Koncepce genomu „Read and
Write“ a důsledky její aplikace v
onkologii
Prof. Anna Vašků1
Koncepce „Read and Write genome“
̶ Genomy jsou databáze DNA, které obsahují
kódující a formátující sekvence, které
umožňují dědičné předání schopnosti
syntetizovat biologicky adaptivní molekuly
RNA a proteinů. V průběhu evoluce se
kódující sekvence i formátující signály mění,
což umožňuje stále nové adaptace pomocé
restrukturalizace genomu (Shapiro,
2011 a Shapiro, 2013).
̶ Dynamický read–write (RW) genome střídá
tradiční představu „read only memory“ (ROM)
genomu.Prof. Anna Vašků2
Koncepce „Read and Write (RW) genome“
̶ Základní ideou této koncepce je myšlenka, že buňky
používají DNA jako modifikovatelný prostředek skladující
data („data storage medium“), který kóduje RNA a
proteinové molekuly: tyto molekuly si musejí poradit s
měnícím se prostředím.
̶ Změna je pro žijící organismy kontinuálním dějem. Ke
změnám dochází během průchodu buněk cyklem
buněčného dělení, s měnícími se vlastnostmi vnějšího
prostředí, se zkušeností buněk s poškozením, s vývojem
multicelulární morfogenezy a s interakcí buněk s jinými
buňkami a organismy.
Prof. Anna Vašků3
Koncepce „Read and Write (RW) genome“
̶ Ke zvládnutí krátkodobých změn buňky primárně nasazují
přechodně vznikající nukleoproteinové komplexy, které
jsou schopny regulaci exprese genomických dat a
umožňují tak růst a replikaci buněk.
̶ Pro dlouhodobější změny, jako je buněčná diferenciace a
multicelulární morfogeneze, vstupují do hry dědičné
epigenetické modifikace genomu.
̶ Pro nejdlouhodobější změny, které vytvářejí nové
biologické funkce během evoluce, buňky nasazují
schopnost „natural genetic engineeringu“, které umožňují
přebírat a alterovat sekvence DNA a rekonfigurovat
organizaci genomu. Někdy tyto funkce mění strukturu DNA
také v zájmu krátkodobých cílů (např. rychlá nastolená
diverzita mezi receptory adaptivního imunitního systému).
Prof. Anna Vašků4
Tumorigeneze je komplexní evoluční proces zahrnující mnoho genetických a
epigenetických alterací. Epigenetické změny během iniciace a progrese
tumoru poskytují abundantní zdroj variability, která podporuje rychlou
adaptaci tumoru a poskytuje bohatý zdroj labilních biomarkerů pro
genetickou analýzu.
Tumour Biol. 2016 Jul 28. Biomarkers of genome instability
and cancer epigenetics. Reis AH, Vargas FR, Lemos B.
Prof. Anna Vašků5
Průběh kancerogeneze
➢Tři stádia:
➢(1) Iniciační stádium, které představuje prvotní genetickou událost, tj. mutaci určitého kritického genu. Jde
o období časově krátké, ale nevratné; iniciovaným buňkám přináší růstovou selekční výhodu. Buňka tak
získává potenciál maligní transformace; v tomto stádiu se může proces zastavit.
(2) Promoční stádium, které trvá léta, až desetiletí; postižené buňky (klon) jsou stimulovány ještě
k intenzivnější proliferaci. Promoční faktory samy o sobě nejsou však schopny vyvolat maligní
nádorovou transformaci, jen ji podpořit. Intenzita promočních mechanismů musí dosáhnout určitého
stupně, aby byl iniciovaný klon stimulován, a naopak odstranění podpůrných faktorů může proces
kancerogeneze zpomalit nebo i zastavit.
➢(3) Stádium progrese je charakterizováno dalším postupným nahromaděním genetických změn jako je
✓(a) nekontrolovaný růst pro trvalou aktivaci signální transdukce růstového stimulu,
✓(b) alterace kritických bodů buněčného cyklu,
✓(c) deregulace DNA- transkripčních faktorů.
̶ Nádor zůstává nejprve v místě svého vzniku, ale aktivací dalších faktorů se začne šířit do nejbližšího okolí
(invaze) a cestou krevního oběhu na místa vzdálená (metastázy). Velmi důležitou podmínkou pro růst
nádoru je dostatečný přísun živin a kyslíku, který musí být zajištěn vytvořením cévního zásobení (nádorová
neoangiogeneze).
Prof. Anna Vašků6
Schéma vývoje tumorigeneze
Prof. Anna Vašků7
Ztráta kontroly buňky
nad syntézou DNA u maligních tumorů
̶ Buněčný cyklus je u zdravého jedince regulován tak, že
každý buněčný typ v daném orgánu „ví“, kdy přestat s
růstem.
̶ U dospělého jedince jsou téměř všechny tkáně kontinuálně
regenerovány a buňky opět „vědí“, kdy přestat s dělením.
̶ U rakoviny buňka selhává ve schopnosti přijmout nebo
interpretovat signály prostředí.
Prof. Anna Vašků8
Buněčný cyklus a nádorové bujení
̶ U nádorového bujení je postižena především regulace přechodu G1-fáze do S-fáze.
Tři komplexy cyklindependentních kinas, cyklin D/cdk4, cyklin D/cdk6 a cyklin E/cdk2
fosforylují produkt retinoblastomového genu – Rb, a to na 10ti různých místech a mění
tak schopnost Rb asociovat s buněčnými proteiny. Jeden takový protein - E2F – je
transkripční faktor, který tvoří heterodimer s jiným transkripčním faktorem DP1, čímž se
aktivuje několik genů nutných pro rozvoj S-fáze. Znamená to indukci aktivace
dihydrofolátreduktasy, thymidinkinasy, DNA-polymerasy a, c-myc, cmyb
a cdc2. Kromě této podpory růstových faktorů podporuje Rb také
diferenciaci prostřednictvím jeho asociace s transkripčními faktory jako je MyoD a
aktivovaný transkripční faktor, kterým jsou komplexy (ATF)/cAMP-response element
binding proteiny (CREB). Rb je také místem zásahu pro transformující viry jako SV40
large T-antigen, adenovirový E1A a antigen E7 lidského papillomaviru (human
papilloma virus E7).
