1 Biochemie II Jarní semestr 2020 2 •Koolman J., Rohm K.H. Barevný atlas biochemie. Překlad 4.vydání, 2012 •R.K.Murray , D.A.Bender ad. Harperova ilustrovaná biochemie. Galén, 2013 •Semináře z biochemie II v IS MUNI včetně podkladů pro přípravu •Přednášky – podklady na IS MUNI Základní literatura 3 Literatura v angličtině • Murray R.K: Harpers Illustrated Biochemistry 27-30th ed. Doplňující literatura •Silbernagl S.,Despopoulis A. Atlas fyziologie. Překlad 8.vydání, 2016 •Vasudevan D. M. et al.: Úvod do všeobecnej a klinicky aplikovanej biochémie, 2015 (slovenský překlad). 4 Trávení a resorpce lipidů Přeměny lipoproteinů Transport cholesterolu Ó 2020 Biochemický ústav LF MU (E.T.) 5 http://s3-media1.ak.yelpcdn.com/bphoto/Z74i01uHCtLhRPQxIAIl0w/l.jpg 6 6 Triacylglyceroly (TG)-90% Fosfolipidy (PL) Cholesterolestery (CHE) Glykolipidy (GL) Lipofilní vitaminy (LV) Primární produkty: volné MK 2-monoacylglyceroly lysofosfolipidy cholesterol + lipofilní vitaminy Pankreatické lipasy + kolipasa Žlučové kyseliny Lingvální a žaludeční lipasa Resorpce do enterocytů ve formě směsných micel (částice < 20 nm) Trávení lipidů 7 7 Emulgace lipidů • je podmínkou účinného trávení hydrofobních lipidů • zvýšení účinného povrchu olej-voda, umožnění přístupu enzymů Emulgátory v tenkém střevě • soli žlučových kyselin (+ fosfolipidy, soli mastných kyselin) 8 8 Štěpení lipidů ve střevě pankreatickými enzymy • Pankreatická lipasa Triacylglycerol ® 2-monoacylglycerol + 2 MK < 1/4 TG triacylglycerol ® glycerol + MK Preparát Orlistat – antiobezitikum, inhibuje lipasy trávícího traktu, snižuje resorpci asi 30% tuku z potravy 9 9 Kolipasa • protein secernovaný z pankreatu • váže se s lipasou 1:1 • váže lipasu ke žlučovým kyselinám na povrchu emulgovaných kapének TG • umožňuje štěpení TG působením lipasy Triacylglyceroly Žlučové kyseliny Lipasa Kolipasa 10 10 • Cholesterolesterasa: Cholesterolestery ® cholesterol + MK • Fosfolipasa A2 Fosfolipid ® lysofosfolipid + MK Štěpení fosfolipidů Štěpení esterů cholesterolu 11 11 Resorpce lipidů buňkami střevní sliznice (hlavně v jejunu, žlučové kyseliny až v ileu) Směsné micely Kartáčový lem Epitelové buňky Průměr < 20 nm Pasivní difuze monoacylglycerolů a MK 12 12 • monoacylglyceroly a dlouhé mastné kyseliny přestupují difuzí ze směsných micel •krátké mastné kyseliny (do 10 C) nevstupují do micel, jsou absorbovány přímo • žlučové kyseliny postupují do ilea, zde je většina aktivním transportem zpětně resorbována • transport cholesterolu je zprostředkován NPC1L1 (Nieman-Pick C1 like 1) (viz přednáška 1.ročník) Resorpce lipidů buňkami střevní sliznice – pokr. 13 13 Hormonální kontrola trávení lipidů Sekretin •Je secernován do krve “S-buňkami“ duodena po stimulaci H+ v lumen • indukuje sekreci HCO3- z pankreatu Cholecystokinin • je secernován“I-buňkami“ duodena po stimulaci malými peptidy, AK, mastnými kyselinami v lumen • sekrece amylasy, lipasy a proteas z pankreatu • potencuje účinek sekretinu na vylučování HCO3- • sekrece žlučových kyselin ze žlučníku • 14 14 Steatorrhoea (lipidová malabsorpce) ztráta lipidů stolicí (normálně resorbováno ~ 98% lipidů z potravy) Nedostatečný přívod žluče (porucha jater, obstrukce žlučovodů) Možné