Alergologické vyšetření Mgr. Julie Štíchová MUDr. Zita Chovancová, Ph.D ÚKIA - FNUSA jaro 2021 Typy přecitlivělosti dle Coombse a Gella 1. I. Typ přecitlivělosti s účastí IgE – atopická 2. II. Typ - reakce s účastí IgG a IgM Podtyp IIa - cytotoxická reakce – potransfuzní reakce, hemolytické onemocnění novorozence Podtyp IIb – blokující a stimulující autoprotilátky (myasthenia gravis, thyreotoxikóza) 3. III. Typ – imunokomplexová reakce – sérová nemoc, SLE 4. IV. Typ – reakce oddálené přecitlivělosti o S převažující účastí Th1 + makrofágy → granulom (TBC, sarkoidóza) o S Th1 s převažujícími (Th17) a CD8 cytotoxickými T-lymfocyty → kontaktní dermatitida 5. Reakce na cizí těleso 6. Septický šok Alergie „Alergická onemocnění jsou způsobena nepřiměřenou reakcí imunitního systému na běžné neškodné antigeny pocházející z vnějšího prostředí.“ Tyto antigeny se nazývají alergeny. Přecitlivělost I. Typu oSenná rýma (sezónní, celoroční) oKonjunktivitida oAstma bronchiale typ I (eozinofilní) oAtopický exém oKopřivka oAnafylaktický šok 1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze alergická reakce Přecitlivělost I. Typu Probíhá ve 3 fázích: 1. fáze senzibilizace •zpracování alergenu, indukce Th2 odpovědi → produkce IgE •Vazba IgE na vysokoafinitní Fcε receptory žírných buněk 2. Časná fáze alergické reakce (minuty po styku) •Aktivace žírných buněk alergenem → degranulace 3. Pozdní fáze alergické reakce (hodiny po styku) •Syntéza metabolitů kyseliny arachidonové – leukotrieny, tromboxany, prostaglandiny 1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze alergická reakce Alergen oExogenní antigen, který u vnímavých jedinců vyvolá patologickou imunitní reakci oNázvosloví alergenů: vychází z latiny, např. kočka domácí: Felis domestica Fel d 1 První 3 písmena jména rodového První písmeno jména druhového Číslice udává pořadí alergenů kočky, na které reaguje nejvíce pacientů alergických na kočku – zde číslice 1 – hlavní alergen kočky lipokalin, na který reaguje 95% pacientů alergických na kočku Alergeny hlavní a vedlejší oV současnosti je známo aminokyselinové složení většiny alergenů oRozlišení 2 skupin: oAlergeny hlavní – látka, na kterou reaguje 50-90 % jedinců přecitlivělých na daný alergen (IgE) např. Fel d1, Bet v 1, Ara h 1, 2, 3 oAlergeny vedlejší – reaguje na ně menšina osob vnímavých na daný alergen (<10 %) Alergeny I. a II. třídy Alergeny I. třídy – alergeny potravinové, senzibilizace orální cestou o Spouští se do pár minut od konzumace potraviny o Klinické příznaky variabilní – od svědění dutiny ústní, rtů (orální alergický syndrom, OAS) až po život ohrožující anafylaxi Alergeny II. Třídy – alergeny inhalační o Často proteiny rostlin s různou enzymatickou aktivitou, např. o Skladovací proteiny – semena, ořechy o Inhibitory enzymů (amyláz, antitrypsin) – brání štěpení škrobů a proteinů v obilných zrnech o Regulační proteiny – podílí se na rozmnožování rostlin o Proteiny související s patogenezí (obrana rostliny – hevaminy – funkce podobná lysozymu) Zkřížená reaktivita oVelká část alergenů si je velmi podobná ve svém aminokyselinovém složení oAlergeny s vyšší než 50% homologií vykazují zkříženou reaktivitu oJe-li homologie vyšší než 80 % → PANALERGENY – obsahují fylogeneticky konzervativní sekvence AK o Způsobují potravinovou alergii asociovanou s pyly o 1. fáze – senzibilizace pacienta inhalačními alergeny o 2. fáze – zkřížená reaktivita mezi proteiny inhalačních alergenů a potravinami → potravinová alergie Originally published December 2015 by Ellen Avery, MS, RD, CNSC Panalergeny Panalergeny - stabilita Termolabilní alergeny: • Profiliny a PR-10 proteiny • V nativním stavu – alergenní potenciál, Povařením narušení 3D struktury molekuly → narušení epitopu → ztráta alergenicity • Projevuje se většinou jen orálním syndromem Termostabilní alergeny: • LTP a zásobní proteiny • Alergenní epitop tvořen blízkými aminokyselinami ve struktuře molekuly • Není ovlivněn varem → molekuly povařením neztrácí alergenicitu • Může hrozit závažná