Prof. Anna Vašků9
Buněčný cyklus a nádorové bujení
̶ Je-li poškození DNA příliš rozsáhlé a tedy
neopravitelné, buňka se stává nenormální a
je eliminována apoptózou.
̶ Nedojde-li však k apoptóze, vzniklá mutace
přetrvává a může být při dělení takto
mutované buňky přenesena na buňky
dceřiné. Vzniká tak fenomén genové
nestability, který podporuje maligní
transformaci. Stává se to častěji kupř. u nosičů
genu HNPCC (hereditární nepolypózní
kolorektální karcinom). Je zde defekt v
„opravném čtení“, takže chyba v replikaci
DNA není zjištěna a opravný mechanismus
není nastartován.Prof. Anna Vašků10
Základní skupiny proteinů regulujících buněčný růst
Prof. Anna Vašků11
STÁRNUTÍ BUNĚK
➢s postupujícím věkem se objevují funkční i morfologické změny skoro
ve všech orgánech a tkáních. Tyto změny mají svůj podklad též ve
stárnutí buněk.
➢V mitochondriích se postupně snižuje kapacita oxidační fosforylace
➢mění se syntéza strukturálních proteinů i enzymů pro alterace v DNA
a RNA vznikající s narůstajícím věkem.
➢stárnoucí buňky mají sníženou schopnost opravovat poškozené
chromosomy; snižuje se jejich potřeba množství živin.
➢Změny v morfologii buňky: Jádro se stává abnormálně laločnaté a
nepravidelné, dochází k pleomorfní vakuolizaci mitochondrií, ubývá
endoplasmatického retikula a Golgiho aparát se zkrucuje.
V buňkách se hromadí lipofuscin jako produkt lipidové peroxidace.
Prof. Anna Vašků12
Teorie stárnutí buněk
Příčiny stárnutí buněk jsou pravděpodobně
multifaktoriální:
➢endogenní molekulární program stárnutí
➢vliv exogenních škodlivých faktorů, který ovlivňuje
životaschopnost buněk
➢Dlouhověkost je patrně specificky regulována na
genové úrovni a řídí takové aktivity, jako je opravné
mechanismusmy pro DNA nebo antioxidační
obrana).
➢Kandidátní geny dlouhověkosti mohou též souviset s
genetickým polymorfismem protektivních alel
lipidového metabolismu, jako je např. e2 alela u
apolipoproteinu E2. U dlouhověkých zjištěna též
prevalence genetického polymorfismu genu
paraoxonasy na kodónu 192.
Prof. Anna Vašků13
Stárnutí buňky
➢Dochází k progresivnímu poškozování buněk
reaktivními formami kyslíku a dusíku. Děje se tak
nepříznivými vlivy z okolí, jako je ionizující záření a
stále se snižující kapacita antioxidačních
mechanismů.
➢Peroxidace poškozuje nukleové kyseliny. Reaktivní
formy kyslíku (ROS) způsobují denně alteraci 10 000
bazí DNA v jedné buňce, což převýší možnosti
opravného mechanismu, jehož kapacita se
s narůstajícím věkem snižuje. Mutace se hromadí
nejen v DNA v jádře, ale též v mitochondriální DNA.
Tento jev dramaticky roste s věkem.
➢Volné kyslíkové radikály katalyzují oxidační modifikaci
proteinů, včetně enzymů, což vede k jejich
degradaci cytosolovými proteázami. Znamená to
další omezení funkce buněk.
Prof. Anna Vašků14
Stárnutí buňky
➢U stoletých lidí byla prokázána vyšší poly(ADPribosyl)ační
aktivita. Poly(ADP-ribosyl)ace nukleárních
proteinů katalysovaná poly(ADP-ribosa)-polymerasou
(PARP-1) (s NAD+ jako substrátem) je posttranslační
děj ovlivňující DNA-šroubovici, což má vliv na
instabilitu genomu způsobovanou endogenními i
exogenními genotoxiny.
➢S věkem stoupají post-translační modifikace
intracelulárních a extracelulárních proteinů, což vede
k funkčním i morfologickým změnám. Jednou z nich je
neenzymová glykace proteinů a vznik konečných
produktů pokročilé glykace (AGE-products).
➢změny v indukci proteinů tepelného šoku (heat
shock proteins), zvláště Hsp70. Tyto proteiny jsou velmi
důležitým obranným mechanismem vůči různým
formám nadměrné zátěže.
Prof. Anna Vašků15
Stárnutí buňky - telomery
➢Telomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem
terminální části chromosomu. Skládají se ze složky
DNA (repetitivní sekvence 5'-TTAGGG-3‚) a z 6 proteinů.
➢Délka telomer se zmenšuje po mnohonásobných
pasážích (cekem se předpokládá 50-80 buněčných
dělení / život).
➢Nejdelší jsou u spermií; u buněk fetálních jsou delší než
u buněk z dospělých jedinců.
➢Jejich obnovování je katalyzováno telomerázou;
délka telomer koreluje s obsahem telomeráz. Z toho
důvodu se předpokládá, že úbytek DNA od konce
chromosomů zkracováním telomer vede k deleci
nezbytných genů, což má za následek omezení
života buněk.