příčiny Porucha ve funkci pankreatu Porucha ve funkci střevní sliznice (trávení probíhá, porušená resorpce) Nadbytek lipidů ve stolici Nedostatečný příjem lipofilních vitaminů lipidy Význam krátkých mastných kyselin ve výživě při malabsorpci Mohou být resorbovány do enterocytů bez účinku žlučových kyselin 15 15 Lipid Koncentrace v plazmě (mmol/l) Transport Triacylglycerol Celkový CH Neesterifikovaný CH Celkový fosfolipid Volné mastné kyseliny 0,9 - 2 3,0 - 5,0 ~1,3 - 1,9 1,8 - 5,8 0,4 - 0,8 CHM, VLDL LDL, HDL (CHM, VLDL) HDL (LDL) LDL, HDL, CHM, VLDL albumin Lipidy v krevní plazmě Transport převážně ve formě lipoproteinů 16 16 Hydrofobní jádro Obal Obecná struktura lipoproteinu 17 Apoproteiny • proteinová složka lipoproteinů • funkce AP: aktivátory a inhibitory enzymů interakce s receptory strukturní role (transportní) • některé jsou vestavěny do LP (apo B), jiné jsou periferní a mezi částicemi se vyměňují • syntéza v hrubém ER, připojení k lipidové micele 18 VLDL LDL Chylomikron CM HDL Typy lipoproteinů TG Prot CH PL 84% 54% 45% 50% 19 Charakteristika lipoproteinů Třída Průměr (nm) Poločas přeměny Hlavní lipid Hlavní apo CM 100-1000 ~5-15 min TG B48 VLDL 30-90 ~2h TG B100 IDL 25-35 ~2h TG/CHE B100 LDL 20-75 ~2-4 dny CHE B100 HDL 5-12 ~10 h PL/CHE AI Separace lipoproteinů • ultracentrifugace v roztoku soli • elektroforéza •(viz semináře a praktická cvičení) 20 20 image Velikost a hustota lipoproteinů 21 Potrava TG, CH, PL ŽK + CH chylomikrony d.thoracicus Tuková tkáň Svaly, myokard Lipoproteinová lipasa remnanty Játra VLDL Lipoproteinová lipasa IDL LDL Extrahepatální tkáně Tenké střevo enterocyt kapiláry Svaly, myokard Tuková tkáň Lipoproteinová lipasa HDL Metabolismus lipoproteinů - přehled Exogenní Endogenní lymfa 22 • vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice • nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou • obsahují apo-B 48, stopy apoA (jiné neumí střevní buňka syntetizovat), syntéza apoB-48 limituje tvorbu CM • jsou reverzní pinocytosou uvolněny do extracelulárního prostoru a pronikají do lymfy • prostřednictvím lymfatických cév jsou transportovány do krve (hrudní dučej) – plazma po jídle je zakalená Chylomikrony (CM) – vznik a metabolismus 23 Resyntéza lipidů v epiteliálních buňkách střevní sliznice 1. Aktivace MK MK + CoA + ATP ® Acyl-CoA + AMP + PPi 2. Resyntéza triacylglycerolů Acyl-CoA + Monoacylglycerol ® Diacylglycerol + CoA Acyl-CoA + Diacylglycerol ® Triacylglycerol + CoA 3. Resyntéza fosfolipidů z lysofosfolipidů 4. Resyntéza cholesterolesterů Syntézy probíhají v ER MK s krátkým řetězcem, volný glycerol ® přímý transport do portálního oběhu – nezapojují se do syntézy 24 ɞÀ TG chylomikron PL AK ® ® ® apoprotein B-48 (apoprotein A-I) Portální žíla Lymfatické cévy MK s krátkým řetězcem glycerol CHE Transport lipidů z buněk střevní sliznice Lipofilní vitaminy 25 25 Jaký je osud chylomikronů v krvi ? • do krve vstupují přes ductus thoracicus 1-2 hod po zahájení jídla (koncentrace vrcholí 3-6 h po jídle) • z HDL jsou na CM přenášeny apo E a apo C-II • • v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová lipasa (LPL) chylomikron HDL apo E a apo C-II 26 játra Mastné kyseliny LPL ApoCII ApoE ApoCII