Klasické serologické metody
aglutinace / precipitace, RID, nefelometrie / turbidimetrie
Vyšetření funkce komplementu
Peter Slanina (peter.slanina@fnusa.cz)
Ústav klinické imunologie a alergologie
FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Laboratórne vyšetrenie IN VITRO
• Preanalytická fáza
- odber, príprava, spracovanie vzorky pred zahájením laboratórneho vyšetrenia
- skladovanie, transport
• Analytická fáza
- kalibrácia a justovanie zariadení (analýza kontrol- IKK, EHK)
- prevedenie lab. vyšetrenia + kontrol
- spracovanie výsledkov, LIS
• Postanalytická fáza
- skladovanie, likvidácia materiálu
- preskúmanie výsledkov, uvoľnenie, uchovávanie LIS - NIS
Rozdelenie imunologických laboratórnych metód
serologické (humorálne)- detekcia antigénov a protilátok,
Metódy preukázanie tvorby protilátok proti infekčnému agens
bunečné- počty a funkcie jednotlivých typov leukocytov
Serologické metódy
1. Klasické serologické metódy
- Aglutinácia (priama / nepriama)
- Precipitácia (v kvapaline, v géle)
2. Imunochemické metódy s následnou detekciou
- Imunofluroscencie (priama / nepriama)
- Imunoanalýza (EIA-ELISA, RIA, FIA, LIA)
- Imunoblot, imunodot
3. Metódy založené na efektorovom účinku protilátok (využívané v
klinickej mikrobiológii)
- Komplement fixačné reakcie
- Inhibičné a neutralizačné testy
Aglutinácia vs Precipitácia
Aglutinácia (zhlukovanie)
Ag + Ab → Ag-Ab
aglutinogén aglutinin aglutinát
makromolekulárny
korpuskulárny
nerozpustný
Protilátky namierené proti epitopom antigénnych častíc vytvárajú medzi korpuskulami mostíky, ktoré vedú k vzniku
zhlukov (aglutinátov)
Precipitácia (zrážanie)
Ag + Ab → Ag-Ab
precipitogén precipitin precipitát
nízkomolekulárny
nekorpuskulárny
rozpustný
Reakcia medzi solubilným antigénom a protilátkou s následným vznikom precipitátu
Aglutinácia
1. Priama
- korpuskulárny Ag prirodzene nesie cieľové epitopy
- identifikácia baktérií, hemaglutinácia
2. Nepriama
- rozpustný antigén naviazaný na povrchu vhodných
makromolekulárnych častíc (latex)
- stanovenie RF, ASLO Krvné skupiny
Systém AB0
Detekce protilátek
vázaných na erytrocyty in
vivo
Detekce volných protilátek
proti erytrocytům v séru
Hodnotenie aglutinácie
• KVALITATÍVNE
- aglutinácii dochádza / nedochádza (pozitívna / negatívna)
• KVANTITATÍVNE
- stanovenie najvyššieho riedenia séra, kedy je ešte badateľná aglutinácia
- titer (titr) = prevrátená hodnota riedenia séra
(riedenie 1:32 → titer 32)
Revmatoidní artritida
• Systémové autoimunitní onemocnění – poškození kloubů
• Příčiny – genetika + faktory vnějšího prostředí
• Patologická citrulinace proteinů – imunitní systém rozpozná imunodominantní
epitopy → imunitní reakce, produkce autoprotilátek
• V kloubu se tvoří zánětlivá tkáň – pannus – narušení chrupavky
• Osteoklasty – degradace kosti
• muži : ženy 1 : 2-3
• 1 % populace
• Stanovení: revmatodní faktor (RF) + protilátky
proti citrulinovaným peptidům (anti-CCP)
Autor obrázku: Osmosis, video zde: https://www.youtube.com/watch?v=EB5zxdAQGzU&ab_channel=Osmosis
Latex-fixačný test
• Reumatoidný faktor (RF)
- autoprotilátka namierená proti Fc části IgG molekuly
- prítomný asi u 80% pacientov s reumatoidnou artritídou
- pozitívny je tiež u asi 5-10% chorých s inými systémovými autoimunitnými
ochoreniami, autoimunitné hepatitídy, SLE, Sjogrenův syndrom
- môže byť pozitívny i u zdravých osôb
- diagnosticky najdôležitejší je RF v triede IgM (rutinně se měří nefelometricky!)
