▪ několik typů vW nemoci – typ 1 (~75%) – snížení koncentrace vWf – typ 2 (~20%) – normální koncentrace nefunkčního vWf ▪ porucha vazby na destičky (typ 2A) ▪ porucha vazby na kolagen subendoteliální vrstvy (typ 2B) ▪ porucha transportu fVIII (typ 2N) – typ 3 – absolutní deficit vWf (homozygoti) 24 Defekty „sekundární hemostázy“ ▪ typické krvácení do tkání (hematomy), např. klouby, svaly, mozek, retroperitoneum, nejsou petechie a purpury ▪ (A) vrozené poruchy – hemofilie A (Xq-chromozom vázaná) – defekt fVIII ▪ fVIII je kofaktor při aktivaci fX na fXa v reakci katalyzované fIXa ▪ snížení koncentrace až na 25% normálů nepůsobí koagulační poruchu, snížení na 25-1% mírná forma, <1% těžká forma ▪ >150 bodových mutací v fVIII genu – velká fenotypová variabilita!!! ▪ prevalence v mužské populaci 1:5,000 až 1:10,000 – hemofilie B (Xq-chromozom vázaná) – defekt fIX ▪ prevalence 10x menší než hemofilie A ▪ >300 bodových mutací v fIX genu (85% bodové, 3% krátké delece a 12% rozsáhlé delece) – defekty ostatních faktorů ▪ vzácné, většinou autozomálně recesivní, klinicky manifestní poruchy jen při těžkém deficitu  afibrinogenemie (defekt fI)  hemofilie C (defekt fXI) – Aškenazy Židé  ostatní ▪ (B) získané poruchy – jaterní insuficience/selhání – nedostatek vitaminu K (porucha resorpce tuků ve střevě) – DIC 25 DIC (konzumpční koagulopatie) ▪ zpočátku nadměrná koagulace (trombotický stav), posléze vyčerpání koagul. faktorů (krvácivý stav) ▪ koagulace při DIC je místně neohraničená a není primárně reakcí na poškození rečiště ▪ patogeneze – v cirkulaci není normálně přítomen TF!!! ▪ endotel ani kr. bb. jej na svém povrchu neprodukují – při některých patologických stavech se vyskytuje a aktivuje faktor VII (a následně vnější cestu kr. srážení) ▪ patologické zdroje TF  buňky jiných tkání – např. bb. plodu při porodu, rozsáhlá poranění, rozsev nádorových bb. při operaci atd.  patologické kr. elementy exprimující TF – např. při myelo- a lymfoproliferačních nemocech  patologicky aktivované endotelie a monocyty, které začnou exprimovat TF v membráně – např. endotoxinem při sepsi  TF z cytoplazmy erytrocytů uvolněný při hemolýze ▪ důsledky – 1. fáze - tvorba mikrotrombů v mikrocirkulaci ▪ ischemie až gangrény – 2. fáze - hypo- až afibrinogenemie, trombocytopenie ▪ krvácení do orgánů – patologicky vystupňovaná fibrinolýza 26 Hyperkoagulační stavy ▪ vedou ke zvýšení rizika nebo až spontánním a často opakovaným venózním trombózám a trombemboliím (do plic nejčastěji), popř. ke komplikacím těhotenství a infertilitě ▪ (A) vrozené trombofilie – (1) poruchy tvorby inhibitorů srážení ▪ defekt AT III (AR) ▪ defekt proteinů C a S (AD) ▪ syndrom rezistence fV k aktivovanému proteinu C (APCR)  nejčastější vrozená porucha (“Leidenská” mutace fV) ▪ mutace protrormbinového genu (promotor → kvantitativní efekt) ▪ hyperhomocysteinemie (mutace s genu pro MTHFR) ▪ antifosfolipidový syndrom  protilátky anti-kardiolipinové, lupus antikoagulans aj.  patofyziologie nejasná – (2) porucha fibrinolýzy ▪ LP(a) ▪  PAI-1 (promotor → kvantitativní efekt) ▪ (B) získané trombofilie – (1) klin. situace a komplikace léčby ▪ imobilizace ▪ hyperestrogenní stavy (těhotenství, orální kontraceptiva, HRT) – (2) patologické stavy ▪ ateroskleróza ▪ obezita ( PAI-1) ▪ hyperviskózní syndromy  polycytémia vera, trombocytemie, sek. polyglobulie, gamapatie) ▪ nádorová onem. ▪ srdeční selhání ▪ hyperlipidémie, nefrot. syndrom ▪ žilní insuficience 27 Hyperhomocysteinemie ▪ homocystein je meziprodukt přeměny