Glycerol chylomikronový zbytek apoE, apoB/E receptor apoE lymfa krev buňky střevní sliznice Ductus thoracicus Tuková, svalová tkáň Přeměny chylomikronů 27 Lipoproteinová lipasa (LPL) • negativně nabitý enzym na povrchu endotelových buněk kapilár tkání (vázán pomocí heparansulfátu) • přednostně na povrchu kapilár tukové tkáně, srdečního a kosterního svalu • je aktivován apo-CII • syntéza isoenzymu v tukové tkáni je stimulována insulinem, v srdečním a kosterním svalu ne • deficit LPL způsobuje triacylglycerolemii (1/1 000 000) • 28 Účinek LPL • lipoprotein se připojí na enzym vázaný na endotelu • LPL katalyzuje hydrolýzu TG obsažených v cirkulujících lipoproteinech: TG® glycerol + 3 MK 29 Účinek LPL na CM CM • lipoproteinová lipasa štěpí TG na mastné kyseliny a glycerol • částice se zmenšuje, přechází na chylomikronový zbytek (může přejímat CHE z HDL) CM-zbytek (remnant) vychytání játry (Apo-E) • volné mastné kyseliny putují přímo do tkání, část se vrací do plasmy LPL Apo CII LPL • LPL odbourá cca 80% TG v chylomikronech • chylomikrony v krvi vymizí účinkem LPL do cca 60 min 30 Osud MK uvolněných působením LPL • b - oxidace ve tkáních (svalová, myokard) - zisk energie • ukládání do TG v tukové tkáni - zásoba Další osud chylomikronového zbytku • vychytán játry (receptorově zprostředkovaná endocytóza) • dva typy receptorů v játrech: receptor apo B,E (LDL receptor) LRP (LDL receptor related protein –též apoE receptor) • tím se do jater dostává cholesterol přijatý potravou 31 VLDL – vznik a metabolismus • vznikají v hepatocytech • syntéza probíhá kontinuálně dle potřeby (nejen po jídle) • nesou CH převážně přijatý potravou • nesou TG syntetizované v játrech • obsahují apo-B 100, malá množství Apo-A a Apo-C • jaterním parenchymem vylučovány do Dissova prostoru, odtud do jaterních sinusoidů 32 Apo-B 100 • apoprotein v LDL a VLDL •Je integrálním proteinem • velmi dlouhý řetězec (4 536 AK) • stejný genetický základ apo-B 48 a apo-B 100 (stejná mRNA), apo-B 48 má jen 48% délky apo-B 100) 33 Z čeho pochází TG v játrech ? POSTRESORPČNÍ FÁZE, HLADOVĚNÍ volné MK jsou uvolňovány tukovou tkání, částečně jsou vychytány játry pokud MK nejsou rozloženy β-oxidací, jsou z nich resyntetizovány TG PO JÍDLE v játrech probíhá syntéza MK z acetyl-CoA acetyl-CoA pochází převážně z metabolismu sacharidů 34 IDL LDL HDL Apo-C,E Apo C MK Přeměny VLDL-přehled játra LPL HDL CHE apoB/E 2/3 LDL Glycerol Tuková, svalová tkáň z HDL jsou na VLDL přenášeny apo E a apo CII v krevních kapilárách působí na VLDL lipoproteinová lipasa IDL i LDL mohou být obohacovány CHE z HDL (role cholesterolester transfer proteinu CETP) CETP 35 Účinek LPL na VLDL Apo CII volné mastné kyseliny putují do tkání vychytávání játry pomocí apo-E IDL LDL částice se zmenšuje, přechází na IDL LPL VLDL se mění na IDL IDL jsou buď vychytány játry (apo B/E) nebo přeměněny na LDL 36 Jaterní lipasa • enzym na luminální stěně jaterních sinusoidů • obdobný účinek jako LPL • působí na remnanty, IDL, VLDL a HDL při průtoku krve játry a odbourává v nich TG 37 Srdeční a adipocytární LPL Srdeční LPL má KM cca 10x menší než adipocytární. Syntéza adipocytární LPL je aktivována insulinem Co to znamená ? j0078711[1] 38 • IDL i LDL mohou být obohacovány CHE z HDL (role cholesterolester transfer proteinu CETP) • IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-B/E receptoru • LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi (1/3) a játry (2/3) receptorově zprostředkovanou endocytozou (Apo-B/E) • za fyziologických podmínek je během 24 hodin katabolizováno 30-40% vzniklých LDL Další osudy IDL a LDL 39 LDL receptor (apo B/E receptor) je regulován intracelulárním obsahem cholesterolu Nespecifické (scavengerové) receptory (SRA, SRB) membránové receptory se širokou specifitou přítomny na povrchu fagocytujících buněk, cévního endotelu a Kupferových b. v játrech nemají zpětnou regulaci vychytávají poškozené a nadbytečné LDL Receptory LDL 40 40 Vychytávání LDL pomocí specifických receptorů LDL receptor je negativně nabitý membránový glykoprotein lokalizovaný na povrchu klatrinem povlečených jamek, váže apo E a apo B po navázání LDL na receptor je komplex internacionalizován endocytózou Vezikly obsahující LDL fůzují s lysosomy za tvorby endolysosomů recyklace receptoru AK CHOL MK Nově syntetiz. receptor. Regulace syntézy receptoru SREBP a CHOL Hladina cholesterolu v buňce je striktně regulována • down- regulace příjmu ve formě LDL (zvýšená hladina cholesterolu v buňce reguluje počet LDL receptorů) ®na základě regulace transkripce prostřednictvím SREBP ® na základě regulace recyklace LDL receptoru proteinem PCSK9 • regulace syntézy cholesterolu ® regulace transkripce genu pro HMG-CoA synthasu prostřednictvím SREBP ® inhibice HMG-CoA – reduktasy cholesterolem 42 Endolyzosom – degradace LDL částice i receptoru Role proteinu PCSK9 v regulaci počtu LDL receptorů •PCSK9* je protein syntetizovaný v hepatocytech v závislosti na množství cholesterolu v buňce •je z nich uvolněn a váže se na povrchu hepatocytu k LDL receptoru. •Po endocytóze LDL-receptoru s navázanou částicí LDL protein PCSK9 zabraňuje recyklaci receptoru a aktivuje jeho odbourání v lyzozomech. Buňka se brání dalšímu přijmu cholesterolu *proprotein konvertáza subtilisin/kexin typ 9 43 Inhibitory PCSK9 snižují hladinu cholesterolu Inhibitory PCSK9 na bázi monoklonálních protilátek byly nedávno schváleny pro použití v klinické praxi Inhibice PCSK9 zabraňuje degradaci receptorů, zvyšuje tedy jejich počet na membráně jaterní buňky zvyšuje vychytávání LDL v jaterní buňce Léky alirocumab a evolocumab – nová třída hypolipidemik Hladinu LDL-CH. snižují v průměru o 50–60 % Food and Drug Administration (FDA) a EMA (European Medicines Agency – Evropská léková agentura) schválily indikace k léčbě alirocumabem (Praluent, Sanofi/Regeneron) a evolocumabem (Repatha, Amgen) na konci roku 2015. V ČR k dispozici ke klinickému použití od 2016. Léčba je indikována u dospělých pacientů s primární hypercholesterolémií (heterozygotní familiární a nefamiliární) nebo smíšenou dyslipidémií Snížení koncentrace LDL cholesterolu o 60% Léčiva se aplikují v podkožní injekci do oblasti břicha, stehen nebo paží, 1krát za dva týdny nebo 1krát měsíčně Alirocumab a evolocumab – nová třída hypolipidemik 45 Vychytávání lipoproteinů scavengerovými receptory SRA a SRB • receptory jsou přítomny na povrchu fagocytujících buněk (makrofágy v