Prof. Anna Vašků16
Stárnutí buňky - telomery
̶ Telomery jsou koncové části chromosomů. Při buněčném dělení
se telomery zkracují kvůli neschopnosti syntetizovat konce
lineárních nukleových kyselin.
̶ Původní délka se obnovuje obvykle během tvorby pohlavních
buněk činností telomerázy, což je neobvyklá RNA dependentní
DNA polymeráza nesoucí si vlastní molekulu RNA jako templát
pro tvorbu DNA. Kromě pohlavních buněk jsou své telomery
schopné znovu prodlužovat i kmenové buňky díky přítomnosti
vlastní telomerázy.
̶ Většina rakovinných buněk také obnovuje své telomery pomocí
telomerázy, což umožňuje potlačit růst řady rakovinných buněk
blokací telomerázy,[část rakovinných buněk ale opravuje své
telomery alternativním systémem využívajícím rekombinaci.
̶ Postupné zkracování délky telomer vede ke stárnutí buňky
(senescence).
Prof. Anna Vašků17
Heritabilita nádorů
➢Familiární- více členů téže rodiny
má nádor
➢Sporadické – jen jeden člen rodiny
má nádor
➢Různé mechanismy
Prof. Anna Vašků18
Heritabilita nádorů
➢Ačkoli některé formy nádorů jsou dědičné, většina vzniká na
podkladě remodelace somatických buněk a je způsobena
endogenními chybami v replikaci DNA, které jsou vyvolány
genetickými (mutace v DNA, chromosomální aberace) i
epigenetickými změnami.
➢Vliv kancerogenů
➢UV-záření příslušné vlnové délky může být absorbováno bazemi
DNA, která je tak poškozena za vzniku dimerů dvou sousedících
pyrimidinů. Tato změna překáží normální transkripci i replikaci
DNA.
➢Účinek ionizujícího záření je odlišný: dochází k rozštěpení
(přerušení) DNA-řetězce; vznikají tak volné řetězce DNA, které
musí být beze zbytku opět navázány opravným mechanismem.
Nestane-li se tak (buňka netoreluje volné konce DNA), může
dojít k translokaci určitých úseků chromosomů, což bývá příčinou
aktivace proto-onkogenů.
Prof. Anna Vašků19
Heritabilita nádorů
Jedna genetická změna však nestačí navodit maligní
transformaci buňky; ta obvykle vzniká až po několika
(5ti až 10ti) genových mutacích v průběhu řady let.
➢Genová alterace navodí vznik nádorového fenotypu,
např.:
➢proliferace epitelové buňky hyperplazie adenom
dysplazie karcinom „in situ" karcinom invazivní.
➢Přeměna normální tkáně organismu do stavu
invazivní nádorové choroby trvá v průměru 5 – 10 let.
Ovlivňují to hereditární genetické faktory a somatické
faktory genetické i epigenetické.
Prof. Anna Vašků20
Germinativní vs. somatické mutace
̶ Germinativní mutace přítomny ve všech buňkách. V
průběhu života se nemění (genetická predispozice)
̶ Somatické mutace vznikají v somatických buňkách v
průběhu života (maligní transformace).
Prof. Anna Vašků21
Vzácné alely a polymorfismy
̶ Vzácné alely jsou „špatné“ (loss of function, gain of function)
̶ Jsou často pod tlakem selekce
̶ Polymorfismy (> 1% frekvence v populaci)
̶ Význam:
̶ Zdroj vrozené variability genomu
̶ Faktor přežití vzhledem k patogenům?
̶ Jak vzácné mutace, tak polymorfismy jsou způsobeny genovými
mutacemi.
̶ Genom současníků je výrazně modifikován evolucí (dlouhodobějipaleolit)
a historií pandemií (krátkodoběji-mor, syfilis, černé neštovice v
Evropě)
Prof. Anna Vašků22
Vznik genové mutace
̶ Pravděpodobnost chyby při replikaci DNA
během buněčného dělení je vysoká. Proto je
nad stavem DNA ustaven přísný dohled, který
zajišťuje stabilitu genomu (supresorové geny,
např. P53).
̶ Porucha supresorových genů (zejména obou
alel) zakládá přirozeně větší riziko vzniku
mutací.
Prof. Anna Vašků23
Nádorový genotyp
➢Současná koncepce modelu
vícestupňového vývoje maligního nádoru
předpokládá, jak bylo řečeno, nejprve
postupné hromadění genetických změn. Ty se
odehrávají v určitých skupinách genů jako
jsou:
✓proto-onkogeny
✓tumor-supresorové geny
✓geny udržující stabilitu genomu
✓modifikující geny.
Prof. Anna Vašků24
MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)
Mutace somatických buněk: kolorektální karcinom
Prof. Anna Vašků25
MR Stratton et al. Nature 458, 719-724 (2009)
Mutace somatických buněk: příklad
Sporadický kolorektální karcinom
Prof. Anna Vašků26
Proto-onkogeny a onkogeny
̶ Proto-onkogeny jsou součástí genomu;
̶ kódují proteiny, které řídí proliferaci, diferenciaci a
přežívání buněk.
̶ 100 různých lidských proto-onkogenů v každé
somatické buňce.
̶ Jsou cílem extra- a intracelulárních cest
transdukce signálů (zejména mitogenních),
kterými se reguluje jejich exprese.
Prof. Anna Vašků27
Proto-onkogeny a onkogeny
̶ Dojde-li k mutaci proto-onkogenů, mění se na onkogeny a
jejich aktivita získává tumorigenní charakter.
̶ K přeměně proto-onkogenu na onkogen stačí alterace pouze
jedné alely genu – tzv. dominantní mutace a gen má
charakter dominantního onkogenu.
