doc. RNDr. Monika Pávková Goldbergová, Ph.D. Genová terapie a farmakogenetika Farmakogenetika 2 Cíl ◼ Na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu na různé léky. ➢ Farmakogenomika ✓ Farmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky léků na organismus (lék→ organismus) ✓ Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací (organismus → lék) 3 Klíčové složky farmakogenetiky 4 5 Vztah ke genům ◼ Téměř každá dráha metabolismu léku, jeho transportu nebo aktivace je ovlivněna genetickou variabilitou.  Klinická variabilita v odpovědi  Riziko vedlejších účinků  Genotypově specifické dávkování  Polymorfní cíle léku 6 20-90% individuální odpovídavosti na předepsanou léčbu souvisí s genetickou variabilitou. 59% z 27 nejčastěji citovaných léků s ohledem na nežádoucí účinky genetické varianty se sníženou funkcí nebo nefunkčností proteinů. NEJM 348; 529-538, 2003 / JAMA 286; 2270, 2001) 7 Klinický potenciál farmakogenetiky 8 Výhody „Genomické medicíny“ – klinický potenciál ◼ Odhalení onemocnění v raném stádiu, kdy je snadnější účinně léčit; ◼ Usnadnění výběru optimální léčby a omezit léčbu pokus-chyba; ◼ Snížení výskytu nežádoucích účinků; ◼ Zvýšení odpovídavosti pacienta na léčbou; ◼ Zlepšení výběru cílů ve vývoji léků a snížit čas, náklady a selhání klinických zkoušek; ◼ Důraz na prevenci; ◼ Snížení celkových nákladů na zdravotní péči. 9 Kolik lidských genů představuje cíle současných léků? 1) ~500 (5% celkového genomu) 2) ~1,000 (10%) 3) ~5,000 (25%) 4) ~10,000 (50%) 5) ~ 15,000 (75%) 6) ~20,000 (100%) 10 Farmakogenetika a vývoj léků ➢ Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům mohou vést různé patobiochemické mechanismy). ➢ Individuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech, vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho působením. 11 Hodnocení významu genetických faktorů u multigenních nemocí- 10 otázek ✓ Jak důležité jsou genetické vlivy i nejčastějších forem multigenních nemocí? ✓ Jaký je vliv prostředí na vznik nemoci? ✓ Které jsou nejslibnější přístupy k determinaci genetických faktorů pro nemoc? ✓ Které geny již byly vybrány jako vnímavé? ✓ Které cesty přispívají ke genetické vnímavosti pro danou nemoc? ✓ Jak mnoho genů se podílí na vnímavosti k nemoci účastní? ✓ Jsou nejčastější formy multigenní nemoci asociovány s častou nebo vzácnou genetickou variabilitou v populaci? (hypotéza častá variace/častá nemoc vs. genetický heterogenní model) ✓ Proč alely, které jsou asociovány s nemocí, nebyly z populace eliminovány? ✓ Jako důležité jsou pro danou nemoc interakce geny-prostředí a geny-geny? ✓ Jaké jsou důsledky pro farmakogenetiku? 12 Kandidátní geny - asociace ➢s intermediálním fenotypem ➢s klinickou manifestací nemoci ➢s klinickou závažností nemoci ➢s odpovídavostí nemoci na léčbu 13 Typy genetických studií ◼ Linkage ◼ Asociační ◼ Case-control („susceptibility genes“) ◼ Case-case ◼ Genotyp-fenotyp („genes modulators“) 14 Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k vedlejším účinkům léků 15 Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k účinnosti léků 16 Cytochrom P4502C9 (CYP2C9) ◼ dvě alelické varianty genu CYP2C9 1, 2  CYP2C9*2 ◼ záměna C430T v exonu 3 vede k substituci Arg144Cys  CYP2C9*3 ◼ záměna A1075C v exonu 7 vede k substituci Ile359Leu ◼ in vitro má CYP2C9*1 normální, zatímco varianta CYP2C9*2 vykazuje menší a CYP2C9*3 podstatně menší enzymatickou aktivitu 3, 4 ◼ fenotypickým projevem je snížení clearance léků závislých na CYP2C9 1. Stubbins MJ et al: Pharmacogenetics 1996; 6:429-329 3. Rettie AE et al: Pharmacogenetics 1994; 4:39-42 2. Veronese ME et al: Biochem J 1993; 289:533-8 4. Haining RL et al: Arch Biochem Biophys 1996; 333:447-58 17 P450 ◼ CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků ◼ CYP2D6 – 20% ◼ CYP2C9 + CYP2C19- 15 % ◼ CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní ◼ Např. ovlivňuje metabolismus warfarinu, acenocoumarolu a dalších léků (phenotyoin, tolbutamid, glipizide a další perorální antidiabetika typu sulfonylurey). 