HUNI MED Genetika v zubním lékařství - cvičení Mgr. Lucie Válková Johann Gregor Mendel • 20. 7. 1822, Hynčice t 6. 1. 1884, Brno • zakladatel genetiky • objevitel základních zákonů dědičnosti • zákon o uniformitě Fl generace • zákon o náhodné segregaci genů do gamet • zákon o nezávislé kombinovatelnosti alel semeno květ lusk stonek tvar dělohy barva tvar barva umístění velikost • CO Q ■ta? šedý S kulatý žluté bílá plný žlutý lusky a květy podél stonku dlouhý ffl £? m bílý a svrasklý zelené fialová přiškrcený zelený koncové lusky, vrcholový květ krátký 3 5 6 7 Pokusy s rostlinnými hybridy (1866) Základní pojmy * Genetika • obor zabývající dědičností a variabilitou kvantitativních a kvalitativních znaků všech živých organismů • Gen • základní jednotka dědičnosti (genetické informace) • konkrétní úsek molekuly DNA, který nese informaci pro tvorbu bílkoviny nebo nukleové kyseliny • skládá se z exonů a intronů strukturní funkční | ^ Exon DNA ]Ni^gMíí6^^T^>íiíÄÍL^ Intron Exon Intron Intron Exon Intron Exon Exon RNA Intron ÉMn Intron EKOn Intron Exon Intron E*on Základní pojmy • Chromozom • funkční celek dědičného záznamu genetické informace v buňce • jádro buňky—► 22 párů autozomů + 1 pár gonozomů * Lokus • umístění genu na určitém místě na konkrétním chromozomu • Alela • konkrétní forma genu Chromosome Nucleus Chromatid Chromatid Image adapted from: National Human Genome Research Institute. Základní pojmy • Genomika • obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních pochodů Heterozygot • dvě různé varianty (alely) daného genu nebo jeho části Homozygot • dvě stejné varianty (alely) daného genu nebo jeho části Dominant Recessiv Dominant homozygot homozygot heterozygot B B b b B Základní pojmy Polymorfismus • existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň > 1% Mutace • procesy, při kterých dochází ke změnám v genotypu v důsledku působení různých faktorů prostředí • méně častá alela má populační frekvencí < 1% DNA vs. RNA molekula DNA = kyselina deoxyribonukleová - dvoušroubovice - 2 řetězce v opačném směru - polynukleotidový řetězec • dusíkatá báze ( X A, C, G) spojená vodíkovými můstky • zbytek kyseliny fosforečné • cukerná složka - deoxyribóza molekula RNA = kyselina ribonukleová - jednovláknová - polynukleotidový řetězec • dusíkatá báze ( U, A, C, G) spojená vodíkovými můstky • zbytek kyseliny fosforečné • cukerná složka -ribóza - typy-mRNA, tRNA, rRNA e, o o .O 0' Om^P o ■ Tfrymtn* 1 Cytosine H ľ H^^i, Adenine w « >^rf^*-rn Guanine O pentose Base glycosidic bond OH = ribose H = deoxyribose nucleoside------ä nucleotide-— ■■nucleoside diphosphate-nucleoside triphosphate- H Adenine CO H N-_^*A^NH Guanine hutelotuses ŮÍDNA DNA :-!M■,: bn ■..;i ■ : Acid RNA RibonMdfk Arid of RNA Ústřední dogma molekulární biologie Jádro Cytoplazma - ribozomy / (syntc SSiíSíSS ílikace \ 'za DNA) ) / DNA SSÜÜiSÜSiB Transkripce (syntéza RNA) RNA ■■■■■-■■■■■■■■■■■■--i' aminokys« Translace (syntéza proteinu) PROTEIN K> sliny Replikace DNA • = tvorba kopií molekul DNA zajišťující přenos genetické informace z mateřské do dceřiné buňky • S-fáze buněčného cyklu • semikonzervativní proces - 1 nové + 1 staré vlákno • složky potřebné pro replikaci • templát - mateřské vlákno • primer - krátký oligonukleotid s volným 3'OH koncem • enzymy • nukleotidy Replikace DNA vznik replikační vidlice • helikáza - umožňuje oddálit obě molekuly dvoušroubovice • SSB proteiny - napomáhají udržet vlákna rozdělená DNA primáza - tvorba RNA primerů Replikace je zahájena ve specifických místech -počátcích replikace („origins") DNA polymeráza - katalyzuje prodlužování řetězce • sekvence nového vlákna dle principu komplemetarity bází - adenin + thymin (2 vodíkové můstky) a cytosin + guanin (3 vodíkové můstky) • syntéza od 5'konce ke 3'konci 5' 3' Vedoucí řetězec Svírací protein Nově syntetizovaný řetězec 5' 3* DNA-polymerasa Rodičovská DNA 3' Primasa^ Nový Okazakiho RNA-primer fragment . / \ • . 