̶ Mechanismy aktivace mají různé cesty:
▪(a) virová transdukce (kupř. onkogen src)
▪(b) genová amplifikace (myc, abl),
▪(c) virová inzerce (myc)
▪(d) chromosomální přestavba (myc, abl)
▪(e) mutace (ras)
Prof. Anna Vašků28
Proto-onkogeny a onkogeny
̶ Onkogen může vzniknout mutací genů kódujících
proteiny signálních drah, které realizují přenos růstového
stimulu (růstového faktoru), dojde-li k jeho abnormální
aktivitě. To může být způsobeno tím, že se tvoří v buňce,
kde se normálně netvoří nebo se tvoří v nadměrném
množství anebo v tak pozměněné formě, která se
vymyká normální regulaci.
̶ Takovéto mutované geny jsou tumorigenní, protože
umožňují buňce proliferovat i v nepřítomnosti
extracelulárního signálu.
Prof. Anna Vašků29
Typy onkogenů
Jsou klasifikovány do 5 tříd:
̶ (1) růstové faktory
̶ (2) receptory pro růstové faktory
̶ (3) komponenty intracelulárních signálních drah
̶ (4) jaderné transkripční faktory
̶ (5) proteiny řídící buněčný cyklus
Prof. Anna Vašků30
Onkogeny a antionkogeny, jejich produkty
Prof. Anna Vašků31
GEN Alterace genu TUMOR
Retinoblastoma gen (Rb) Delece
Bodová mutace
Retinoblastomy, osteosarkomy
sarkomy měkkých tkání,
Malobuněčné karcinomy
plic, karcinomy
močového
měchýře a prsu
Cyklin D Translokace chromosomů,
Genová amplifikace
Adenom parathyreoidey,
Některé
lymfomy,Karcinomy
mléčné žlázy,
hlavy a krku, jater
(primární),
jícnu
cdk4 Amplifikace,
Bodová mutace
Glioblastom, sarkom,
melanoblastom
p16INK4a (p15INK4b) Delece, bodová mutace,
metylace
Karcinomy pankreatu,
ezofagu, plic
(malobuněčné),
Glioblastomy, sarkomy,
familiární melanomy
a karcinomy pankreatu
Regulátory buněčného cyklu u maligních nádorů
Prof. Anna Vašků32
Přehled některých recesivních onkogenů
podmiňujících nádorová onemocnění
Symbol Název Nádorové onemocnění
APC Gen adematózní polypózy tlustého
střeva
Kolorektální karcinom
Karcinom pankreatu
Desmoidy
Hepatoblastom
BRCA1 Gen 1 pro familiární
karcinom prsu/vaječníku
Hereditární karcinom prsu/
ovaria
BRCA2 Gen 2 pro familiární
karcinom prsu/vaječníku
Hereditární karcinom prsu/
ovaria
CDH1 Gen pro kadherin 1 Familiární karcinom žaludku
Lobulární karcinom prsu
CDNK2A Gen inhibitoru cyklin-dependentní
kinasy 2A (p16)
Maligní melanom kůže
CYLD Gen familiární cylindromatózy Cylindromy
EP300 Gen vazebného proteinu
300 kD-E1A
Karcinomy kolorektální,
pankreatu, prsuProf. Anna Vašků33
Vliv apoptózy na přežití nádorových
buněk (pro- a anti-apoptózové
faktory)
Zvýšená exprese Bcl-2 inhibuje zánik
buněk apoptózou.
Je to způsobeno vazbou Bcl-2
proteinu na BAX-protein, což
zabrání jeho homodimerizaci, která
podporuje apoptózu.
Prof. Anna Vašků 34
Geny udržující stabilitu genomu
̶ Označují se někdy jako mutatorní geny a
bývají i řazeny k tumor-supresorovým genům.
Produkty těchto genů se uplatňují
v opravných mechanismech poškozené DNA.
̶ Jejich mutace vede ke zvýšené frekvenci
mutovaných onkogenů a tumorsupresorových
genů, někdy až 1000krát.
Prof. Anna Vašků35
Prof. Anna Vašků36
Geny udržující stabilitu genomu
̶ Patří sem geny, jejichž produkty zajišťují
vystřižení poškozeného úseku DNA a umožňují
excizní opravný proces. Jejich recesivní
mutace způsobuje onemocnění zvané
xeroderma pigmentosum a Cockayenův
syndrom, což jsou prekancerózy se zvýšenou
náchylností ke karcinomům kůže navozeným
expozicí na UV-záření.
Prof. Anna Vašků37
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Další skupinou mutatorních genů jsou „mismatch“
opravné geny; kódované proteiny opravují chybné
zařazení baze při replikaci DNA (nikoliv však
komplementární). Projevem mutací těchto genů je
instabilita na nukleotidové úrovni – mikrosatelitová
instabilita. Zárodečné mutace zejména MSH2 a MLH1
genů jsou podkladem hereditárního nepolypózního
kolorektálního karcinomu (HNPCC) .
̶ Mutace genů, jejichž produkty zajišťují „opravné
čtení“, jehož úkolem je identifikace chybných úseků
DNA při replikaci, byly prokázány u karcinomu žaludku
a tlustého střeva. Jedná se především o mutaci genu
pro polymerasu d.
Prof. Anna Vašků38
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Rozpoznání poškozené DNA a aktivace p53
vyžaduje přítomnost ATK. Tento gen kóduje
kinasu, která aktivuje jak CHK2 tak p53 při
poškození DNA. Děti trpící ataxiíteleangiektazií
mají inaktivující mutaci obou
alel.
̶ V klinickém obraze je pak imunodeficience,
mozečkové příznaky a zvýšené riziko vzniku
maligního nádorového onemocnění,
především lymfomů. Buňky těchto pacientů
nemohou aktivovat p53 jako odpověď na
poškození DNA.