Princíp testu aglutinace na nosičích:
Úkol č. 1
Stanovení RF pomocí latexové aglutinace
Streptokoková infekce a pozdní následky
• Streptokoky skupiny C mají M protein - jeho struktura je podobná strukturám
srdce nebo ledvin – molekulární mimikry
• Protilátky proti M proteinu zkříženě reagují s těmito strukturami →
• Poststreptokoková sterilní karditida, glomerulonefritida
• Během streptokokové infekce se také tvoří
ASLO – anti-streptolyzin O antibodies
• Stanovuje se při podezření na poststreptokokové
sterilní následky
Stanovenie ASLO (ASO) nepriamou aglutináciou
• ASLO- anti streptolysin O antibodies
• Slúži k stanoveniu protilátok v sére proti Streptolysinu O (exotoxín bakterií z rodu
Streptococcus)
• Princíp testu:
- Stejný jako u RF – latexová aglutinace (na latexových částicích vázán
streptolyzin O)
Serologické metódy
Reakcia antigénu (Ag) s protilátkou (Ab) = imunokomplex:
1. Primárna – rýchla, nepozorovateľná voľným okom
fáza – tvorba imunokomplexov Ag + Ab
– vznik väzby jednotlivých epitopov s väzbovými miestami protilátok
2. Sekundárna – pomalá, pozorovateľná voľným okom
fáza – uplatňuje sa multivalencia Ag a polyvalencia Ab
– vznik priestorového komplexu
Pokiaľ nedochádza k sekundárnej fáze reakcie, je nutné imunokomplexy vzniknuté v
primárnej fáze vizualizovať – imunochemické metódy
http://www.wikiskripta.eu
Precipitácia
1. V géle
- Jednoduchá RID
- Dvojitá RID
2. V tekutom prostredí
- Nefelometria
- Turbidimetria
Precipitácia v géle – jednoduchá RID
• Prostředí – agarózový gel
• Princip
1. Do gelu je při teplotě těsně před tuhnutím přidána protilátka
proti hledanému antigenu (např. chceme stanovit C5 →
v gelu protilátka proti C5)
2. Ztuhnutí gelu
3. Vykrojení jamek do gelu
4. Pipetujeme kalibrátory a vzorky
5. Antigen difunfuje do gelu – v místě ekvimolární koncentrace
Ag-Ab se vytvoří kruhový precipitát
6. Průměr a plocha kruhu je úměrná množství antigenu ve
vzorku
Radiálna imunodifúzia
• Pomocou RID je možné stanoviť koncentrácie mnohých bielkovinových súčastí
séra
• Metodika sa v minulosti používala pri meraní hladín celkového IgG, IgA, IgM,
zložiek komplementu alebo rôznych proteínov akútnej fáze- väčšina týchto
vyšetrení je dnes automatizovaná a prevádzaná na princípe nefelometrie
• Stanovenie C2 a C5 zložiek komplementu!