5' DNA-helikasa y Vazebný protein pro udržení jednořetězcové struktury DNA Okazakiho fragment Váznoucí řetězec Replikace DNA • templátová vlákna antiparalelní-jeden řetězec opožděn • vedoucí řetězec - jeden RNA primer na začátku, replikace probíhá bez přerušení • opožďující se řetězec - ve směru 5'-3' se diskontinuitné tvoří krátké Okazakiho fragmenty (každý z nového RNA primem), které se následně spojí DNA ligáza • RNA primery jsou odstraněny 5'-3'exonukleázovou a nahrazeny 3'-5'polymerázovou aktivitou leading strand most recently 5 3' 5 Okazaki fragments Transkripce • přepis informace v podobě sekvence DNA do sekvence RNA • jádro buňky • templát - vlákno DNA • transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce • DNA-dependentní RNA polymeráza • 3 typy (strukturně podobné, přepisují různé typy genů) • RNA pol. I (geny kódující rRNA) • RNA pol. II (geny kódující hnRNA) • RNA pol. III (geny kódující tRNA) • vyžaduje přítomnost transkripčních faktorů (rozvolnění řetězců DNA, umístění RNA polymerázy. na promotor a uvolnění z promotoru) • promotor = startovací místo na DNA - TATA box, CAT box • terminátor = koncové místo - AAAA Posttranskripční modifikace modifikace primárních transkriptů: • připojení čepičky na 5'konec (podílí se na řízení translace mRNA) Obrázek 3 - Struktura tzv. RNA čepičky li.' h2u n 0 0 0 11 11 11 „ i—o-P-O-P-O-P-0—i „ Basel o- o- i- \°y 0 ov 1 CH, 0=P-0" w OH OH 7-methylguanosine • připojení polyadenylačního řetězce na 3'konec • sestřih (splicing) RNA - vystřižení intronů za vzniku zralé mRNA Start of transcription Gene: Intron 1 Intron 2 Exonl Exon2 Exon3 Transcription Primary transcript: | Intron 1 Intron 2 _ Exonl \y Exon2 \/Exon 3 Splicing Mature transcnpt: Exon 1 Exon 2 Exon 3 překlad genetické informace z mRNA do sekvence AMK v polypeptidu (pomocí genetického kódu) probíhá na ribozomy v cytoplazmě buňky fáze - iniciace, elongace, terminace enzym - aminoacyl-tRNA syntetáza iniciační komplex se tvoří na 5'konci mRNA (čepička), zkoumá mRNA od 5'konce a hledá iniciační kodon AUG terminace translace: UAA, UAG, UGA postranslační úpravy - fosforylace, glykosylace, metylace,.... řetězením aminokyselin vo[n^ směr posunu nbozom kodóny nhoz6mii Genetický kód • systém, podle kterého se přiřazují specifické AM K do polypeptidového řetězce podle sekvence mRNA • triplet = kodon - definuje AMK nebo terminaci translace • každá AMK určena jedním nebo několika kodony v mRNA • 64 možných tripletů: 61 určuje AMK, 3 určují terminaci translace • kodony jsou rozeznávány komplementárními sekvencemi v tRNA (antikodony), které nesou na 3'konci specifické AMK inzerce/delece jednoho/dvou párů bází mění čtecí rámec (téměř) univerzální, degenerovaný druhý nukleotid | prvý nukleotid C A -f ä 3 C 7T ra o -* a £ fenylalanín A ^ leucín c CC senn CA CC A ^ A C tyrozm A A koniec A ' koniec - ^ cystein A koniec Gu tiyploffán C c C C leucín C A C CC C C C pr0|ln CCA CC CA .. .... CAC tusbdm CAA . T, . gl u ta min CA c c c arain(n ^ arginin c C A A A C isoleucín A A A j začiatok AC A C C t,.,,,,,,,-,, ACA AC AAC35""3'" AA A AA A . — serín A C * arginín A A j> vahn A C t alanín CA C C- A kys. A Akys Q A G 9'utamová r; n C ^ glycín •CGA Genetický kód - změna čtecího rámce A single base-pair delation rastoras the reading frame changed by a single base-pair addition. DNA ATG TTT CCC AAA GGG TTT.....CCC TAG (Wild-typeallele) yAC £_Aj^ GGG T_T_T £C£ £Aj^ rychlost opravy PmmmMmhí 2004 stárnutí apoptóza Systém oprav chybného párování bazí u savců • Poškozený řetězec DNA obsahuje nesprávně párovanou bázi (T). • Rozpoznáno proteinovým heterodimerem MSH6-MSH2. • Proteiny MLH1/PMS2 a PCNA (proliferační jaderný antigen) utváří na DNA strukturu smyčky (angl. loop structure). • Enzymy • DNA exonukleáza a DNA helikáza degradují chybně párovanou část řetězce • DNA ligáza - spojení řetězců • Mezera doplněna/opravena replikačním aparátem. -G- MSH6/MSH2 i MSH2 MSHS C MLH1/PMS2 f KTt PCNA r^ADP MLH1 PMS2 5'-3' exonuclase DNA hclicasc se G- DNA PoO RFC. PCNA. RPA I DNA ngase G- Buněčný cyklus M0NTA2 MITOTICKÉHO VŘETÉNKA spuštění mechanismu mitozy I VSTUP DO M uplne buněčné děleni spuštěni anaféze a postup k cytokinózi I_ VYSTUP Z M 7 VSTUP DO S -1- spuštění mecharismu replikace DNA REPLIKACE DNA = uspořádaný sled procesů, při kterých buňka zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí na dvě buňky dceřiné (každá z nich ponese stejné chromozomy) Cíl: reprodukce genetického materiálu pro příští generaci buněk Buněčný cyklus * Jednobuněčné organismy • sladěno s růstem - mateřská b. musí dorůst do určité velikosti, aby se rozdělila • Mnohobuněčné organismy • sladění replikace DNA s vývojovým programem buňky • sladění replikace a dělení každé buňky s vývojem příslušné tkáně nebo orgánu • dospělost - buňky se dělí, když je potřeba (nahrazení odumírajících buněk, obnova poraněné tkáně) • ztráta kontroly nad buněčným cyklem -> rakovina Buněčný cyklus • kladeny vysoké nároky na přesnost • bezchybná replikace • správné řazení fází • mitóza před dokončením replikace -> ztráta genetické informace min. u jedné buňky • dvojnásobná replikace před mitózou -> zvýšený počet kopií genů na příslušné části chromozomu -> nerovnováha v genové expresi, nízká viabilita Buněčný cyklus • řídící elementy - cyklin-dependentní kinázy (CDK) • řídí aktivitu mnoha proteinů zapojených do replikace DNA a mitózy tím, že je ve specifických místech fosforylují (aktivace/inaktivace) • Cyklin + CDK -> komplex se připojí na protein -> fosforylace proteinu -> po fosforylaci se komplex rozpadne a dojde ke změně aktivity proteinu cyclin Cdk-activating kinase (CAK) Cdk active site activating phosphate (C) FULLY ACTIVE (A) INACTIVE (B) PARTLY ACTIVE Buněčný cyklus - Interfáze Interfáze-G1,G2, S • příprava na buněčné dělení, vnější jaderná membrána je spojená s ER * nepříznivé podmínky • setrvání v Gl/vstup do GO; buňky nerostou, mohou tak setrvat i několik měsíců/let G2-fáze • dvojnásobné množství DNA (než v Gl) • syntéza proteinů potřebných na vstup do mitózy Gap 2 S-fáze replikace DNA syntéza proteinů asociovaných s DNA Gapl DNA synthesis GO-fáze • většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se) • po přijetí prorůstového faktoru mohou vstoupit zpět do buněčného cyklu Gl-fáze • nejdelší a nejvariabilnější • buňka se zvětšuje a zdvojuje organely • na konci této fáze se nachází kontrolní bod: bod restrikce • buňka má dostatek živin a růstových faktorů, vykazuje vysokou metabolickou aktivitu -> přejde bod restrikce a pokračuje do další fáze • nedostatek živin, obdržení antiproliferačního signálu -> zpomalení postupu fází/opuštění cyklu (přechod do GO) Buněčný cyklus - Mitóza • jaderné dělení (mitóza) + následné dělení cytoplazmy = cytokineze Mitóza • dělení somatických buněk • vznik - dvě diploidní buňky s identickou genetickou výbavou • profáze - spiralizace vláken DNA, tvorba mitotického vřeténka • prometafáze - rozpad jaderné membrány • metafáze - sestavení kinetochoru na každé centromere, připojení chromatid k vřeténku ( ekvatoriální rovině) • anafáze - separace chromatid k opačným pólům • telofáze - dokončení separace chromatid, rozložení vřeténka, obnovení jaderné membrány Prophase Metaphase Anaphase Cytokinesis Mitóza vs. meióza paternal homolog maternal homolog j DNA REPLICATION PAIRING OF DUPLICATED HOMOLOGOUS