Možnosti využití kardiomyocytů vytvořených z indukovaných pluripotentních kmenových buněk konkrétního pacienta v medicíně Doc. MUDr. Markéta Bébarová, Ph.D. Fyziologický ústav Lékařská fakulta Masarykova univerzita Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Co je to? • kardiomyocyty vytvořené z lidských pluripotentních kmenových buněk indukovaných z jiných diferencovaných buněk, obvykle z fibroblastů (kůže, moč) Nejvhodnější buněčný model ke studiu lidských chorob! • výhody Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Co je to? - neomezený zdroj jakýchkoliv specializovaných buněk - modelování srdečních (i jiných) geneticky podmíněných chorob v kultivační misce - umožňují charakterizovat biologické mechanismy, které jsou podkladem lidských chorob - výkonný model pro personalizovaný skríning léčiv • kardiomyocyty vytvořené z lidských pluripotentních kmenových buněk indukovaných z jiných diferencovaných buněk, obvykle z fibroblastů (kůže, moč) • nevýhody - nezralé buňky, odlišný fenotyp od adultních buněk - lišící se buněčné charakteristiky díky různým diferenciačním protokolům užívaným v jednotlivých studiích - náklady Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Co je to? Nejvhodnější buněčný model ke studiu lidských chorob! • výhody - neomezený zdroj jakýchkoliv specializovaných buněk • kardiomyocyty vytvořené z lidských pluripotentních kmenových buněk indukovaných z jiných diferencovaných buněk, obvykle z fibroblastů (kůže, moč) • 2006 – Takahashi a Yamanaka odhalili, jak reprogramovat diferencovanou buňku na pluripotentní (podobnou embryonálním kmenovým buňkám) Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Historie • pokračovalo úsilí vyvinout protokol, který dá vzniknout velkému počtu kardiomyocytů odvozených z hiPSC (definované kultivační médium, specifické matrice, komerčně dostupná diferenciační média, …) • v současnosti k dispozici poměrně jednoduchý a chemicky definovaný 3-krokový protokol, který dává vzniknout populaci buněk tvořené až z 80-90% kardiomyocyty • 2009 – první popis kardiomyocytů odvozených z hiPSC (Zhang et al.) Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Zralost • velmi důležitá pro následné využití buněk • obecně vykazují nezralé znaky v: - morfologii - cytoskeletálních proteinech - organizaci (chybějící t-tubuly, dezorganizované sarkomery, nezralé hospodaření s Ca2+) dospělý lidský komorový KM KM odvozený z hiPSC Meijer van Putten et al., Front Physiol 2015; 6: 7 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Struktura Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Struktura Yang et al., Circ Res 2014; 114: 511-23 KM odvozený z hiPSC adultní KM potkana Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Struktura Yang et al., Circ Res 2014; 114: 511-23 časný KM odvozený z hiPSC pozdní KM odvozený z hiPSC Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Zralost • velmi důležitá pro následné využití buněk - exprese iontových kanálů • obecně vykazují nezralé znaky v: - morfologii - cytoskeletálních proteinech - organizaci (chybějící t-tubuly, dezorganizované sarkomery, nezralé hospodaření s Ca2+) Ganong´s Review of Medical Physiology, 23rd edition http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_hea rt_cardiac_electrophysiology Elektrofyziologické charakteristiky srdečních buněk Barbuti et al., Dev Dyn 2016; 245: 1145-58 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Funkce Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Funkce Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Funkce Meijer van Putten et al., Front Physiol 2015; 6: 7 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Funkce Yang et al., Circ Res 2014; 114: 511-23 časný KM odvozený z hiPSC pozdní KM odvozený z hiPSC Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Zralost Yang et al., Circ Res 2014; 114: 511-23 Úvod Lidské odvozené kardiomyocyty – Využití Yang et al., Circ Res 2014; 114: 511-23 Vybrané studie používající lidské odvozené kardiomyocyty