Alergologické vyšetření II
Mgr. Julie Štíchová
MUDr. Zita Chovancová, Ph.D
5. Alergologické testy in vitro - přehled
Serologické testy
1. Nefelometrie – stanovení celkového IgE
2. Immulite 2000 – stanovení specifického IgE, eozinofilní
kationický protein (ECP)
3. AlaSTAT – stanovení specifického IgE
4. ImmunoCap Phadia – stanovení tryptázy a vybraných
rekombinantních alergenů
5. MADx Allergy Explorer, Immunocap ISAC – multiplex
metody - stanovení až 280 alergenů
In vivo testy:
1. Prick testy – inhalační, potravní a zvířecí alergeny
2. Intradermální testy – blanokřídlý hmyz, léky
3. Epikutánní testy – kontaktní alergie (IV. Typ)
Buněčné testy
1. Stanovení počtu eozinofilů
2. Test aktivace bazofilů (BAT)
Alergologické vyšetření
1. Anamnéza
◦ Rodinná – výskyt alergií u členů rodiny
◦ Osobní
◦ Výskyt klinických obtíží po kontaktu s určitými alergeny
◦ Inhalační alergeny, potravinové, léky, hmyz, údaje o domácím a pracovním prostředí, zvířatech
◦ Jaké klinické příznaky, jak rychle se vyvíjí, jaká závažnost, jak dlouho trvají, v jakých periodách se
opakují
◦ Vyvíjí se vyrážka na kůži po kontaktu se šperky, pásky apod.?
Snaha vytipovat potenciální alergeny, na které
bude provedeno vyšetření
Alergologické vyšetření
2. Odběr krve
oPro zhodnocení celkového zdravotního stavu pacienta se odebírá krev kromě alergologických
parametrů také na:
o Biochemie – základní biochemické parametry (glukóza, triacylglyceroly, cholesterol, hormony štítné žlázy…)
o Hematologie – krevní obraz
o Imunologie – základní screening autoprotilátek (ANA), komplement, subpopulace lymfocytů
oPacient nemusí trpět pouze alergickým onemocněním ale i dalšími komorbiditami …
3. Alergologické vyšetření - in vivo testy
Lze je provést přímo v ordinaci alergologa
1. Prick testy – inhalační, potravní a zvířecí alergeny
2. Intradermální testy – blanokřídlý hmyz, léky
3. Epikutánní testy – kontaktní alergie (IV. Typ)
1. Prick testy
o Preanalytická fáze – pacient cca týden před provedením testu vyloučí léčbu
antihistaminiky/kortikoidy
o Aplikace standardizovaných alergenů na volární stranu předloktí
o Součástí je také negativní kontrola (fyziol.roztok) a pozitivní kontrola (histamin)
o Kontraindikace: nespolupracující pacient, pacient co má kožní onemocnění
v místě provedení testu a lidé, kterým není možné vysadit léčbu
1. Aplikace kapky alergenu
2. Narušení kůže plastovým kopíčkem 3. Inkubace cca 20 min
4. Odečet velikost pupene
Aplikace alergenu do podkoží injekčně
Intradermální test
oIV. Typ přecitlivělosti
oAlergie na léky, jedy blanokřídlého hmyzu
oAplikace alergenu do podkoží pomocí injekční jehly
oNevýhoda – výsledky testu závisí na hloubce vpichu – závislé na zkušenosti
zdravotní sestry (příliš hluboký vpich – může být falešná negativita testu)
oExistuje nízké riziko vážné reakce (léky jsou ale výrazně
naředěny, proto je riziko závažné reakce sníženo na minimum)
oPodráždění kůže může přetrvávat až 36h po provedení testu
Epikutánní test
oDiagnostika kontaktní alergie (IV.typ) – nízkomolekulární chemické látky
oPrincip – aplikace podezřelých látek ve formě náplasti na zdravou kůži zad →
odečet za 48, 72 a 96h
o Pozitivní výsledek – exém v místě kontaktu
oKontraindikace:
o Kožní onemocnění v místě aplikace testů (záda)
o Gravidita
o Příliš opálená kůže
o Imunosupresivní/imunostimulační terapie
oNelze testovat látky toxické a s extrémními hodnotami pH
https://www.dermatologiepropraxi.cz/pdfs/der/2011/03/14.pdf
4. Vyšetření dýchacích cest
oMěření FeNO (frakční expirační NO) – měření oxidu dusnatého ve vydechovaném vzduchu
o Při eozinofilním zánětu dýchacích cest se ve vyšší míře tvoří NO
o Koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu koreluje se závažností eozinofilního zánětu
o Výsledky se vyjadřují v ppb (parts per bilion)
oSpirometrie
o Vyšetření funkčních parametrů dýchacích cest, diagnostika obstrukce
oBronchomotorické testy
o Bronchodilatační test – podání bronchodilatancia → sleduje se reverzibilita obstrukce dýchacích cest
(reverzibilita ukazuje na astma)
o Bronchokonstrikční test – podání metacholinu (nebo fyzická zátěž) → sleduje se, zda jsou průdušky
schopny konstrikce pod vlivem vyvolávající látky (svědčí pro zánět průduškové stěny)
Immulite 2000 – specifické IgE
•Enzymově zesílená chemiluminiscence
•Pevná fáze – 1 velká plastová kulička potažená biotinem
•Přidáme antigen konjugovaný se streptavidinem → naváže se na kuličku
•Přidáme pacientovo sérum → vazba alergen specifického IgE
•V dalším kroku – přidáme anti-IgE protilátku značenou alkalickou fosfatázou → po přídavku