CHROMOSOMES DNA REPLICATION ( DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP INDIVIDUALLY ON THE SPINDLE CELL DIVISION Mitóza = 2 dceřiné buňky s diploidním počtem chromozomů; 1 cyklus DNA replikace, následuje rozdělení chromozomů a jádra (profáze —» prometafáze —» metafáze —» anafáze —» telofáze) a násl. celé buňky (cytokineze) Meióza = 1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace chromozomů a buněčného dělení, vznik haploidních gamet 1. meiotické (redukční) dělení - rozdělení homologních chromozomů; odehrává se zde meiotický crossing-over (rekombinace genů) - žádná z gamet není identická! Poruchy rozestupu - např. trisomie. 2. meiotické dělení - rozestup sesterských chromatid -> 2 dceřiné buňky s haploidním počtem chromozomů, vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko), dodatečné promíchání genetického materiálu crossing-overem gametes Meióza • vznik 4 haploidních gamet (pohlavní buňky) • genetická variabilita Heterotypické dělení • Profáze - 5 částí • Leptotene - spiralizace chromozomů • Zygotene - vznik bivalentů • Pachytene - crossing over = křížení nesesterských chromatid • Diplotene - postupné rozestoupení homologních chromozomů • Diakineze - rozpuštění jaderného obalu, vznik dělícího vřeténka • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina • Anafáze - rozdělení 2n chromozomů, oddálení vřeténka • Telofáze-vytvoření jaderného obalu, zánik vřeténka MEIOZA - heterotypické dělení PROFÁZE P^ry Pomologických _ chromozomu - vznik bivalentu ^ crossing over rozpustení jaderné membrány vznik dělicího aparátu rozestoupeni chromozomu a jejich redukce z 2n na 1 n vznik jaderných membrán dcefinných buněk http://www.szes-la.cz/ Meióza Homeotypické dělení • Profáze - spiralizace chromozomů, vznik dělícího vřeténka, rozpuštění jaderné membrány • Metafáze - vzniká ekvatoriální rovina, připojení na dělící vřeténko • Anafáze - oddalování chromatid rozdělených chromozomů • Telofáze - vytvoření jaderné membrány, zánik dělícího vřeténka, despirilizace chromozomů MEIOZA - homeotypické dělení PROfAZE METAFÁZE ANAFÁZE TELOFAZE nastydnou diferenciaci vznikají specializované pohlavní bunky • vajíčka Mbo «p»rmie pomavni ounny ■ vajicna neoo spermie OO0© j£ ČTVEŘICE MAPLOlDNICM IN BUNĚK ^ http://www.szes-la.cz/ Buněčná smrt Enzymatic digestion and leakage of cellular contents Programovaná (signální systém) x neprogramovaná (neregulovaná) Apoptóza • Kontrola nadměrné proliferace buněk, eliminace přestárlých/poškozených buněk • Zmenšení b., kondenzace jádra, fragmentace DNA a následně celé b. (apoptická tělíska) • Umírající buňka je fagocytována okolními buňkami • Klíčové složky: kaspázy • Vnitřní (mitochondriální) dráha - pomocí proteinů Bcl-2 rodiny • Vnější (receptorová) dráha - povrchové receptory smrti - Fas a TRAIL Nekróza • vlivy - mechanické, chemické, tepelné, virová infekce buňky, bakteriální toxiny, vyčerpání energetických zásob • narušení integrity cytoplazmatické membrány - změna vnitřního prostředí • rozpad buňky - vylití obsahu do okolí • řetězová reakce - poškození okolních tkání, zánět Autofagie • rozklad buněčných složek v lysozomech NECROSIS APOPTOSIS DNA diagnostika Detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence • Identifikace živočišného druhu • Paternita • Identifikace jedince - forenzní účely • Profil DNA-SNPs Analýza struktury (sekvence) nukleové kyseliny Stanovení genotypu • Detekce klinicky významných mutací a polymorfismů • Dědičné choroby • Detekce v onkogenech a supresorových genech v nádorech Prenatální, preimplantační diagnostika Kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí • Hodnocení intenzity a změny exprese genů - tumory Kvantifikace proteinů a typů jejich posttranslační modifikace Autosomal