alergická reakce! Pozn. Vzácně se vyšší teplotou může alergenicita potraviny zvýšit → burské oříšky → pražení →změna konformace molekuly → vytvoření alergenního epitopu Panalergeny 1. Profiliny ◦ Cytoplazmatické bílkoviny v rostlinách vážící aktin Podílí se na rozmnožování rostlin ◦ Jsou termolabilní ◦ Hojně obsaženy v pylech trav, plevelů a stromů ◦ Patří sem např. vedlejší alergeny břízy ◦ U pacientů s alergií na profiliny zkřížená alergie: Pyl → Ovoce (hruška, banán, pomeranč) → Zelenina (mrkev, paprika, rajče) → Ořechy Panalergeny 2. PR-10 proteiny (pathogenesis related proteins 10) ◦ Termolabilní ◦ V dužině ovoce ◦ Funkce – ochrana rostliny proti bakteriím a plísním ◦ Proteiny homologní s hlavním alergenem břízy Bet v 1 ◦ U pacientů pozorujeme zkříženou reaktivitu na: Pyl břízy → ovoce (jablko, hruška) → zelenina (celer, mrkev) 3. LTP (lipid transfer proteiny) ◦ Bílkoviny transportující fosfolipidy v buněčných stěnách buněk rostlin ◦ Výskyt hlavně v ovoci (broskve, meruňky), arašídech (Ara h 9) ◦ Termostabilní ◦ Zde není asociace s alergií na pyly Panalergeny 4. Zásobní proteiny o Termostabilní o Viciliny, leguminy, 2S albumin o Vyskytují se hlavně v ořeších, semenech, peckách, arašídech (Ara h), luštěninách o Povaření potraviny nezmění alergenicitu o Hrozí vážná alergická reakce po pozření potraviny CCD determinanty oVětšina alergenů jsou glykoproteiny – obsahují také sacharidové struktury oZkříženě reagující IgE protilátky se mohou tvořit i proti těmto sacharidovým strukturám (Cross-reactive Carbohydrate Determinants) oAnti-CCD protilátky většinou nemají klinický význam oAle často v alergologických testech (kde se používají alergenové extrakty) způsobují falešnou pozitivitu oPopsány byly např. u hrušky, mrkve, celeru, měkkýšů atd. CCD determinanty oJestli bude mít vazba IgE se sacharidovou složkou klinický význam závisí na tom, zda se IgE váže na: o 1 epitop alergenu (monovalentní glykoalergen) → nedochází ke klinickým projevům o Více epitopů alergenu (polyvalentní glykoalergen) → dochází ke klinickým projevům → nutno určit přesný alergenový epitop CCD determinanty oPokud existuje rozpor mezi klinikou pacienta a výsledky stanovení specifických IgE protilátek, je třeba zvážit možnou falešnou pozitivitu testů způsobenou anti-CCD IgE oModerní testy používají postupy, které anti-CCD IgE blokují – přídavek blokátoru (např. ALEX) Alergeny pro laboratorní diagnostiku Standardizované alergenové extrakty o Purifikace z přírodních zdrojů o Výrobce stanoví obsah hlavních alergenů kvantitativně (ELISA) o Množství a aktivita alergenu se srovná se standardem o Kromě alergenu obsahují extrakty také nealergenní složky (proteiny, sacharidy…) o Ty mohou vést k falešné pozitivitě testů Rekombinantní alergeny o Ze zdroje alergenu izolována RNA o Přepis do DNA o Vložení DNA bakteriofága o Hostitelem bakteriofága E.Coli o E.Coli produkuje alergen v čisté formě o Rekombinantní alergeny umožňují komponentovou diagnostiku Komponentová diagnostika oUrčí u pacienta konkrétní molekulu, která vyvolává senzibilizaci oNapř. třídy panalergenů – profiliny, PR-10, LTP, zásobní proteiny → oDokážeme rozlišit, zda u pacienta po podání určité potraviny hrozí závažná reakce → význam pro alergenovou imunoterapii (složení alergenů, zda má význam je pacientovi podávat) oDále např. reakce na včelu a vosu o U klasického stanovení specifického IgE na včelu a vosu bývá často přítomna zkřížená reaktivita – pacient falešně pozitivní na obojí o Komponentová diagnostika dokáže odlišit, zda je pacient opravdu alergický na včelu nebo vosu Včela nebo vosa? 21-letá studentka medicíny byla vyšetřena 3 roky po anafylaktické reakci … způsobené bodnutím neznámým hmyzem … Jednalo se pravděpodobně o … … vosu… včelu IgG 9,800 g/l (7,510 – 15,600) IgA 1,180 g/l (0,820 – 4,530) IgM 0,763 g/l (0,460 – 3,040) IgE 594 U/ml (0 – 100) ANA negativní Tryptáza 3.07 g/l (0.00 – 13.50) ALERGENOVÉ EXTRAKTY sIgE A. mellifera 4.30 kU/l (class III) V. spp. 15.20 kU/l (class III) P. spp. 5.34 kU/l (class III) V. crabro 15.10 kU/l (class III) Test aktivace basofilů CD63 CD203c Negativní kontrola 1 % 1 % Pozitivní kontrola 60 % 55 % A. mellifera 24 % 25 % V. spp. 83 % 85 % ZKŘÍŽENÁ REAKTIVITA nebo DVOJÍ POZITIVITA … … THAT is the question! … THAT is the question! rApi m 1: 0.01 kU/l (třída 0) rVes v 1: 1.28 kU/l (třída II) rVes v 5: 12.8 kU/l (třída III) REKOMBINANTNÍ ALERGENY Laboratorní diagnostika zahrnující kombinaci vyšetření specifických IgE protilátek proti alergenovým extraktům a rekombinantním alergenům pomohla postavit správně diagnózu u naší pacientky. Pacientka potom podstoupila alergenovou imunoterapii proti vose. Vyšetřování koncentrace specifických IgE protilátek proti alergenovým extraktům není někdy v diagnostice alergií dostačující. Buněčné testy v alergologii 1. Stanovení počtu eozinofilů (I.typ přecitlivělosti) 2. Test aktivace bazofilů (BAT) (I.typ přecitlivělosti) 3. Test proliferace lymfocytů na pozdní alergickou reakci (IV. typ přecitlivělosti) Stanovení počtu eozinofilů oPrincip – hematologický analyzátor o Hydrodynamická fokusace vzorku o Impedanční vlastnosti buněk - počet o Průchod světelným paprskem – vlastnosti o velikosti a granularitě oKrevní diferenciál dospělého člověka: o Lymfocyty: 20-45 % o Monocyty 2-12 % o Neutrofily 50-70 % o Eosinofily 1-3 % o Bazofily < 1 % oZvýšení eozinofilů – alergická, parazitární onemocnění… oPoužití – monitoring eozinofilního astmatu oPři znalosti absolutního počtu leukocytů lze absolutní počty buněk dopočítat o Leukocyty 4-10*109/l Jak se liší zastoupení lymfocytů u dětí? Test aktivace bazofilů (BAT) oBazofily v neaktivovaném stavu exprimují v nízké míře znak CD203c, jsou CD63 negativní oPři aktivaci a degranulaci se zvyšují znaky CD63 a CD203c → měření pomocí průtokové cytometrie oProvedení testu – prestimulace plné krve s IL-3 → následuje přídavek alergenu → inkubace → promytí → značení protilátkami (anti-CD63, anti-CD203c, anti-IgE) → promytí → lýza erytrocytů BAT – alergeny oVětšinou se na BAT používají alergeny z prick testů oU podezření na lékové alergie doktor spolu s krví zasílá do laboratoře podezřelý lék → v laboratoři rozdrcen, přefiltrován a naředěn o Pozn. v minulosti se požívaly k provedení BAT i potraviny, protože neexistovaly standardizované alergenové extrakty → v laboratoři se potravina rozdrtila, naředila a výsledný roztok se přefiltroval oU každého BAT testu se požívá ředění alergenu v pořadí 10krát, 100krát a 1000krát → proč? oNěkdy může být koncentrace alergenu natolik velká, že bazofily se výrazně naaktivují a během inkubace podlehnou nekróze → výsledkem měření je falešná negativita oProto se může stát, že např. při ředění 10krát je reakce negativní, ale pozitivní v ředění 100krát! BAT funkční test umožňující vyšetření aktivace bazofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro Na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) CD203c Založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění. Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je zprostředkovaná protilátkami IgE. IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace. Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c na aktivovaných bazofilech. Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno Vyšetření periferní heparinizované krve, stimulace alergenem při 37 °C ve vodní lázni, zastavení reakce, lýza erytrocytů a měření na průtokovém cytometru BAT – gatovací strategie (Pacient alergický na kočku – alergen Fel d) 1. Na Forward scatteru a Side scatteru gatovány lymfocyty 2. Z lymfocytů gatovány pouze IgE pozitivní buňky - bazofily 3. Bazofily – sledujeme CD63 a CD203c Negativní kontrola Bazofily jsou CD63 neg. Pozitivní pacient – vidíme populaci CD63 pozitivních bazofilů o Při vyšetření BAT u pacienta je součástí testu vždy: o Pozitivní kontrola (stimulace fMLP) o Negativní kontrola (PBS) o U BAT totiž neexistují konkrétní referenční meze https://portal.med.muni.cz/clanek-695-vysetrovaci-metody-v-imunologicke-a-alergologicke-laboratori.html