18 Dávka / antikoagulační efekt warfarinu 12. Alving BM et al: Arch Intern Med 1985; 145:499-501 13. Oldenburg J et al: Br J Hematology 1997; 98:240-4 polymorfismus cytochromu P450 CYP2C9*2 CYP2C9*3 rezistence na warfarin - jaterní receptor pro warfarin mutace FIX genetické faktory vlivy prostředí vztah dávka / odpověď na warfarin 12 13 19 20 CYP2C9 ACTIVITA Prescribed Daily Warfarin Dose and CYP2C9 Genotype Warfarin Dose* Genotype 5.63 (2.56) *1/*1 4.88 (2.57) *1/*2 3.32 (0.94) *1/*3 4.07 (1.48) *2/*2 2.34 (0.35) *2/*3 1.60 (0.81) *3/*3 *Data presented as mean (SD) daily dose in mg From: Higashi MK, et al. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy. JAMA 287:1690-1698, 2002. Klinické projevy polymorfismu CYP2C9 ◼ předávkování při zahájení antikoagulace standardními režimy 14, 16, 17, 18, 19 ◼ nižší udržovací dávka nutná k dosažení a udržení terapeutického rozmezí 11, 15, 16, 18, 19 ◼ vyšší riziko předávkování dané interakcemi s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 17, 21 ◼ nestabilita antikoagulační terapie 15, 16 ◼ delší přetrvávání antikoagulačního efektu po přerušení léčby nebo snížení dávky warfarinu 14. Aithal GP et al: Lancet 1999; 353:717-9 16. Higashi HK et al: JAMA 2002; 287:1690-8 15. Taube J et al: Blood 2000; 96:1816-9 17. Verstuyft C et al: Eur J Clin Pharmacol 2003; 58:739-45 21 Interakce s léky metabolizovanými a/nebo reagujícími s CYP2C9 Soutěž o substrát Enzymový induktor Enzymový inhibitor ASA a většina NSAID rifampicin fluvoxamin (ostatní SSRI slabí) fenobarbital, fenytoin fenobarbital, fenytoin omeprazol S-warfarin karbamazepin inhibitory HMG-CoA reduktázy losartan tolbutamid tolbutamid cimetidin (slabý) sulfonamidy, dapson azolová antimykotika (slabá) diazepam, tenazepam ritonavir fluoxetin, moclobemid desethylamiodaron zidovudin 17, 20, 21 20. Topinková E et al: Postgrad Med 2002; 5:477-82 21. Naganuma M et al: J Cardiovasc Pharmacol Ther 2001; 6:636-7 22 23 Rychlost metabolismu ◼ Dle aktivity enzymu může být populace rozdělena do čtyř hlavních skupin pomalí metabolizátoři (PM), intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři (EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM). ◼ Většina jedinců bílé populace patří mezi tzv.extenzivní metabolizátory (EM), u nichž jsou léčiva metabolizovány předpokládanou rychlostí. ◼ 5-10 % jedinců je geneticky determinováno jako pomalí metabolizátoři (PM), kteří mají zpomalené odbourávání látek metabolizovaných a jsou ohroženi vyšším výskytem nežádoucích účinků léčby. ◼ Intermedientní metabolizátoři (IM) jsou zastoupeni v 10-15 % a při dlouhodobé léčbě jsou svými reakcemi na léčbu srovnatelní se skupinou PM. ◼ U ultrarychlých metabolizátorů (UM) probíhá metabolizace intenzivněji a klinicky nereagují na běžné dávky léků a je zastoupena v 5-10 %. Geny odlišující ALL od AML 25 Geny přispívající k vnímavosti ke kardiovaskulárním nemocem 26 RAS Geny v červeném oválu leží na X chromosomu (muži mají jen jednu alelu); významný rozdíl ve fyziologii mezi muži a ženami 27 The vasoconstrictor/proliferative and the vasodilator/antiproliferative actions of the RAS mediated by Ang II and Ang(1–7), respectively, depend on the ACE/ACE2 ratio balance Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; and Ang, angiotensinogen . 28 BRONJ Age Obesity Smoking Cancer diagnosis Genetic background Osteonecrosis of the jaw induced by bisphosphonates (BP) BRONJ free BP users BRONJ BP users Genome-wide Sreening DNADNA SNPs in RBSM3 RBSM3 COL1 Prx1 Fibroblast + RBSM3 ; Col1 Expression Osteoporosis RBSM3 29 Metotrexát u RA ◼ Efektivita léčby revmatoidní artritidy (RA) metotrexátem (MTX) 46% - 65 % (ACR 20) ◼ Při léčbě MTX se mohou vyskytnout nežádoucí účinky. Alespoň jeden u 72,9% pacientů, závažné až u 30% pacientů.  