recessive 3 3 é i l OH fill íí\\l I Unaffected son Daughter Son >wy 1:4 2:4 2;4 1:4 r a a ľ f_ 0 alamy stock photo Metody molekulární biologie Vstupní biologický materiál - Plná krev - sérum nebo plazma - Sliny - Buňky - Tkáně - Tělní tekutiny Izolace DNA, RNA, proteinů ze vstupního materiálu Molekulární a biochemické metodiky pro stanovení dané problematiky - Detekce polymorfismu • PCR —► RFLP —► detekce na ELFO • Real-time PCR • Sekvenace PCR - Polymerase Chain Reaction cíl - získání požadované a specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování princip - mnohonásobná replikace • cca 30 cyklů • závislost na teplotě reakční směsi • množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) termocycler ► 30th cycle 231 = 2 billion copies Exponential Amplification Process is repeated, and the region of interest is amplified exponentially PCR mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce řetězová reakce vychází z DNA replikace opakování cyklů: - denaturace (separace dsDNA) - 96 °C ■ annealing - navázání primerů - 50 - 65 °C ■ elongace - syntéza nového vlákna DNA - 72 °C Region of 5' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I y interest ^ y I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I 5' :V I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ' V I ' I I I I I I I I..... I I I I .. I 48 to 72°C Template < DNA strands I I I ! I lil I I I II II I I I I Primer ,. " Primer 5' 5' """" 3' .,■111111111.....I I 1 I I :. 68 to 72°C Nascent DNA strands < 5 11111111 ť 1111111 I I I I I I M I H I I I I I I y 1st cycle —► 2nd cycle —► 3rd cycle 4th cycle rrrmnrrn tt-tttttttt-ttttttt, iü'm?■ í■ i üh ü Dcnaturation Temperature is increased to separate DNA strands Annealing Temperature is decreased to allow primers to base pair to complementary DNA template Extension Polymerase extends primer to form nascent DNA strand -> 30th cycle 231 = 2 billion copies — 7 * . i.-.±iiĽxil - i j i;—LLÍ. 22 = 4 copies ................... 23 = 8 copies ,tli .sfl.Tlü.fl -rrr'rrr-rr II Ii Ii in li rij jm it :111i ■.lU.'.t'Jj-Ji ■■■■ ii; iílT'.YlY'ii ■i II! Mil IM! li :iii >LÍi fř/l It ■ 1 ľ:*iT*ÍT 25 = 32 copies Exponential Amplification Process is repeated, and the region of interest is amplified exponentially PCR DNA replikace - in vitro (PCR) • templátová DNA • dNTP • pufr(pH=8) • Mg2+soli • aktivace polymerázy • primer • krátké specifické úseky DNA • ohraničení oblasti amplifikace DNA • oligonukleotid 20 - 25 pb • Taq polymeráza • bakterie Thermus aquaticus • Termostabilní Teplota * DNA replikace - in vivo • Enzymy - helikáza, primáza, DNA-polymeráza, ligáza ... DNA replication DNA polymerase CTX1IĽ11Í Original DNA ~TTT Lagging stand Okazaki fragment RNA Primase primer Leading stand Download from Dreamstime.com Q i 166 «59 Q Desila IDreamstimei qPCR - Kvantitativní Real-time PCR kvantifikace DNA založeno na klasické PCR využívá se speciální cycler, který v průběhu PCR kontinuálně zaznamenává množství DNA, a to v průběhu každého cyklu detekce množství DNA je umožněna přítomností fluorescenčního substrátu Real-time PCR se obvykle provádí v 96 jamkových destičkách, úroveň fluorescence je zaznamenávaná v jednotlivých jamkách vysoce citlivá a vysoce specifická metoda 0. 