Prof. Anna Vašků39
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Jiný syndrom označovaný jako NBS (Nijmegen breakage syndrom) je
způsoben homozygotní inaktivací genu NBS, který se podílí přímo na
opravách poškozené DNA. Do tohoto mechanismu rozpoznávajícího a
opravujícího poškozenou DNA vstupuje též gen BRCA1. Mutace v
jedné alele zárodečných buněk nesoucích tento gen je odpovědná
asi za polovinu případů karcinomu mléčné žlázy s familiárním výskytem.
Při účinku proteinu BRCA1 hraje důležitou funkci jak ATM tak CHK2,
které umožňují jeho fosforylaci, když dojde k poškození DNA. ATM také
fosforyluje kofaktor BRCA1 - CtIP, který reguluje transkripci genu BRCA1.
Defekty DNA-opravného mechanismu přispívají k akumulaci
genetických defektů (viz genová nestabilita navozená genem HNPCC
= gen pro hereditární nepolypózní kolorektální karcinom) podporují
progresi maligně transformovaných buněk.
Prof. Anna Vašků40
Tumor-supresorový protein p53 (TP53)
̶ je jeden z nukleárních proteinů, který má klíčovou úlohu
v regulaci cyklu buněčného dělení při přechodu z G0 do
G1-fáze. Obsahuje domény pro vazbu na specifický úsek
DNA, dále oligomerizující a transkripci aktivující domény.
Váže se jako tetramer na vazebné místo na určitém úseku
DNA a tím aktivuje expresi genů, kódujících faktory
inhibující proliferaci a podporující invazivitu buněk.
̶ Mutanty genu p53 jsou nalézána u řady maligních tumorů.
Pozměněný TP53 ztrácí schopnost vazby na příslušný lokus
DNA, což vede k nedostatečné produkci faktorů
potlačujících nádorový růst. Alterace genu p53 se objevuje
nejen jako somatická mutace, ale též jako mutace
v zárodečných buňkách u některých nádorových
onemocnění s familiárním výskytem (syndrom Li-Fraumeni
Prof. Anna Vašků41
Tumor-supresorový gen p53
➢je klíčovým regulačním faktorem, který monitoruje poškození DNA. I
➢inaktivace p53 bývá jedním z prvních kroků, který vede k maligní transformaci při
vývoji řady nádorových onemocnění.
➢Pacienti s Li-Fraumeniho syndromem mají obvykle jednu mutantní alelu
v zárodečných buňkách a tím i riziko vzniku sarkomů, leukemie a karcinomu mléčné
žlázy. Vzácně pacienti s Li-Fraumeniho syndromem nemají v zárodečných buňkách
tuto mutaci, ale mutaci genu CHK 2, kódující proteinkinasu, která fosforyluje
protein p53, čímž dochází k jeho aktivaci. Tito pacienti však mívají alteraci v jiných
genech – MDM 2 a p14ARF, které regulují expresi p53.
Prof. Anna Vašků42
Tumor-supresorové geny (antionkogeny také recesivní onkogeny)
̶ Kromě mutací v proto-onkogenech mohou vznikat mutační
změny v anti-onkogenech (tumor-supresorové geny).
̶ Na rozdíl od onkogenů jimi kódované proteiny mají
antiproliferační účinek, podporují diferenciaci a apoptózu.
V každé somatické buňce je asi 40 tumor-supresorových genů.
Aby se staly tumorigenními, musí být mutovány obě jejich alely –
proto název recesivní onkogeny. S tím souvisí tzv. dvouzásahová
teorie, kterou po prvé formuloval Knudson, když vysvětloval vznik
vzácného hereditárního retinoblastomu. Na rozdíl od mnohem
častějšího sporadického retinoblastomu, kde se jedná o
náhodné mutace jedné a posléze druhé alely v buňce sítnice,
je u hereditární formy jedna mutovaná alela zděděna, příslušný
jedinec je heterozygot, u něhož se zděděná nádorová
predispozice zatím neprojevuje. Dojde-li však k mutaci/eliminaci
druhé alely, iniciuje se rozvoj nádorového klonu buněk sítnice.
Tomuto procesu se říká ztráta heterozygozity (LOH=loss of
heterozygozity). Prvně objevený tumor-supresorový gen byl
nazván retinoblastomový gen = Rb-gen a jeho produkt RBprotein.
Vyskytuje se v každé buňce, kde reguluje buněčný
cyklus dělení.
Prof. Anna Vašků43
Varianty s různým počtem kopií
̶ Varianty s různým počtem kopií jsou asociovány s různými
fenotypy. Naůř. Trisomie 21 chromosomu způsobuje Downův
syndrom.
̶ Zvýšená exprese genů na chromosomu 21 má za následek
klinicky heterogenní onemocnění z příznaky poruchy
kognitivních funkcí, obličejové dysmorfie, opožděného růstu,
predispozice k nádorům, mikrocefalie a abnormalit srdce a
kostry.
O´Driscoll M: Curr Genomics. 2008 May; 9(3): 137–146
Prof. Anna Vašků44
Modifikující geny
̶ Jde o geny, jejichž mutace může ovlivnit vznik a rozvoj
nádorového procesu.
̶ Jejich produkty mohou pozitivně nebo negativně působit na
průběh kancerogeneze, a to s interindividuální nebo
interfamiliární variabilitou.
̶ Na jejich prozkoumání se teprve čeká; bude umožněno
nejnovějšími technikami molekulové biologie v oblasti
genomiky a proteomiky.
Prof. Anna Vašků45
Epigenetika tumorů
̶ Lidské rakovinné buňky nesou řadu genetických abnormalit
̶ Eepigenetické alterace mohou být odpovědné za začátek
tumorigeneze(Baylin and Jones, 2011; Sandoval and Esteller,
2012; Sharma et al., 2010).
̶ Tumorózní epigenom je charakteristický podstatnými
epigenetickými změnami.