• Jednoduchá RID
- koncentračný gradient jedného z reaktantov
(väčšinou Ag)
- druhý reaktant (väčšinou Ab)- rovnomerne
rozptýlený v štruktúre gélu
- výsledkom sú ostro ohraničené krúžka precipitátu
- plocha prstenca = úmerná koncentrácii
vyšetrovaného Ag
- podľa konc. štandardu – kalibračná krivka
Kalibračná krivka
• Charakterizuje vzťah medzi koncentráciou vyšetrovanej látky a
priemerom kruhov na príslušnej vyšetrovacej doske
• Dvojitá RID (podľa Ouchterlonyho)
- sledujeme antigennú príbuznosť antigénov
- Prostředí – čistý gel – do jamek pipetujeme antigen i
protilátku
- gradient vytvára ako Ag, tak Ab a dochádza k
protismernej difúzii oboch reaktantov (radiálne)
- v zóne ekvivalencie – precipitačná línia, ktorá ukazuje na
pozitivitu reakcie
- hodnotenie: kvalitatívne
Precipitácia- v tekutom prostredí
• Využíva sa efekt, že pri reakcii Ag-Ab vzniká zákal- precipitát, ktorého intenzita je
pri konštantnom množstve pridanej protilátky úmerná pridanej koncentrácii
vyšetrovaného antigénu
• Meranie intenzity zákalu: nefelometria, turbidimetria – Tyndalův jev
• Obe metodiky umožňujú kvantitatívne stanovenie obsahu proteínov vo vzorke
odčítaním z kalibračnej krivky
Precipitácia v tekutom prostredí
Nefelometria
- vhodná pre nižšie koncentrácie
viditeľné svetlo
detektor je v smere kolmom na
vstupujúci lúč
Meria množstvo svetla
rozptýleného pri prechode lúča
(množstvo svetla odrazeného od
vznikajúcich komplexov)
Turbidimetria
- Vhodná pre koncentrovanejšie roztoky
viditeľné svetlo
detektor je v ose lúča
Meria množstvo prechádzajúceho
svetla
(úbytok intenzity svetla, ktoré prešlo
roztokom v kyvete)
nefelometria je 5-10x citlivejšia
a nákladnejšia ako turbidimetria
Nefelometria a turbidimetria
• Reakcie založené na meraní množstva imunitných komplexov vytvorených
interakciou špecifických protilátok s antigénom
• Meranie prebieha v tekutom prostredí v meracej kyvete (pufr, látka urýchľujúca
reakciu, Ag, Ab)
• Množstvo vytvorených komplexov je úmerné koncentrácii Ag
Dynamika precipitačních reakcí
Imunoprecipitační křivka (Heidelberger-Kendallova)
1) Oblast nadbytku protilátky – měření přístrojem
2) Zóna ekvivalence
3) Oblast nadbytku antigenu – protilátka spotřebována,
imunokomplexy se rozpadají → Hook efekt
Závěr: Pro 2 rozdílné koncentrace antigenu lze získat jednu
hodnotu absorbance → riziko falešně nízkých hodnot
Přístroje mají různé postupy, jak Hook efekt rozpoznat
Při nefelometrickém i turbidimetrickém měření musí zůstat
zachována podmínka nadbytku protilátky v reakční směsi
Měření zákalu je relevantní pouze ve
vzestupné části křivky – probíhá kinetickým
proměřováním vzorku s intervalem 5 vteřin
Po proběhlé reakci přístroj do reakční směsi přidá antigen:
1) Pokud absorbance odpět stoupne (3) měření proběhlo v
oblasti nadbytku protilátky (tvoří se nové
imunokomplexy) a pro výpočet koncentrace analytu tedy
může být použita naměřená hodnota absorbance
původního ředění
2) Pokud po přídavku antigenu k nárůstu signálu nedojde
(4) → protilátka byla spotřebována (příliš mnoho
antigenu) → analýza musí být opakována znovu s vyšším
ředěním vzorku
Beckman Coulter IMMAGE 800
• Stanovenie koncentrácie:
• I:
- imunoglobulíny: IgG, IgA, IgM (g/l)
- proteíny akútnej fáze: CRP (mg/l)
- (RF+ASLO)
• II:
- Podtřídy Ig
- zložky komplementu: C3, C4, C1q
- proteíny akútnej fáze: A1AT (alfa 1 antitrypsin),
OROSO (orosomukoid), A2M (alfa 2 makroglobulin),
CPL (ceruloplasmin), TRF (transferin), PREA
(prealbumin)
www.beckmancoulter.com/en/products/protein-
chemistry/immage-800
Siemens BNII
• Stanovenie koncentrácie:
- imunoglobulíny: IgE (IU/ml), IgD,
IgA1, IgA2, IgAp (nízke
koncentrácie)
- zložky komplementu: C1 inhibitor
www.healthcare.siemens.com/plasma-protein/systems/bn-ii-system
Vyšetření cirkulujících imunokomplexů – CIK