methioninu v methioninovém cyklu – je buď dále metabolizován na cystein – nebo remetylován zpět na methionin (ve folátovém cyklu) ▪ nutná přítomnost několika enzymů a jejich kofaktorů (vitaminů skupiny B, kyseliny listové) ▪ důvodem poruchy metabolizmu homocysteinu a následné HHcy mohou být genetické a nutriční faktory – mutace v genech kódujících enzymy – snížený příjem vitaminu B6, B12 a kyseliny listové ▪ HHcy =patologické zvýšení plazm. koncentrace homocysteinu ▪ HHcy je nezávislým rizikovým faktorem aterosklerózy a trombembolizmu, poruch fertility a některých vývojových a neurologických abnormalit (rozštěpové vady páteře) ▪ homocystein způsobuje endotelovou dysfunkci a iniciuje apoptózu ▪ (A) monogenní homocystinurie – deficit cystathionin--syntázy vede v homozygotním stavu ke značné elevaci plazmatických hladin Hc – poměrně vzácné onemocnění ▪ (B) tzv. mírná hyperhomocysteinemie – polymorfizmus v genu pro metylentetrahydrofolátreduktázu (MTHFR) 28 Hluboká žilní trombóza a následná plicní embolie 29 Princip testů ▪ Smícháním zkoumané plazmy, tkáňového tromboplastinu a vápenatých iontů se spustí vnější část koagulační kaskády. ▪ Kaskáda končí vytvořením fibrinové sraženiny. ▪ Výsledkem testu je čas od smíchání uvedených látek do vytvoření sraženiny. 30 Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT)▪ informace o funkčnosti vnitřní části koagulační kaskády. ▪ Na rozdíl od Quickova testu koagulační kaskádu spouští kaolin (Aktivátor), který zastupuje záporně nabitý povrch poraněné cévy. ▪ Pro některé reakce vnitřní části koagulační kaskády (zejména pro aktivaci faktoru X) je nutná přítomnost fosfolipidu - destičkového faktoru 3 (PF3) z aktivovaných trombocytů. ▪ Plazma používaná v APTT testu krevní destičky neobsahuje, je třeba fosfolipid k reakci přidat. Místo PF3 se používá tkáňový fosfolipid kefalin (Parciální Tromboplastin). 31 Výsledná hodnota APTT testu ▪ udává čas od spuštění koagulační kaskády vápenatými ionty do vytvoření fibrinové sraženiny. ▪ Normální hodnoty se pohybují mezi 25-39 s. ▪ Příčinou prodloužení APTT je například – nedostatek koagulačních faktorů vnitřní části kaskády (hlavně VIII a IX), – terapie heparinem, – výrazné předávkování warfarinem. ▪ U heparinizovaných pacientů je doporučená hodnota APTT 1,5 až 2,4 násobek normy. 32 Quickův test (prothrombin time, PT) ▪ informuje o rychlosti přeměny protrombinu na trombin působením tkáňového tromboplastinu. ▪ Tkáňový tromboplastin je tvořen lipoproteinovou složkou (tzv. tkáňovým faktorem) a složkou fosfolipidovou (rovněž tvořenou v tkáních). ▪ Tímto testem se určuje aktivita tzv. protrombinového komplexu a funkčnost vnější části koagulační kaskády. ▪ Nejčastěji se používá při testování účinnosti antikoagulační léčby antagonisty vitamínu K (warfarin). 33 34 P450 ▪ CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků ▪ CYP2D6 – 20% ▪ CYP2C9 + CYP2C19- 15 % ▪ CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní ▪ Např. ovlivňuje metabolismus warfarinu, acenocoumarolu a dalších léků (phenotyoin, tolbutamid, glipizide a další perorální antidiabetika typu sulfonylurey). 