̶ Jedná se především o změny v metylaci DNA a histonů a v
acetylaci histonů.
Prof. Anna Vašků46
DNA methylation
̶ Human malignant tumors are characterized by pervasive changes in the
patterns of DNA methylation. These changes include a globally hypomethylated
tumor cell genome and the focal hypermethylation of numerous 5'-cytosinephosphate-guanine-3'
(CpG) islands, many of them associated with gene
promoters.
̶ Specific DNA methylation changes were linked with tumorigenesis in a causeand-effect
relationship.
̶ Cancer-associated DNA hypomethylation may increase genomic instability.
̶ Promoter hypermethylation events can lead to silencing of genes functioning in
pathways reflecting hallmarks of cancer, including DNA repair, cell cycle
regulation, promotion of apoptosis or control of key tumor-relevant signaling
networks.
̶ Many of the most commonly hypermethylated genes encode developmental
transcription factors, the methylation of which may lead to permanent gene
silencing. Inactivation of such genes will deprive the cells in which the tumor may
initiate from the option of undergoing or maintaining lineage differentiation and
will lock them into a perpetuated stem cell-like state thus providing an additional
window for cell transformation.
Int J Mol Sci. 2018 Apr 12;19(4)Prof. Anna Vašků47
MALIGNÍ TRANSFORMACE BUŇKY
➢Dělení buněk je velmi pečlivě řízeno tak, aby odpovídalo
potřebám celého organismu.
➢V časných fázích života jedince kapacita dělení buněk
převažuje nad jejich zanikáním, v dospělosti je v dynamické
rovnováze, ve stáří začíná převažovat involuce.
➢Některé buňky se však vyhnou kontrole replikace
(neodpovídají na vnější signály, kontrolující jejich
dělení, jsou autonomní), a mění se tak na buňky nádorové.
➢Ty, které si alespoň přibližně zachovávají vzhled i funkci
buněk normálních a především zůstávají stále na místě, kde
vznikly, jsou buňky benigní a jejich proliferace dá vzniknout
benigním tumorům. Buňky, které ztratily většinu vlastností
buněk, od kterých jsou odvozeny a mají snahu pronikat do
svého okolí (invazivita) i na vzdálená místa (metastázy), jsou
buňky maligní a tvoří maligní tumory.
Prof. Anna Vašků48
Nádorové buňky
Nádorové buňky proliferují neomezeně – jsou
„nesmrtelné“. Úplné vysvětlení tohoto
replikačního stárnutí není zatím jasné. Bylo
navrženo několik možných mechanismů:
✓(a) aktivace genů pro stárnutí na
chromosomu 1 a 4,
✓b) alterace nebo ztráta genů pro regulaci
buněčného růstu (c-fos nebo Rb-gen),
✓(c) indukce inhibitorů buněčného růstu,
✓(d) další příčiny, např. zkracování telomer.
Prof. Anna Vašků49
Nádorový fenotyp
➢se vyznačují především pokračujícím dělením.
➢Snižují se u nich požadavky na přítomnost hormonů a
růstových faktorů.
➢Některé transformované buňky produkují vlastní specifické
růstové faktory (autokrinní stimulace).
➢Dochází ke ztrátě schopnosti zastavit růst. U normálních
buněk totiž snížení hladiny isoleucinu, fosfátu, epidermálního
růstového faktoru a dalších látek, které regulují růst, pod
určitou prahovou koncentraci, navodí přesun do klidového
stavu (G0-fáze). Normální buňky začínají růst (dělit se)
pouze, když jejich nutriční požadavky jsou řádně zajištěny.
Nádorovým buňkám tato schopnost zastavit růst jako
reakce na nedostatek živin a růstových faktorů schází;
dokonce pokračují v proliferaci, i když přitom mohou
zahynout.
Prof. Anna Vašků50
Nádorový fenotyp
̶ Transformované buňky vykazují zvýšené vychytávání glukosy pro vyšší afinitu
glukózového transportéru v membráně, podobně jako je tomu normálně pouze
u erytrocytů nebo buněk v mozku. Koreluje to s vysokou glykolytickou aktivitou.
̶ Chybí u nich dále povrchový fibronektin, který mají klidové buňky a který
udržuje jejich tvar.
̶ Změny cytoskeletových elementů (aktinová mikrofilamenta nejsou difuzně
rozptýlena, ale koncentrují se blíže povrchu) jsou příčinou zvýšené mobility
povrchových proteinů.
̶ Nepřiměřená sekrece transformujícího růstového faktoru  a  a dalších
růstových faktorů, které řídí normálně vývoj embryonálních buněk.
̶ Produkují též plasminogenový aktivator, což je proteáza přeměňující
plasminogen na plasmin. Vysoká tvorba plasminu nádorovou buňkou pomáhá
penetraci skrz lamina basalis.
̶ Mikroprostředí nebo stroma, v kterém se nádorové buňky nalézají, mají rovněž
vliv na progresi („teorie semene a půdy"). Bylo prokázáno, že metaloproteinasy
stromální proteinové matrix (MMP 9) hrají významnou úlohu v časných stádiích
vývoje tumoru a při angiogenezi.
U metastáz karcinomu prostaty do kostí se předpokládá jakýsi
„osteomimetický" účinek (chemoatrakce a podpora adherence ke kostnímu
endotelu) a ovlivňování vlastností a chování osteoblastů a osteoklastů.
Prof. Anna Vašků51
Nádorový fenotyp
✓Nádorový fenotyp je charakterizován maligní transformací
buňky, která se projevuje:
- ztrátou kontroly buněčného dělení (alterace buněčného
cyklu, antiapoptóza – „nesmrtelnost“ nádorové buňky,
alterace v transdukci signálů),
- ztrátou kontaktu buňka-buňka,
invazivitou,
- změnami v metabolismu (podpora enzymů anaerobní
glykolýzy a potlačení enzymů oxidace cestou Krebsova
cyklu, „uchvacování“ dusíku nádorovými buňkami, zvýšená
lipolýza, tvorba nádorových antigenů),
- podporou angiogeneze.