gastrointestinální toxicita (nevolnost, zvracení, průjem, 20% - 65%  hepatotoxicita 10% - 43%  orální ulcerace 37%  alopecie až 4%  pulmonální toxicita 2,1% - 8%  útlum kostní dřeně lehký 12%  pancytopenie 0.8% 30 Foláty Gastrointestinální toxicita Dihydrofoláty Adenosin - uvolňování 5,10-methylen tetradydrofolát 5,10- methenyl tetrahydrofolát 10- formyl tetrahydrofolát 5-methyl tetradydrofolát Syntéza polyaminů 31 Účinek MTX v buňce – cíle pro SNPs ◼ MTXPG přímo inhibuje enzymy důležité pro syntézu purinů a pyrimidinů – thymidylát syntázu (TYMS) a dihydrofolát reduktázu (DHFR). DHFR se účastní na konverzi homocysteinu na methionin a tím pro syntézu polyaminů. Metabolismus adenosinu ◼ Ovlivnění metabolismu adenosinu patří k nejdůležitějším mechanismům protizánětlivého působení metotrexátu. ◼ MTXPG inhubuje 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid formyltransferáza (ATIC), tím zprostředkovává vliv na metabolismus adenosinu (imunosupresivní účinek). 32 Nitrobuněčný metabolizmus MTX – cíle pro SNPs ◼ Vstup do buněk pro foláty a antifoláty ◼ přenašeč SLC19A1 nebo reduced folate carrier (RCF-1) ◼ folátové receptory (FR-α a FR-β), endocytóza - nižší afinita MTX k receptorům než foláty (malý význam metabolické cesty) ◼ Transport MTX z buňky - efluxní transportéry z rodiny ABC (ATP-binding cassette) např. (ABCC1-4 a ABCG2). ◼ Intracelulární metabolizmus – přidání 2 až 5 glutamátových skupin → aktivní metabolit, polyglutamát metotrexátu (MTXPG), v buňce se hromadí. Tento proces je katalyzován folylpolyglutamát syntetázou (FPGS) a je reverzibilní prostřednictvím gamaglutamyl 33 Methotrexát Ranganathan P, McLeod HL. A&R 200634 Methotrexát Ranganathan P, McLeod HL. A&R 200635 MDR1 ◼ MDR1 (ATP-binding cassette B1/multidrug resistance 1) is an efflux pump that transports toxic endogenous substances, drugs and xenobiotics out of cells. ◼ It is known to affect susceptibility to many hematopoietic malignancies. ◼ ABCB1/MDR1 polymorphisms may either change the protein expression or alter its function, suggesting a possible association between ABCB1/MDR1 single nucleotide polymorphisms (SNP) and clinical aspects of T-cell lymphoma. ◼ Therefore, association of two polymorphisms in the gene with clinical staging and therapy was evaluated. 36 0% 20% 40% 60% 80% 100% Proopiomelanokortin 1 (--) (+-) (++) (--) 15 8 (+-) 54 42 (++) 31 50 Místní terapie - Místní terapie + CTCL – kožní T-lymfomy OR pro genotypy -- a +- u pacientů bez místní terapie oproti pacientům s místní terapií je 2,20, 95% CI 1,19-4,07; P=0,008, senzitivita 0,687, specificita 0,500, síla testu 0,666. 37 ◼ MicroRNA (miRNA) – regulace genů důležitých pro funkci léků. ◼ Interakce miR-gen–lék prostřednictvím degradace farmakologicky relevantního cíle. 38 (A) An example of an experimentally verified miRNA pharmacogenomic set. miR-125 b inhibits vitamin D receptor (VDR) expression. Rukov J L et al. Brief Bioinform 2013;bib.bbs082 © The Author 2013. Published by Oxford University Press. 40 From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Epigenetika MGMT – methylguanine-DNA methyltransferase Metylatilace promotoru MGMT silencing genu 41 From: Esteller M, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. NEJM 243:1350-1354, 2000. Perzonalizovaná medicína 42 Náklady 43 44 Genová terapie: typy nemocí ◼ Infekční nemoci ◼ Rakoviny ◼ Vrozené nemoci ◼ Nemoci imunitního systému 45 Genová terapie ➢ Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. ➢ Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy. ➢ Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta ➢ Genová terapie in vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus ➢ Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu Genová terapie ➢ Klasická genetická terapie (dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů) s cílem: ➢ 1. zajistit produkci látky, která chybí ➢ 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky 47 Neklasická genová terapie ➢ Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou ➢ Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese ➢ Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. ➢ Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací. 48 Rekombinantní léky je možno produkovat expresním klonováním v mikroorganismech nebo v transgenních zvířatech V mikroorganismech: ✓ Výhody: dostatečná množství produkovaných látek ✓ Nevýhody: ✓ Pozměněné produkty v důsledku odlišných posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární strukturou (glykosylace) ✓ problémy s purifikací V transgenních zvířatech: ✓ možnost navodit podobné posttranslační systémy jako u člověka 49 „Genetically engineered“ protilátky a vakcíny Uměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa), které poznají specifické antigeny asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk Typy nemocí: ◼ Lymfomy, leukemie, infekční nemoci, autoimunitní nemoci. Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk (vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor). 50 Chimerické a humanizované protilátky ➢ Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí ➢ Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: ➢ chimerické V/C protilátky) ➢ CDR (complementarity determining regions) graft protilátky ➢ Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk 51 52 53 Plně lidské protilátky ◼ Technologie fágového displaye: protilátky jsou tvořeny in vitro napodobováním selekční strategie imunitního systému ◼ Transgenní myši: Transfer kvasinkových umělých chromozomů s velkými segmenty lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších embryonálních buněk. Narozené myši obsahují velmi pozoruhodnou porci lidských V genetických segmentů a jsou schopny tvořit lidské protilátky 54 „Geneticky enginnered“ vakcíny ➢ Pomocí rekombinantní technologie: ➢ Vakcíny nukleových kyselin: ➢ bakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor. ➢ „gene gun“ - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA 55 „Geneticky enginnered“ vakcíny ➢ Genetická modifikace antigenu – např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity ➢ Genetická modifikace virů- virové vektory ➢ Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: ➢ odstranění genů nutných pro patogenezu ➢ expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů 56 Technologie klasické genetické terapie ◼ Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně ➢ Geny mohou inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo ➢ Inzertované geny se mohou ✓ Integrovat do chromozomů ✓ Zůstat extrachromozomálně (epizomy) 57 Genetický transfer ➢ Ex vivo ✓ Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) ➢ In vivo ✓ Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů. 58 59 60 Principy genetického transferu➢ cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje ➢ A) do chromozomu ➢ gen se bude rozšiřovat do dalších buněk ➢ zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) ➢ náhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. ➢ B) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku 61 62 63 64 65 66 67 Naked DNA Target Cell Therapeutic Protein AAV Retrovirus/Lentivirus Adenovirus Nucleus Principy genové terapie Tissue Engineering v praxi: – temporomandibulární kloub. (a) design teoretického, místně specifického implantátu temporomandibulárního kloubu pomocí pevné výroby bez formy (b) Kompozitní konstrukce z PLLA s diferencovanými prasečími chondrocyty a hydroxyapatitem (HA). (c) Implantát za 4 týdny po implantaci. Review Article Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation E. L. SCHELLER*, P. H. KREBSBACH* & D. H. KOHN*,† *Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, J Oral Rehabil. 