15-t qPCR • intenzita fluorescence je přímo úměrná množství produktu, který v reakci vzniká • Detekce produktu: • nespecifické sondy - Sybr GREEN • sekvenčně specifická DNA proba - oligonuklotid značený fluorescenčně (Taq man) DENATURACE DNA o o Pokud jsou molekuly SYBR Greenu navázány na dvouřetězcovou DNA, tak vydávají fluorescenci Uvolňování molekúl SYBR Greenu z denaturovaných molekúl DNA: fluorescence klesá NASEDANÍ PRIMERU O o o o <«- rev pni O reverse primer Nasedání molekul SYBR Greenu na vznikající dvouřetězcové molekuly DNA: fluorescence se zvyšuje forward ^} primer SYNTÉZA DNA Míra fluorescence je dvounásobná oproti původnímu templátu NASEDNUTI SONDY A PRIMERU K DENATUROVANÉ DNA SYNTÉZA DNA Fluorochom Forward primer ^ sonda \_) ' 1 1 1 r Zhášeč Emise fluorescence fluorochromu je blokovaná zhášečem i Reverse primer Emise fluorescence Taq polymeráza při syntéze DNA svou exonukleázovou aktivitou odštěpí fluorochrom RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism enzymatické štěpení DNA ve specifickém restrikčním místě reštrikční endonukleáza produktem jsou fragmenty o různé délce vzniklé fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy Využití: na základě velikosti a počtu fragmentů lze sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy (polymorfizmy vznikají přestavbou v řetězci, např. inzercí, delecí, substitucí bází) Línia po kadzieli babcia dziadek t ň ---J dzieci Linia po mícczu babcia dziadek t V „ / 8QÍ m i i i o j oo ooóó JJ1 I I I I I I I : o : i i o o Č>0 RFLP reštrikční endonukleáza • sekvenčně specifické (původ z bakterií) • EcoRI (Escherichia coli), Hindill (Haemophilus influenzae) • tupé/lepivé konce • funkce • rozpoznání specifické sekvence dsDNA a následná restrikce (hydrolýza fosfodiesterových vazeb) • ochrana před cizorodou DNA • rozpoznávací místo • 4-8 bp dlouhé • charakter palindromu = stejné pořadí bází v obou směrech g g § S Haelll místo štěpení EcoRi^i Slicfcyend ,om al sticky ends S heky end Recombinant DNA Gelová elektroforéza separační metoda princip - pohyb nabitých molekul ve stejnosměrném elektrickém poli (separace molekul o rozdílné molekulové hmotnosti) rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku DNA má uniformní negativní náboj —► v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě části aparatury • elektroforetická vana • separační gel • pufr • zdroj stejnosměrného elektrického proudu agarózová (produkt mořských řas - agar)/polyakrylamidová POWER SUPPLY ELECTROPHORETIC BUFFER CATHODE \ SAMPLE HIGH MOLECULAR WEIGHT SPECIES ANODE ANODE LOW MOLECULAR WEIGHT ANALYTES https://www.sciencedirectxom/topics/chemistrv/agarose-gel-electrophoresis • EtBr - vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV Sekvenace DNA stanovení primární struktury DNA (pořadí nt) 10 70 30 40 SO 60 70 00 90 cok oá tocoacmcoA* coccc c c comi a> icicack u oc qajuo uocoo occoom ocac caccoc • chemické sekvenování = Maxam-Gilbertovo sekvenování - degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) • enzymatická metoda - specifická inhibice enzymové syntézy DNA - Sangerovo sekvenování • pyrosekvenování- směs enzymů (DNA pol., ATP sulfuryláza, luciferáza, apyráza) a substrátů (adenosinfosfosulfát, luciferin) - postupně se přidávají dNTP různých typů. Začleněním určitého typu dNTP vzniká světelné záření. • NGS - zefektivnění, zjednodušení, urychlení, zpřesnění - 454 sekvenování, SMRT, nanopóry, ... Využití: základní výzkum biologických procesů, diagnostika nemocí, forenzní medicína • Human Genome Project (1990 - 2003) Sangerovo sekvenování • Využívá dideoxynukleotidů • Sekvenování krátké sekvence ssDNA • Založeno na principu replikace • Reakční směs • DNAtemplát • Primer - radioaktivně značený • ddNTP - chybí volná 3'OH skupina • dNTP • Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5' ke 3' konci • Pufr • ddNTP se začlení do replikující se DNA a zastavuje elongaci (chybí mu OH skupina pro napojení dalšího dNTP) • Produkt - soubor ssDNA s fluorescenčně definovaným koncem lišících se o jednu bázi • Vyhodnocení - gelová elektroforéza G A T C I I Z I 3 U I 5 U I - J 5 Maxam-Gilbertovo sekvenování Sekvence DNA je na 5' konci radioaktivně značena fosforem 32P 5 chemikálií - každá štípe DNA ve specifickém místě - např. dimethylsulfát + piperidin —► G; hydrazin + piperidin C/T Vznikají různě dlouhé sekvence DNA, které jsou následně vyhodnoceny pomocí gelové elektroforézy. 