✓ Maligně transformované buňky jsou pravděpodobně
odolné vůči stresovým faktorům okolí jako je hypoxie, kyselé
pH, nedostatek glukosy a živin, odloučení od bazální
membrány, které normální buňky ničí.
Prof. Anna Vašků52
Vznik metastáz
➢Při vzniku metastáz hrají důležitou úlohu chemokiny.
➢Úloha chemokinů u nádorového bujení je složitá:
✓podporují vrozenou nebo specifickou protinádorovou imunitu,
✓mohou podporovat nádorový růst a tvorbu metastáz tím, že posilují
proliferaci nádorových buněk, migraci a neovaskularizaci.
✓Chemokiny tvořené nádorovými buňkami mohou působit inhibici
protinádorové imunitní odpovědi, stejně jako autokrinním
mechanismem působí jako růstové faktory.
Prof. Anna Vašků53
Metastatický fenotyp
➢
Dalším rysem maligně transformované buňky je ztráta
závislosti adherovat k podkladu (substrátům).
V buněčné kultuře normální buňky, plovoucí volně
v živném roztoku (gelu), mohou sice metabolizovat
(žít), ale nikoliv se dělit; nádorové buňky ano.
➢Ztráta inhibice motility kontaktem se sousedními
buňkami je další charakteristika nádorových buněk.
Znamená to, že mohou růst jedna přes druhou,
mohou být na sobě i pod sebou a jen zřídka vytvářejí
mezerové spoje (gap junction).
➢Změny na buněčné membráně jako je modifikace
glykolipidů a glykoproteinů (snížení množství sialové
kyseliny vázané na proteiny, redukce gangliosidů). To
sice nemění strukturu transformované buňky, ale
zvyšuje laterální mobilitu povrchových lipidů,
respektive vazbu membránových proteinů na
cytoskelet.
Prof. Anna Vašků54
Metastatický fenotyp
➢ Maligní buňky mají zvýšenou motilitu a schopnost
pronikat do okolí (invazivitu) a po průniku do krevní
cirkulace usadit se a množit na jiném místě (tvořit
metastázy).
➢ K tomu jsou vybaveny schopností produkovat
receptory, aby se mohly zachytit na proteinech
bazální membrány (tvorba adhezních molekul), dále
tvorbou hydrolytických enzymů, které pomohou
rozrušit kolageny, proteoglykany a
glykosaminoglykany bazální laminy a umožnit tak
pronikání do okolí, natrávit stěnu cév, zachytit se
v cirkulaci na shlucích trombocytů a vytvořit tak
nádorové emboly, odolávat účinkům
protinádorového imunitního mechanismu, zachytit se
na stěně cév vzdáleného místa, proniknout do
intersticia tkáně, založit metastázu, proliferovat,
podporovat angiogenezi a případně vytvářet
metastázy metastáz.
➢ To je tzv. metastázový fenotyp.
Prof. Anna Vašků55
Prof. Anna Vašků56
Prof. Anna Vašků57
Apoptóza a tumorigeneze
̶ Růst nádorových buněk je podmíněn nejen
nekontrolovaným buněčným dělením, ale také
snížením jejich opotřebovatelnosti a naopak
zvýšenou schopností přežít.
̶ Většina nádorových buněk, ne-li všechny, získala
rezistenci vůči mechanismům vedoucím k jejich
programovanému zániku – apoptóze. Existují
experimentální důkazy, že narušení signalizace
apoptózy je obecným předpokladem existence a
rozvoje nádorových buněk. Velmi důležitou úlohu
přitom má pravděpodobně onkogenní potenciál
faktoru rodiny Bcl2.
Prof. Anna Vašků58
Apoptóza a tumorigeneze
̶ Bcl2 (B-cell lymphoma 2) gen byl původně objeven jako gen napojený
na imunoglobulinový lokus v průběhu chromosomové translokace u
folikulárního lymfomu. Přitom se též zjistilo, že jeho nadměrná exprese
má spíše než na proliferaci vliv na apoptózu, respektive na její narušení.
Znamená to, že nascentní neoplastické buňky získávají touto
inhibicí programovaného zániku selekční výhodu. Mohou setrvávat
zahnízděny jako ložiska v hostitelské tkáni, zejména v místech, kam se
nedostanou cytokiny a kyslík. Tento únik před apoptózou je pak
podpořen dalšími onkogenními sebezáchovnými mechanismy, které
vedou ke vzniku agresivnějších klonů; defektní apoptóza též usnadňuje
metastázování, protože buňky mohou ignorovat restrikční signály
přicházející z okolí a přežívat odděleně od extracelulární matrix.
Mutace, které favorizují rozvoj nádoru, odvracejí odpověď na
cytotoxickou terapii a vznikají tak refrakterní klony. Úloha Bcl2 (a jeho
homologů – Bcl-xL a Bcl-w) v mechanismu inhibice apoptózy spočívá
pravděpodobně v ochranném účinku na integritu mitochondrií tím, že
brání výstupu cytochromu c do cytoplasmy, což znemožní aktivaci
kaspasové kaskády.
Prof. Anna Vašků59
Prof. Anna Vašků60
Nádory a „nesmrtelnost“ buněk
Nádorová buňka se stává „nesmrtelnou“. Je to
způsobeno zvýšenou aktivitou enzymu telomerasy.
Opakované dělení buněk je omezeno - zkracováním
telomer.
