Metabolizmus bilirubinu, ikterus Praktikum – experimentálně navozený obstrukční ikterus Ústav patologické fyziologie LF MU Metabolizmus bilirubinu Historické aspekty metabolizmu bilirubinu • 1916 – van den Bergh • 2 typy bilirubinu • 1933 – Hans Fischer • struktura bilirubinu • 1956 – Edmund Talafant • transformace bilirubinu v játrech • 1968 – Tenhunen • hemoxygenáza • 1987 – Stocker • antioxidační vlastnosti bilirubinu Syntéza hemu • hl. lokalizace • v kostní dřeni – tvorba Hb - erytropoéza • v játrech - cytochrom P450 - metabolismus léků a toxinů • probíhá z části v mitochondriích a z části v cytosolu – 8 reakcí • výchozí látkou je sukcinyl-CoA (z citrátového cyklu) a glycin • rychlost limitujícím enzymem je ALA syntetáza • olovo (otrava olovem) inhibuje 3 enzymy syntézy hemu a vede • k nedostatečné syntéze a tedy anémii • kumulaci meziproduktů – toxické Metabolizmus bilirubinu • bilirubin vzniká degradací hemu (80 % z hemoglobinu) • myoglobin, cytochromy • intravaskulární hemolýza • fyziologicky 10-20% • haptoglobin, hemopexin • v retikuloendoteliálních buňkách • slezina, játra • enzym hemoxygenáza • mikrozomy, indukován zvýšeným hemem • určuje rychlost produkce bilirubinu • biliverdin • biliverdinreduktáza • v cytosolu • takto vzniklý bilirubin (=nekonjugovaný, nepřímý) není rozpustný ve vodě • v plazmě se váže na albumin • nedostává se do moči Metabolizmus bilirubinu • albumin • dost vazebných míst a velká afinita pro bilirubin - silná a slabá vazba • (kompetice – léky, mastné kyseliny) • za normálních podmínek koncentrace bilirubinu v plazmě velmi nízká • může být vytěsněn některými látkami (salicyláty, sulfonamidy) • důležité u kojenců • v jaterních kapilárách se odděluje od albuminu a pomocí bílkovinného nosiče se dostává do hepatocytu • velká kapacita • vazba bilirubinu na transportní proteiny • rychlá glukuronizace a vylučování do žluči • podléhá konjugaci – mění se na ve vodě rozpustnou sloučeninu a může být vyloučen do žluči Metabolizmus bilirubinu v hepatocytu • v hepatocytu vázaný na proteiny Y a Z • enzym uridindifosfát-glukuronyl- transferáza (UDPGT1) • indukce fenobarbitalem • metabolizmus některých léků • úplná aktivace až po narození • v endoplazmatickém retikulu konjugace bilirubinu s glukuronovou kyselinou za vzniku mono- a diglukuronidů • konjugovaný bilirubin (=přímý) • ve vodě rozpustný • vyloučení z buňky : ATP-dependentní mnohodruhový transportér aniontu (cMOAT=MRP2) • vylučování glukuronidu žlučí je faktor omezující rychlost transportu bilirubinu z plazmy do žluči • proti konc. gradientu Metabolizmus bilirubinu • žlučovými cestami se bilirubin dostává do střeva • z části dekonjugace (β-glukuronidáza) a zpětná resorpce – enterohepatální oběh • část nekonjugovaného bilirubinu v krvi – neprochází přes glomerulární membránu • z části vyloučen stolicí • část přeměněna střevními bakteriemi na bezbarvé urobilinogeny • část z nich se vstřebá a je vyloučena močí, • zbytek se oxiduje na hnědé urobiliny (zbarvení stolice) Alternativní dráhy metabolizmu bilirubinu • cytochrom P-448 • v játrech nízká exprese • zvýšení u hyperbilirubinémie • indukovatelné • indol-3-karbinol • přímá sekrece • nekonjugovaný bilirubin • z cévy přes stěnu střeva do GIT • pasivní difuze • enzym bilirubinoxidáza • u člověka malý význam • perorální podání enzymu? Ikterus • žluté zbarvení kůže a sliznic způsobené zvýšeným obsahem bilirubinu v plazmě • normální hodnota je do 17 umol/l • subikterus • malé zvýšení (35 - 40 umol/l), nemusí být zřetelné • hyperbilirubinemie = zvýšená hladina bilirubinu v plazmě • klinický symptom, upozorňuje na přítomnost jiného problému • játra, žlučové cesty, hemolýza • může mít protektivní účinky • významné antioxidační působení • snížené kardiovaskulární riziko • u konjugované hyperbilirubinemie výraznější ikterus • patofyziologické dělení • pre- a postmikrozomální Prehepatální ikterus • nadměrné zatížení jaterní buňky bilirubinem • zvýšená nabídka • zvýšený přísun do střeva • většinou následkem hemolýzy • vrozené • získané • inkompatibilní transfuze • zvýšený nekonjugovaný bilirubin • v moči urobilinogen • bilirubin není v moči • hypercholická stolice Hepatální ikterus • způsoben poruchou na úrovni jater • porucha v metabolizmu bilirubinu • vychytávání, konjugace a vylučování z hepatocytu • rozpad hepatocytů a uvolnění bilirubinu do cirkulace • zvýšený bilirubin může být konjugovaný i nekonjugovaný, závisí na typu poruchy • v moči urobilinogen i bilirubin • jaterní poškození • hepatitida, cirhóza, léky, chemikálie • dědičné hyperbilirubinemie • poškození jaterní architektury • komunikace mezi jaterními a žlučovými kapilárami – bil. v