5 - labeled CSONA h 'r > v. G G+A T+C c Sequencing gel A T G C C A G G A C G C T G A T Deduced DNA sequence Kapilární sekvenace ® Reaction mixture ► Primer and DNA template ► DNA polymerase ► ddNTPs with flourochromes ► dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) Primer 5' I I.....II 3' 3'4. ..... '........ Template ._ ddNTPs ddTTP -i ddCTPH ddATP -i ddGTP-« d Primer elongation and chain termination 5' t i i i i r 5' I J I I I I 5' I 1 l—r—I—T ST 5T 5' 7—i—i—i—i—r 5' I I I I I I 5' i—i—i—i—i—r , 3' * 3' -r-r^ f 3 ^3' +3) a o o ho-p-o—ř—o—P- P-O-P-O-^O ^ OH OH OH L-°-^J OM irddencs n tipriasphzlB ® Capillary gel electrophoresis separation ol DNA fragments Laser ® Laser detection of flourochromes and computational sequence analysis Criromalograph Praktická část cvičení Parodontitida - genetická variabilita destruktivní zánětlivé onemocnění postihující podpůrné tkáně zubů (ztráta závěsného aparátu, alveolárni kosti, zubů) • multifaktoriální choroba - faktory exogénni i endogenní * Etiologie — mikrobiální povlak - anaerobní G" bakterie [P. gingivalis, A. octinomycetemcomitons, T.forsythio. T. denticolo, P. intermedio aj.) - poškození parodonotu způsobeno: 1. produkty bakterií (např. toxiny, enzymy, LPS,...) 2. látky vznikající během zánětu (např. prozánětlivý TNFa, IL-1 a, p\ R) Kandidátní geny - Geny pro imunoregulační faktory / Pathogenic .Environmental • Interleukiny (IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18 a další) / bacteria factor Severity of - Metaloproteinázy (MMP1, MMP3, MMP9, MMP12 a další) V / Periodontitis - Produkty kostní remodelace (VDR, RAGE, SFTPD a další) Genetic \^ factor / Cy to kiny signální proteiny podílející se na imunitní odpovědi • produkovány buňkami IS (makrofágy, T-lymfocyty) schopné navodit rychlé dělení a diferenciaci určitých typů buněk, které se účastní boje proti patogenům • podílí na procesech zánětu a na neuronálním, krvetvorném a embryonálním vývoji organismu • jsou pleiotropní (působí na několik různých buněk) • působí bud' na buňku, která ho produkuje (autokrinní působení) • na buňky ve své těsné blízkosti (parakrinní působení) • transportu cévním řečištěm působí na vzdálené tkáně (endokrinní působení) IL-1 • prozánětlivý mediátor - cytokin • uvolňován monocyty, makrofágy, fibroblasty a dendritickými buňkami • stimuluje resorpci kosti a reguluje proliferaci fibroblastů gingiválního i ligamentálního původu ť u chorob parodontálních tkání Gen pro IL-1 • na chromozomu 2ql3-q21 recesivní alely IL-1A -889 a IL-1B +3953 - genové transkripce a produkce proteinů prozánětlivá odpověď) • recesivní alely IL-1RN VNTR - vj/ genové transkripce... Cytokiny x onemocnění parodontu Zánětlivé onemocněném' parodontu - komplexní onemocnění (endogenní a exogénni faktory) 1. Příčina zánětu-mikrobiální plak (anaerobní bakterie) - začátek imunitní odpovědi 2. Individuální predispozice Healthy RIZIKOVÉ A PROTEKTIVNI ALELY IL-lbeta - prozánětlivý cytokin - rizikové alely (Kornman, 1997) Healthy Gums Healthy Bone Leveli\ \ 0 lnterleukin-1 as a genetic marker for periodontitis: review of the literature. Grigcriadciu ME1, Koutayas SO, Madianos PN, Strub JR. Author information 1 Department of Prosthodontics. School of Dentistry. Albert-Ludwig University Freiburg Germany mariannagrifjoriadou@yahoo.com Abstract Periodontal Disease Periodontitis is considered to be a multifactorial disease. Studies have indicated that part of the clinical variability in periodontitis may be explained by genetic factors. Genes can affect the immunoinflammatory host response to bactenal challenge in the periodontal