Telomery jsou klíčovým stabilizačním faktorem
terminální části chromosomu a ukotvují je k nukleární
matrix. Telomery mají opakující se sekvenci nukleotidů
TTAGGG. Délka telomer se zmenšuje po
mnohonásobných pasážích (1 buněčný cyklus =
zkrácení o 1 telomeru) a dále v buněčných kulturách
od pacientů v pokročilém věku. Jejich obnovování je
katalyzováno telomerasou; délka telomer koreluje
s obsahem telomeras. Z toho důvodu se
předpokládá, že úbytek DNA od konce chromosomů
zkracováním telomer vede k deleci nezbytných genů,
což má za následek omezení života buněk.Prof. Anna Vašků61
Nádory a „nesmrtelnost“ buněk
Počet telomer slouží jako generační hodiny, které
odpočítávají jednotlivé cykly buněčného dělení a
určují tak životnost buněk a replikační potenciál.
Nádorové buňky mají replikační potenciál vysoký;
umožňují jim to nejméně dva mechanismy, kterými si
udržují dostatečný počet telomer, respektive jejich
obnovování. Nejběžnější (aktivita prokázána u 85-90%
nádorových buněk) je
mechanismus TERT, což je proteinová komponenta
telomerasy; jen malá část nádorových buněk využívá
další mechanismus
tzv. alternativní prodlužování telomer (ALT), které
umožňuje udržování počtu telomer bez účinku
telomerasy.
Prof. Anna Vašků62
Význam angiogeneze v rozvoji nádorového
onemocnění
̶ Angiogeneze má klíčový význam pro růst
nádoru. Rostoucí nádorové ložisko může bez
cévního zásobení dosáhnout velikosti pouze 1
– 2 mm3, kdy přívod kyslíku a živin je možný
ještě difuzí z okolní tkáně. Nádor pro další růst
potřebuje vlastní cévní zásobení. Popud je
tomu dán vzniklou hypoxií nádorových buněk.
Ta navodí genetickou nestálost, dochází ke
vzniku mutací; mutace genu p53, který je
ochráncem genomu, neumožní opravu
chyby v záměně bazí.
Prof. Anna Vašků63
Význam angiogeneze v rozvoji nádorového
onemocnění
Dochází dále k nerovnováze mezi
antiangiogenními a proangiogenními faktory.
Tato změna, kterou se zahájí proces nádorové
angiogeneze, se nazývá „angiogenní switch“.
Objevuje se nový fenotyp nádorových buněk,
vyznačující se potlačením antiangiogenních
faktorů – thrombospondinu – a zvýšenou
tvorbou angiogenních působků. Buňky
nádoru a sousední endoteliální buňky se
v tomto směru vzájemně ovlivňují parakrinní,
ale i autokrinní sekrecí angiogenetických
faktorů.
Prof. Anna Vašků64
Prof. Anna Vašků65
Tumorová neovaskularizace
̶ Novotvorbu cév v nádorovém ložisku předchází
̶ Vazodilace cév v nejbližším okolí navozená především zvýšenou aktivitou NO-syntasy
a tím produkcí NO-radikálů. To také potencuje mitogenní účinek VEGF.
̶ Produkce metaloproteináz rozrušuje bazální membránu, čímž se usnadňuje nejen
migrace endotelových buněk po fibrinových vláknech tvořených stimulací
fibroblastů, ale i migrace tumorových buněk.
̶ Migrující endotelie jsou zdrojem integrinů zajišťujících jejich životnost.
̶ Kapilární morfogenezi podporují ještě další působky – (např. E-selektin). Vaskularizace
nádorového ložiska umožní jeho prokrvení (perfuzi), a tím jeho další růst.
̶ Tyto procesy jsou alespoň částečně koordinovány HIF
Prof. Anna Vašků66
Prof. Anna Vašků67
Tumorová neovaskularizace
➢Čím je angiogeneze intenzivnější, tím je prognóza
nádorového onemocnění nepříznivější; zvyšuje se
riziko metastáz.
➢Stupeň angiogeneze může sloužit jako prognostický
faktor.
➢Nejintenzivnější angiogeneze bývá na okraji
nádorového ložiska, kde lze její intenzitu posoudit
histologicky. Používá se také zviditelnění tzv. horkých
ložisek (hot spots) pomocí monoklonálních protilátek
proti cévním endoteliím nebo proti adhezivním
molekulám (CD31, CD34), event. proti von
Willebrandovu faktoru.
➢Citlivým ukazatelem hustoty kapilárního řečiště je
stanovení akvaporinu-1 (AqP-1); jde o faktor působící
synergicky s VEGF a významně zvyšující cévní
propustnost.
Prof. Anna Vašků68
Copyright ©2005 American Association for Cancer Research
Nyberg, P. et al. Cancer Res 2005;65:3967-3979
Figure 1. The pathologic and physiologic angiogenic balance
Prof. Anna Vašků69
Zánět a tumorigeneze
̶ Epigenetické změny („switches“) hrají důležitou roli v rozvoji
rakoviny.
̶ Většina až dosud objevených „switches“ je indukována
zánětem nebo používá zánětlivé signální cesty.
̶ Chronické infekce a zánět se účastní asi u 25 % všech
maligních tumorů.
̶ V mnoha případech je vyvolávají prozánětlivý faktor (např.
IL-6) dále aktivován v nádorových buňkách k udržení
nového (nádorového) fenotypu.
Prof. Anna Vašků70
Zánět a tumorigeneze
̶ To znamená, že zánětlivá signalizace, která pochází z
imunitních buněk, je rakovinnými buňkami „adoptována“
prostřednictvím epigenetických „switchů“. Protože tyto
„switche“ jsou reverzibilní, mohou se stát cílem
protinádorové léčby.
Prof. Anna Vašků71
Děkuji za pozornost
Prof. Anna Vašků72
Kocour Vasyl II