moči • hypocholická stolice • nižší produkce bilirubinu Dědičné hyperbilirubinemie • nekonjugované • Gilbertův syndrom • Crigler-Najjarův syndrom • konjugované • Dubin-Johnsonův syndrom • Rotorův syndrom Gilbertův syndrom • geneticky podmíněné onemocnění • autozomálně recesivní • mírná chronická nekonjugovaná hyperbilirubinemie • bez přítomnosti jaterního onemocnění či hemolýzy • populační frekvence 2 – 5% • mutace v promotoru genu pro UDPGT • snížení aktivity enzymu na cca. 30% normální hodnoty • benigní, celoživotní hyperbilirubinémie • bilirubin do 100 μmol/l • reakce na fenobarbital • ikterus často nevýrazný • zhoršení při stresu, hladovění a fyzické námaze Crigler-Najjarův syndrom • těžká forma hereditární hyperbilirubinemie • autozomálně recesivní • velmi vysoké hodnoty nekonjugovaného bilirubinu v krvi • je možné prokázat nedostatek UDPGT v játrech • Typ I • bilirubin > 350 μmol/l • v játrech úplně chybí UDPGT • způsoben mutací v 1 z 5 exonů genu pro UDPGT • fototerapie, bez léčby jádrový ikterus • není reakce na fenobarbital • Typ II • bilirubin < 350 μmol/l • enzymu konjugujícího bilirubin je méně než 10% • mutace v exonech genu pro UDPGT • reziduální činnost enzymu vysvětluje nižší koncentraci bilirubinu než u typu I Gen pro UDPGT1 • chromozom 2 • exony 2 – 5 ve všech izoformách • typ exonu 1 zodpovídá za substrátovou specifitu Mutace v genu pro UDPGT1 Familiární konjugované hyperbilirubinémie • Dubin-Johnsonův syndrom • benigní familiární převážně konjugovaná hyperbilirubinémie • autozomálně recesivní • mutace v genu pro cMOAT (=MRP2) • v hepatocytech se ukládá hnědé barvivo • Rotorův syndrom • podobný Dubin-Johnsonovu syndromu • hlavní rozdíl – nepřítomnost hnědého barviva v hepatocytu Posthepatální ikterus (cholestatický) • výsledek poruchy (částečné nebo kompletní) vylučování bilirubinu do střeva po jeho konjugaci v hepatocytech • cholestáza – porucha odtoku žluči - intrahepatální – porucha uvnitř jater - extrahepatální – zablokování žlučovodu  žlučové kameny, nádor jater nebo žlučových cest, záněty žlučových cest • zvýšený konjugovaný bilirubin • při úplné obstrukci v moči jen bilirubin • acholická stolice, urobilinogen není v moči Novorozenecká hyperbilirubinemie • fyziologická novorozenecká žloutenka (icterus neonatorum) • zvýšený zánik erytrocytů • nedokonalé jaterní konjugační a transportní systémy • zvýšené vstřebávání bilirubinu a jeho snížená vazba na albumin • nekonjugovaná hyperbilirubinemie • vrchol v prvních 5 dnech, téměř u poloviny novorozenců • kernikterus (jádrový ikterus) • u dětí předčasně narozených, s hemolytickou nemocí a s novorozeneckou hepatitidou • výrazné zvýšení koncentrace bilirubinu v krvi • proniká přes hematoencefalickou bariéru – poškození bazálních ganglií Bilirubin a CNS Terapie ikteru • fenobarbital • indukce konjugačního enzymu UDPGT • fototerapie • rozklad nekonjugovaného bilirubinu na produkty rozpustné ve vodě (lumibilirubin) • inhibice hemoxygenázy Fototerapie Hemoxygenáza – protektivní aspekty • 2 izoformy • indukovatelná HO-1 • konstitutivní HO-2 • zvýšená exprese u kardiovaskulárních a zánětlivých onemocnění Biologické účinky CO • kardiovaskulární systém • inhibice agregace trombocytů • relaxace hladké svaloviny • zánět • ↑ IL-10 • ↓ TNF-α a IL-1β • ovlivnění buněčné proliferace • cykliny • přímý antiapoptotický účinek • metabolizmus • stimulace sekrece inzulinu • kuřáci • vyšší CO v krvi Protektivní účinky biliverdinreduktázy • lokalizace • cytoplazma • jádro • transkripční faktor • proteinkinázová aktivita • intracelulární signalizace • ovlivnění exprese HO-1 • homeostáza glukózy Praktikum – část I • cílem praktika je • vytvořit model obstrukčního ikteru • část I • sledovat změny metabolizmu bilirubinu • část II • praktický postup – část I • anestezie • laparotomie • podvaz ductus choledochus Praktikum II – průkaz ikteru Praktikum II - postup • probíhá týden po podvazu ductus choledochus • zvážení potkana, narkóza • pozorování změn v zabarvení zvířete • laparotomie • punkce močového měchýře • indikátorové papírky – vyšetření přítomnosti bilirubinu a urobilinogenu • srdeční punkce, odběr krve a jater • stanovení koncentrace bilirubinu v séru • vážení jater Stanovení bilirubinu • van den Berghova reakce • reakce bilirubinu s kyselinou sulfanilovou – vzniká azobarvivo – fotometrické stanovení • konjugovaný bilirubin reaguje rychle • nekonjugovaný pomalu • urychlení metanolem, kofeinem • uvolňují bilirubin z vazby • hodnota se získá odečtením přímého od celkového bilirubinu • analytická fáze • vzorek nesmí být hemolytický • chránit před světlem • zpracovat co nejdříve • interference van den Berghova reakce