35 Cytochrom P4502C9 (CYP2C9) ▪ dvě alelické varianty genu CYP2C9 1, 2 – CYP2C9*2 ▪ záměna C430T v exonu 3 vede k substituci Arg144Cys – CYP2C9*3 ▪ záměna A1075C v exonu 7 vede k substituci Ile359Leu ▪ in vitro má CYP2C9*1 normální, zatímco varianta CYP2C9*2 vykazuje menší a CYP2C9*3 podstatně menší enzymatickou aktivitu 3, 4 ▪ fenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na CYP2C9 1. Stubbins MJ et al: Pharmacogenetics 1996; 6:429-329 3. Rettie AE et al: Pharmacogenetics 1994; 4:39-42 2. Veronese ME et al: Biochem J 1993; 289:533-8 4. Haining RL et al: Arch Biochem Biophys 1996; 333:447-58 36 Dávka / antikoagulační efekt warfarinu 12. Alving BM et al: Arch Intern Med 1985; 145:499-501 13. Oldenburg J et al: Br J Hematology 1997; 98:240-4 polymorfismus cytochromu P450 CYP2C9*2 CYP2C9*3 rezistence na warfarin - jaterní receptor pro warfarin mutace FIX genetické faktory vlivy prostředí vztah dávka / odpověď na warfarin 12 13 37 CYP2C9 ACTIVITA Prescribed Daily Warfarin Dose and CYP2C9 Genotype Warfarin Dose* Genotype 5.63 (2.56) *1/*1 4.88 (2.57) *1/*2 3.32 (0.94) *1/*3 4.07 (1.48) *2/*2 2.34 (0.35) *2/*3 1.60 (0.81) *3/*3 *Data presented as mean (SD) daily dose in mg From: Higashi MK, et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulationrelated outcomes during warfarin therapy. JAMA 287:1690-1698, 2002. 38 Klinické projevy polymorfismu CYP2C9 ▪ předávkování při zahájení antikoagulace standardními režimy 14, 16, 17, 18, 19 ▪ nižší udržovací dávka nutná k dosažení a udržení terapeutického rozmezí 11, 15, 16, 18, 19 ▪ vyšší riziko předávkování dané interakcemi s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 17, 21 ▪ nestabilita antikoagulační terapie 15, 16 ▪ delší přetrvávání antikoagulačního efektu po přerušení léčby nebo snížení dávky warfarinu 14. Aithal GP et al: Lancet 1999; 353:717-9 16. Higashi HK et al: JAMA 2002; 287:1690-8 15. Taube J et al: Blood 2000; 96:1816-9 17. Verstuyft C et al: Eur J Clin Pharmacol 2003; 58:739-45 39 Interakce s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 Soutěž o substrát Enzymový induktor Enzymový inhibitor ASA a většina NSAID rifampicin fluvoxamin (ostatní SSRI slabí) fenobarbital, fenytoin fenobarbital, fenytoin omeprazol S-warfarin karbamazepin inhibitory HMG-CoA reduktázy losartan tolbutamid tolbutamid cimetidin (slabý) sulfonamidy, dapson azolová antimykotika (slabá) diazepam, tenazepam ritonavir fluoxetin, moclobemid desethylamiodaron zidovudin 17, 20, 21 20. Topinková E et al: Postgrad Med 2002; 5:477-82 21. Naganuma M et al: J Cardiovasc Pharmacol Ther 2001; 6:636-7 40 Rychlost metabolismu ▪ Dle aktivity enzymu může být populace rozdělena do čtyř hlavních skupin - pomalí metabolizátoři (PM), intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři (EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM). ▪ Většina jedinců bílé populace patří mezi tzv.extenzivní metabolizátory (EM), u nichž jsou léčiva metabolizovány předpokládanou rychlostí. ▪ 5-10 % jedinců je geneticky determinováno jako pomalí metabolizátoři (PM), kteří mají zpomalené odbourávání látek metabolizovaných a jsou ohroženi vyšším výskytem nežádoucích účinků léčby. ▪ Intermedientní metabolizátoři (IM) jsou zastoupeni v 10-15 % a při dlouhodobé léčbě jsou svými reakcemi na léčbu srovnatelní se skupinou PM. ▪ U ultrarychlých metabolizátorů (UM) probíhá metabolizace intenzivněji a klinicky nereagují na běžné dávky léků a je zastoupena v 5-10 %. 41 42 Praktikum anestezie 1) preparace v. jugularis - aplikace 2ml hypotonického roztoku 2) laparotomie - ligatura v. cava inf. 3) torakotomie - punkce srdeční komory – odběr 4) excise podvázaného segmentu + heparin 4U/kg 1) preparace v. jugularis - aplikace 2ml hypotonického roztoku 2) laparotomie - ligatura v. cava inf. 3) torakotomie - punkce srdeční komory – odběr 4) excise podvázaného segmentu 1) váha trombu 2) aPTT 1) váha trombu 2) aPTT