Modelování dědičných arytmií (http://img.medscape.com/pi/emed/ckb/emergency_medicine/756148-756734-760963-1575961.jpg) Jervell A, Lange-Nielsen F. Congenital deaf-mutism, functional heart disease with prolongation of the Q-T interval and sudden death. Am Heart J 1957;54:59-68. Romano C, Gemme G, Pongiglione R. Aritmie cardiarche rare dell´eta´pediatrica. Clin Pediatr 1963;45:656-83. Ward OC. A new familial cardiac syndrome in children. J Ir Med Assoc 1964;54:103-6. QTc (Bazett) = 530 ms (http://bestpractice.bmj.com/best-practice/monograph/829/diagnosis/step-by-step.html; z osobní sbírky Dr. J.P. Dauberta) Syndrom dlouhého QT (LQTS) Anderson et al., Am Heart J 2002; 144: 769-81 Dědičný LQTS podtyp gen bílkovina iontový proud dysfunkce poprvé popsáno LQTS 1 KCNQ1 Kv7.1 IKs  Keating et al. (1991) LQTS 2 KCNH2 Kv11.1 (hERG) IKr  Curran et al. (1995) LQTS 3 SCN5A Nav1.5 INa  Wang et al. (1995) LQTS 4 ANK2 Ankyrin B kotvicí protein (INaK, INaCa, INa)  Mohler et al. (2003) LQTS 5 KCNE1 minK IKs  Schulze-Bahr et al. (1997) LQTS 6 KCNE2 MiRP1 IKr  Abbott et al. (1999) LQTS 7 KCNJ2 Kir2.1 IK1  Plaster et al. (2001) LQTS 8 CACNA1C Cav1.2 ICa-L  Splawski et al. (2004) LQTS 9 CAV3 M-kaveolin kotvicí protein (INa)  Vatta et al. (2006) LQTS 10 SCN4B Nav.4 INa  Medeiros-Domingo et al. (2007) LQTS 11 AKAP9 Yotiao kotvicí protein (IKs)  Chen et al. (2007) LQTS 12 SNTA1 1-syntrofin protein cytoskeletu (INa)  Ueda et al. (2008) LQTS 13 KCNJ5 Kir3.4 IK(Ach)  Yang et al. (2010) http://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_hea rt_cardiac_electrophysiology Dědičný LQTS podtyp gen bílkovina iontový proud dysfunkce poprvé popsáno LQTS 1 KCNQ1 Kv7.1 IKs  Keating et al. (1991) LQTS 2 KCNH2 Kv11.1 (hERG) IKr  Curran et al. (1995) LQTS 3 SCN5A Nav1.5 INa  Wang et al. (1995) LQTS 4 ANK2 Ankyrin B kotvicí protein (INaK, INaCa, INa)  Mohler et al. (2003) LQTS 5 KCNE1 minK IKs  Schulze-Bahr et al. (1997) LQTS 6 KCNE2 MiRP1 IKr  Abbott et al. (1999) LQTS 7 KCNJ2 Kir2.1 IK1  Plaster et al. (2001) LQTS 8 CACNA1C Cav1.2 ICa-L  Splawski et al. (2004) LQTS 9 CAV3 M-kaveolin kotvicí protein (INa)  Vatta et al. (2006) LQTS 10 SCN4B Nav.4 INa  Medeiros-Domingo et al. (2007) LQTS 11 AKAP9 Yotiao kotvicí protein (IKs)  Chen et al. (2007) LQTS 12 SNTA1 1-syntrofin protein cytoskeletu (INa)  Ueda et al. (2008) LQTS 13 KCNJ5 Kir3.4 IK(Ach)  Yang et al. (2010) Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Modelování LQT2 Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Modelování LQT2 Whole Cell Patch Clamp voltage clamp mode Im Um Ic Ic current clamp mode Im Um ICa-L INa Ito IK, IK1 Whole Cell Patch Clamp Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Modelování LQT2 Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Modelování LQT2 Jouni et al., J Am Heart Assoc 2015; 4: e002159 Modelování LQT2 Farmakologické studie Vybrané studie používající lidské odvozené kardiomyocyty Mitragynin • hlavní bioaktivní sloučenina v extraktu z listů rostliny Mitragyna speciosa (Kratom) (léčivý rostlinný stimulant s efekty podobnými opioidům; léčba chronické bolesti a symptomů z odnětí opioidů) • popsány smrtelné příhody asociované se zástavou srdce Lu et al., PLoS One 2014; 9: e115648 • inhibice IKr pozorována v KM odvozených z hiPSC Mitragynin • hlavní bioaktivní sloučenina v extraktu z listů rostliny Mitragyna speciosa (Kratom) (léčivý rostlinný stimulant s efekty podobnými opioidům; léčba chronické bolesti a symptomů z odnětí opioidů) • popsány smrtelné příhody asociované se zástavou srdce Lu et al., PLoS One 2014; 9: e115648 • inhibice IKr pozorována v KM odvozených z hiPSChttp://tmedweb.tulane.edu/tmedwiki/doku.php/intro_to_the_heart_car diac_electrophysiology Lu et al., PLoS One 2014; 9: e115648 Mitragynin Lee et al., Toxicol Appl Pharmacol 2016; 296: 42-53 Nefazodon • antidepresivum druhé generace • stoupá počet studií poukazujících na pochybnosti ohledně bezpečnosti použití (arytmie) • inhibice IKr pozorována v KM odvozených z hiPSC