cévní stěně, v plicních alveolech a peritoneu, Kupferovy buňky, cevní endotel) • receptor nemá zpětnou regulaci • přednostně vychytává chemicky modifikované LDL (oxidované, glykované) • vychytává též nepoškozené LDL, pokud kapacita jejich přirozeného vychytání je překročena (při hypercholesterolemii) 46 ɜÀ Tvorba pěnových buněk a vznik plaku •makrofágy naplněné lipidy se stávají pěnovými buňkami •mohou se akumulovat v subendotelové oblasti cév • růstové faktory a cytokiny stimulují migraci buněk hladkého svalu a jejich proliferaci Místo pro adhezi a agregaci destiček Tvorba plaku 47 Fáze vývoje aterosklerotické léze Izolované pěnové buňky Tukové proužky (hromadění pěnových buněk) Intermediární léze (akumulace extracelulárně uložených lipidů z odumřelých tukových buněk Tvorba ateromu (vznik lipidového jádra) Tvorba fibroateromu) proliferace buněk hl.svalstva a zvýšená syntéza extracelulární matrix Komplikovaná léze (kalcifikace, ruptura, vznik trombu…. (dále patofyziologie) 48 Vliv hormonů na vychytávání LDL v játrech Insulin a trijodthyronin zvyšují vychytávání LDL játry, Glukokortikoidy mají opačný efekt. (mechanismus není znám) j0078711[1] Proč nekontrolovaný diabetes a hypothyroidismus jsou rizikovým faktorem atherosklerosy a jsou často spojeny s hypercholesterolemií? 49 Familiární hypercholesterolemie Příčiny: •Defekt tvorby LDL-receptorů v důsledku mutace genu pro LDL-receptor • Defekt apolipoproteinu B-100 (familiárně defektní apoB - FDB) •Mutace genu PCSK9 V krvi koluje velké množství LDL (ateroskleróza s rychlou progresí) Buňka produkuje nadměrné množství cholesterolu Zvýšené riziko srdečního infarktu Charakteristické xantomy na šlachách autosomálně dominantně přenášené monogenní onemocnění 50 Role HDL v metabolismu reverzní transport cholesterolu (RTC) - HDL přejímají cholesterol z periferních tkání a zprostředkují jeho transport do jater Existuje několik typů HDL • liší se velikostí, tvarem, obsahem lipidů a apoproteinů • mají i různé funkce • hlavní subfrakce dle denzity: HDL2, HDL3 • HDL podléhají v cirkulaci přeměnám (remodelace HDL) 51 Jak je cholesterol skladován v buňce? •Estery cholesterolu jsou uchovány ve formě kapének cytoplazmě •Reverzní transport cholesterolu je zahájen hydrolýzou pomocí cholesterylesterhydrolázy •Volný cholesterol je transportován k buněčné membráně Jak HDL přejímá cholesterol ze tkání ? dva předpokládané mechanismy difuzní tvorba nových HDL 52 HDL – vznik a metabolismus • základem HDL je apo AI a apo AII ( z jater, apo AI též ve střevě), obsahují též apoC a apo E • pro transport cholesterolu ze tkání mají význam malé částice tzv. „lipid free“ a „lipid poor“ apo A • jsou secernovány játry a enterocyty a rovněž vznikají v cirkulaci z velkých HDL částic, povrchových vrstev VLDL a chylomikronů 53 53 Lipid poor částice Přeměny HDL LCAT SR-B1 játra diskoidní HDL sferické HDL (HDL2 a HDL3) CETP LDL/VLDL remodelace interakcí s dalšími lipoproteiny steroidogenní tkáně lipid poor částice SR-B1 ABCA1 SRB-I Periferní tkáň ABCG4 CETP játra 54 • plasmatický enzym, působí na povrchu HDL, je aktivován apo A-I • přenáší acyl MK na OH skupinu cholesterolu • neesterifikovaný cholesterol se přeměňuje na esterifikovaný – ten je méně polární a objemnější, zanořuje se do nitra HDL • deficit LCAT vede k zastavení zpětného transportu cholesterolu, HDL zůstává v diskoidní formě Funkce LCAT - 55 • esterifikovaný cholesterol vznikající účinkem LCAT je nepolární a zanořuje se do nitra částice • tak vznikají sferické HDL částice • sferické HDL interagují s ostatními lipoproteiny • rychlá esterifikace cholesterolu účinkem LCAT způsobuje, že většina HDL v plazmě má sférický tvar •Postupným přibíráním CH a též přenosem TG a fosfolipidů do HDL3 se částice mění na větší a méně denzní HDL2 • v játrech ( a steroidogenních tkáních) jsou HDL vychytány pomocí SR-B I receptoru a pravděpodobně i dalšími mechanismy Další osudy HDL 56 SR-B1 receptor HDL-receptor s dvojakou rolí při metabolismu HDL • V játrech a steroidogenních tkáních váže HDL pomocí apo A-I a zajišťuje transport cholesterolu z HDL do buňky, nedochází k endocytóze • Ve tkáních zajišťuje transport cholesterolu z buňky do HDL. Reaguje i s makrofágy. 57 Výměna látek mezi lipoproteiny mezi lipoproteiny probíhá výměna lipidů i proteinů: • výměna periferních apoproteinů • výměna fosfolipidů • výměna cholesterolesterů ( cholesterolester transfer protein CETP)- z HDL do VLDL, IDL, CM – část cholesterolu ze tkání je transportována do jater formou LDL a IDL • výměna TG mezi VLDL, CM a HDL 58 Bilance cholesterolu za 24 h POTRAVA BIOSYNTÉZA 80-500 mg 800 – 1000 mg Steroidní hormony, maz, střevní epitel 200 mg Žlučové kyseliny (primární) 500 mg Cholesterol (žluč) 800 mg Pool cholesterolu 1000-1500 mg/den je vylučováno 59 “Hodný” a “zlý” cholesterol Cholesterol přítomný v HDL Cholesterol přítomný v LDL Celkový cholesterol v krvi má být < 5 mmol/l Má být >1 mmol/l Má být <3 mmol/l Viz praktická cvičení Vysoká hladina cholesterolu je jeden z rizikových faktorů srdečně cévních onemocnění 60 Vysoké hladiny HDL-cholesterolu • prognosticky příznivý faktor pro riziko koronárních onemocnění HDL-cholesterol = Hodný cholesterol Při zjištění vyšší hladiny cholesterolu v krvi je sledováno jeho zastoupení v LDL a HDL frakci – stanovení HDL- a LDL-cholesterolu – viz praktické cvičení 61 Zvýšený příjem cholesterolu nebo poruchy LDL receptorů zvýšená hladina LDL v plasmě, dlouhý poločas LDL, možnost oxidace MK • Poškozené a nadbytečné LDL jsou vychytávány SRA receptory makrofágů, tvorba pěnových buněk oxidované LDL jsou silně aterogenní LDL cholesterol – zlý cholesterol 62 Snižování hladiny cholesterolu Farmakologická léčba Typ léčiva Mechanismus účinku statiny inhibice HMG-CoA reduktasy Ezetimib snížení intestinální resorpce CH alirocumab evolocumab inhibice PCSK9 pryskyřice zvýšení exkrece žlučových kyselin Nefarmakologická léčba Dieta, pohybová aktivita 63 Lipoprotein (a) – nezávislý rizikový faktor aterosklerozy a trombozy •Lp(a) má obdobné složení jako LDL • koncentrace >300 mg/l jsou vysoce rizikové •obsahuje apo B 100 •navíc obsahuje glykoprotein nazývaný apolipoprotein (a) [apo(a)], který je kovalentně vázán k apo B-100 • apo(a) má strukturu homologní s plazminogenem Teorie: Lp(a) zpomaluje odbourání krevní sraženiny v důsledku kompetice s plazminogenem ve vazbě na fibrin a může usnadňovat vazbu molekul LDL na stěny arterií . 64