2009 Feb 17. [Epub ahead of print –doporučuji přečíst! ! ! Metody doručení genu do tkáně vektor kapa- cita snadnost produkce integrace do genomu trvání exprese transdukce nedělících se buněk existující imunita bezpečnost přeno s do potom stva nevirální bez limitu +++ zřídka dočasná ++ ne +++ ne onko- retroviry 8 kb ++ ano stabilní - ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může lentiviry 8 kb + ano stabilní ++ ne inserční mutagenese aktivace onkogenů může adenoviry 30 kb + ne dočasná +++ ano hyperimunitní odpověď ne adeno asociated virus AAV 4.6 kb + možná dlouho- trvající ++ slabá +++ může Herpes viry 150 kb + ne dočasná ++ ano hyperimunitní odpověď ne Animal Models are Useful to Study Potential Gene Transfer Vectors Animal Model Disease MRL/lpr mice Lupus W/Wv mice Fanconi’s anemia Wobbler mice ALS db/db mice Diabetes spf mouse OTC deficiency mdx mice Muscular dystrophy cftr-KO mouse Cystic fibrosis Watanabe rabbit Hypercholesterolemia hemophilic dogs Hemophilias A/B various MPS defects (dog, cat, rat) Lysosomal storage Nemoci v současnosti léčené genovou terapií - př. ve fázi klinického testování nemoc defekt cílové buňky četnost těžká imunodeficience adenin deaminasa buňky kostní dřeně 1/1.000.000 (SCID) T-lymfocyty hemofilie krevní faktor VIII a IX játra, svaly 1/1.000.000 muži Cystická fibrosa CF plicní alveoly 1/2.500 Deficience emfyzém plicní alveoly 1/3.500 alfa-1-antitrypsinu rakovina nespecifické 1/4 Neurodegenerativní nemoci degradace neuronů neurony v mozku 1/250 Parkinson, Alzheimer infekční nemoci T-lymfocyty, makrofágy AIDS, hepatitis B Cystická fibróza • mutace v iontovém přenašeči CFTR transmembrane conductance regulator • nejvíce postihuje plicní alveoly, střevní epitel a pankreas – zvýšena produkce hlenu, citlivost k plicním infekcím. • výhodou pro terapii je že stačí pouze několik molekul proteinu na buňku aby se jí vrátila normální funkčnost. • úspěšné pokusy v kulturách a na myších transformovaných pomocí liposomů • u lidí se zavedla jako pomocná léčba sprejování adenoviru nesoucího transgen CFTR do nosu, účinné v plicích, nepůsobí na slinivku principy genové terapie rakoviny doručení konstruktu zajišťující zastavení exprese onkogenu (antisense konstrukt)doručení nemutovaného supresorového genu p53 využití onkoretrovirálních vektorů principy genové terapie rakoviny doručení sebevražedného genu přeměňující pro-drug na toxin Nanotechnology Based Drug Delivery Systems for Cancer Therapy Schematics - Reproduced from Sahoo and Labhasetwar, 2003 with kind permission from Drug Discovery Today. http://www.cancer-therapy.org/CT3A/HTML/13.%20Orive%20et%20al,%20131-138%20.html 2005 ◼ Nanotechnology in clinical trials to restore normal gene function to cancer cells - Loss of normal p53 function results in malignant cell growth and has been linked to resistance to radiotherapy and chemotherapy in a number of cancers. Ester Chang, Georgetown Univ. delivered group delivered functional p53 genes to tumor cells and tumor metastases in 16 different types of cancer in animal models. When the job of reinstating a normal p53 suppressor gene is done, the nanoparticle, essentially a little fat droplet wrapped around the gene, simply melts away, unlike non-biodegradable delivery systems. Phase 1 human trials are underway at Baylor Univ - Dallas. 1 Apr09 ◼ Nanotechnology therapy for brain cancer - Argonne National Laboratory show the first evidence of successful bioconjugated nanoparticles targeting toward cancer and away from normal brain cells. Uses 5 nm TiO2 nanoparticles that are covalently conjugated with an antibody that specifically targets certain tumors, including GBM. A naturally occurring metabolite of dopamin, DOPAC, is used as a linker molecule to tether the antibody to the nanoparticles. The TiO2 absorb energy from light, which is then transferred to molecular oxygen, producing cytotoxic reactive oxygen species (ROS). ROS damages the cell membrane and induces programmed death of the cancer cell. 2 Oct 09 1 http://www.foresight.org/nanodot/?p=3018 2 http://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=12962.php p53 Děkuji vám za pozornost☺ 80