tissues by means of an overproduction of proinflammatory cytokines, such as interteukin-1 (IL-1). IL-1 plays an important role in the pathogenesis of periodontitis, through its involvement in the regulation of the hosfs inflammatory response and bone resorption. Therefore, the genes that encode for IL-1 production have recently received most attention as potential predictors of periodontal disease progression. Hence, the relationship between IL-1 genotype and periodontal disease has been investigated by a number of studies. This review article aimed to determine whether IL-1 could be regarded as a genetic marker for periodontitis by reviewing data concerning susceptibility, clinical parameters, and treatment strategies in relation to the IL-1 genotype. The review concluded that there is currently limited evidence to implicate a specific IL-1 genotype as a risk factor for chronic periodontitis in white _ populations. However, there is limited evidence that genetic variation in the IL-1B polymorphism could be a risk factor for aggressive periodontitis.^^B Cíl experimentu • Stanovení interleukinu IL-lbeta +3953C/T (rsll43634) u pacientů s chronickou parodontitidou J Periodontal Res. 2000 Jun;35[3):172-7. Effect of the interleukin-1 genotype on monocyte IL-1beta expression in subjects with adult periodontitis. Mark LL1, Haffaiee AD, Socransky 55, Kent RL Jr. Guerrero D, Kornrnan K, Newman M. Stashenko P. Author information Abstract An association has been reported between polymorphisms in the genes encoding IL-1alpha (-889} and IL-1 beta (+3953) (periodontitis susceptibility trait. PST). and an increased severity of periodontitis (18). The IL-1 beta polymorphism was reported to correlate with increased IL-1 beta expression by monocytes in response to bacterial stimulants In the present stnrtv wp determined if PST nnsitive siihients with nerinrinntitis exhibit elevated production of IL-1 beta compared to PST negative periodontitis patients. Peripheral blood monocytes were obtained from 10 PST+ and 10 PST-age-and disease-balanced subjects with adult forms of periodontitis. Monocytes were cultured with a panel of bacterial stimulants, including Escherichia coli and Porphyromonas gingivalis LPS. and whole formalinized periodontal pathogens P gingivalis Bacteroides forsythus and Prevotella intermedia, and health-associated organisms Veillonella parvula and Streptococcus sanguis Our results demonstrate that monocytes from PST+ and PST-patients showed no significant differences in IL-1 beta production in response to any stimulant tested. In addition, the periodontal pathogens P gingivalis. B. forsythus and P. intermedia failed to stimulate higher IL-1 beta responses compared to health-associated species V. parvula and S. sanguis A marked intehndividual variation in production of IL-1 beta was seen, with high, low and intermediate responders present in both PST+ and PST- groups. We conclude that genetic loci other than the PST polymorphisms are also important regulators of monocyte IL-1 responses Metody stanovení 1. PCR IL-1B+3953C/T(rsll43634) u subjektů s chronickou parodontitidou Forward 249bp Reverse CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT amplifikace vybraného úseku z celkové DNA Metody stanovení 2. RFLP IL-1B +3953C/T (rsll43634) pomocí reštrikční endonukleázy Taql Forward Reverse -> <- TTATACCTAA ACAACATGTG TCTCCACATT TCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT CCTTCTGATT ^ detekce úseku s konkrétní variantou C/T Taql BbLabs,, NEBcutter 5' . . . T C G A ... 3' 3' . . . A G C T ... 5' C Metody stanovení 3. ELFO restrikčních fragmentů po štěpení Taql Výsledek: Heterozygot Homozygot (rozštěpený) Homozygot (nerozštěpený = polymorfismus) Děkuji za pozornost