dioxetan-adamantyl-fosfátu odštěpí enzym fosfát → vzniká nestabilní aniont, který při rozkladu
uvolní emisi fotonů – zaznamená se počet záblesků
Celkové IgE hranice pozitivity:
100 IU/ml
AlaSTAT
oJamky destičky potaženy biotinem
oDo jamek se přidá alergen značený biotinem + pacientovo sérum
oProtilátky IgE reagují v tekutém prostředí s alergenem
oPřídavek avidinu → vazba komplexu alergen-IgE na stěnu jamky
oPromytí
oPřídavek ani-IgE značeného enzymem → inkubace → promytí
oPřídavek substrátu → přeměna na barevný produkt
oKolorimetrická detekce
Celkové a specifické IgE
oCelkové IgE - norma 0-100 IU/ml
oCelková koncentrace IgE koreluje s přítomností alergického onemocnění (většinou)
o Specifita 90 %, ale senzitivita jen 30-40 %
oPouhé stanovení celkového IgE k určení přítomnosti alergie nestačí,
protože:
o Vysoké IgE také u jiných diagnóz, např. nosní polypóza, Wiskot-Aldrich
syndrom, hyper IgE syndrom, AIDS, parazitární onemocnění
o Nízké IgE - 60 -70 % alergiků nemusí mít celkové IgE zvýšeno nad 100 UI/ml
senná
rýma
celoroční
rýma
astma atopický
ekzém
Immulite 2000 – stanovení ECP
oPrincip stanovení stejný jako stanovení specifického IgE
oNormální hladina v séru < 13,5 ng/ml
oEozinofilní kationický protein je produkt aktivovaných eozinofilů
oJeho hladina koreluje se závažností eozinofilního zánětu
oPoužívá se k monitorování průběhu a léčby
eozinofilního alergického astmatu
ImunoCap – fluorimetrie
Pevná fáze – kepíky, které obsahují aktivovanou celulózu – velká plocha
Na celulózu navázán alergen → na něj vazba pacientova IgE
V dalším kroku přídavek anti-IgE protilátky značené β-D-galaktosidázou
Přídavek substrátu → Methylumbelliferyl- β-D-galaktosid → enzym odštěpí β-D-galaktosid a
vznikne methylumberiferon → excitace světlem → emise fluorescenčního záření (na rozdíl od
Immulitu zde potřebujeme žárovku (Hg-Výbojka) k excitaci methylumbeliferonu!)
• Stanovení tryptázy
• Stanovení rekombinantních
alergenů
ImmunoCap - Tryptáza
oUvolňuje se po aktivaci žírných buněk alergenem → marker anafylaktické reakce
o Diferenciální diagnostika anafylaktických reakcí polékových, po bodnutí hmyzem
o Také stanovení post mortem – určení anafylaktické reakce jako příčiny úmrtí
oTryptázu tvoří také mastocyty → výrazné zvýšení u systémových mastocytóz
oVýhoda tryptázy (např. v porovnání s histaminem):
o Není na rozdíl od histaminu uvolňována bazofily v krvi – vyloučena falešná pozitivita in vitro
o Je v krvi stabilní kolem 48 h → možno stanovit post mortem
o Při uchování vzorku při chladničkové teplotě – stabilní až týden
oNorma – do 13,5 ug/l
ImmunoCap - rekombinantní alergeny (RAL)
oVybrané rekombinantní alergeny:
o Bříza – Bet v 1, Bet v 2
o Bojínek – Phi p 1, Phi p 5b
o Vosík – Pol d 5
o Vosa – Ves v 5
o Včela
oKoncentrace specifického IgE vůči komponentám členěna do 6 tříd: 0-6
o Nultá třída – koncentrace <0,35 IU/ml = negativní
o Čím vyšší třída, tím má pacient více specifického IgE vůči dané komponentě
oÚčel stanovení: Detekce konkrétní komponenty, na kterou se váže specifické IgE – vyloučení
zkřížené reaktivity, indikace pacientů pro alergenovou imunoterapii
sIgE
A. mellifera 4.30 kU/l (class III)
V. spp. 15.20 kU/l (class III)
P. spp. 5.34 kU/l (class III)
V. crabro 15.10 kU/l (class III)
ALEX (allergy explorer)
•Čipová technologie – multiplex metoda
•Stanovení až 280 alergenů v jediném kroku (čip obsahuje jak alergenové
extrakty, tak vybrané rekombinantní alergeny)
•Klinik v ordinaci indikuje pacienty pro vyšetření ALEX pouze na základě klinických projevů –
pacienti, kteří udávají mnohočetné alergie (inhalační, potravinové)
•Hodí se pro pacienty kde je podezření na zkřížené alergie
•Hladina celkového IgE nehraje při indikaci roli
•Hodnocení výsledků probíhá pomocí počítače – speciální čtečka čipů, software
•Výsledky – kUA/l
•Video – pracovní postup:
https://www.youtube.com/watch?v=klET1jLVmp4&ab_channel=DasitGroupS.p.A.
1. Na čipu jsou ve formě spotu imobilizovány nanočástice potažené
alergenem - je dána přesná poloha spotu na čipu pro konkrétní alergen
2. Přídavek diluentu
a 100ul pacientova séra
nanočástice
3. Vazba IgE na alergen
4. Přídavek anti-IgE značené enzymem
→ promytí → přídavek substrátu
4. Přeměna substrátu na barevný
produkt → tvorba barevného spotu na
čipu
5. Zastavení reakce stop činidlem,
usušení čipu → odečet
ALEX – čipy obsahují až 280
alergenů
ALEX (allergy explorer)
ImmunoCap ISAC
oTaktéž biočipová technologie
oNa rozdíl od ALEXe se zde používá k detekci anti-IgE značená fluorochromem
oVýsledkem tedy není barevná reakce, ale odečítá se fluorescence pomocí speciálního laserového snímače