turbidimetrie
• Při onemocněních (např. chřipka) se tvoří imunokomplexy – bolesti svalů a kloubů
• Pouze přechodné obtíže –fyziologické → odstranění ve slezině (makrofágy)
• Autoimunitní onemocnění – tvorba imunokomplexů → ukládání do tkání → zánět
• V určité fázi onemocnění lze imunokomplexy detekovat v krvi – CIK-PEG
(precipitace imunokomplexů polyethylenglykolem) → zákal
• Měření turbidity – úbytku prošlého světla
• Přístroj – ELISA reader (spektrofotometr)
CIK –PEG – pouze orientační vyšetření
• Nevýhoda:
• Detekují se jakékoli imunokomplexy – pozitivní u jakékoli akutní fáze
infekce kde se tvoří Ab-Ag → přítomnost imunokomplexů nemusí pro
pacienta znamenat zdravotní problém
• Negativní výsledek neznamená, že je pacient zdravý → imunokomplexy už
se uložily do tkání a v krvi nejsou
• Typicky pozitivní u imunokomplexových systémových autoimunit – RA, SLE
• Malá výpovědní hodnota
• Pozn. alternativou je stanovení vazby imunokomplexů na C1q – ELISA – stanoví se pouze imunokomplexy které mají
schopnost aktivovat komplement
Denná prax na analyzátore
➢Provozní denník
➢Údržba analyzátorov:
- denná/týždenná/mesačná
➢Kalibrácie:
- 1 krát do mesiaca / pri zmene šarže reagencií
- kalibračná krivka
➢Kontroly IKK:
- každý deň, pred zahájením merania pacientskych vzoriek
- viazané na metódu, jedno-/viac-úrovňové
- referenčné medze
➢Kontroly EHK (SEKK- systém externí kontroly kvality):
- podľa časového plánu
- zasielané z externého laboratória (nie je známa výsledná koncentrácia)
- prevedie sa meranie → Výsledky sa vo forme protokolu odošlú späť organizátorovi
- organizátor porovná výsledky meraní jednotlivých laboratórií a spätne ich informuje o
úspešnosti
- medzi-laboratórne porovnávacie skúšky
Lewey-Jenningsův diagram – sledování kontrol v čase
Westgardova pravidla – detekce chyb v
analytické proceduře (rozhoduje o schválení či
zamítnutí analytické série)
Priebeh vzorky
➢Sérum = odběr srážlivé krve
➢Alikvotácia vzorky
➢Vytvorenie pracovného listu pre jednotlivé analyzátory = zoznam vzoriek
➢Analyzátor = vzorka + špecifické antisérum + pufr (stabilizácia a urýchlenie
reakcie)
➢Analyzátor prepojený s LIS (laboratórny informačný systém)= získa informácie o
potrebnom meraní + výsledok automaticky odošle
Interpretácia výsledkov
• Výsledky sú pred vydaním viacnásobne kontrolované
• Pozor:
➢ falošná pozitivita (malá špecificita testu)
➢ falošná negativita (malá senzitivita testu)
• Hladina imunoglobulínov IgG, IgA, IgM (g/l):
↑ - zápalové procesy infekčného pôvodu
- jedna trieda = myelom; monoklonálna gamapatia
- zvyšovanie s vekom
↓ - poruchy tvorby = imunodeficity
- lymfomy, leukémie, myelomy, následkom liečby, nefropatie
Interpretácia výsledkov
• Hladina IgE (IU/ml):
↑ - alergické stavy prvého typu precitlivenosti
- parazitárne choroby
- autoimunity (Hyper IgE sy.)
- imunodeficiencie (Omenův sy., Wiskot-Aldrichův sy.)
• Vyšetrenie komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH)
↑ - zápalová aktivita (zriedka)
↓ - vrodená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená spotreba- tvorba
imunokomplexov; hereditárny angioedém)
Interpretácia výsledkov
• Reaktanty akútnej fázy
↑ - akútna zápalová reakcia = opsonizační a prozánětlivý efekt
- regulačná funkcia; prenášače iontov; hemokoagulácia
CRP (mg/l)
↑ - bakteriálne infekcie
- infarkt myokardu, pooperačné obdobie
- reumatické choroby
Komplementový systém
• Humorálna zložka vrodenej imunity
• Evolučne „starobylý“ systém – primitívne
živočíchy disponujú podobnými proteínmi
• Tvorený desiatkami zložiek (prítomné v
sére alebo viazané na povrchu buniek)
• Kaskáda po sebe nasledujúcich krokov
spojená s proteolytickým štiepením
jednotlivých zložiek
• Amplifikácia pôvodného signálu
Komplement
• produkované jaterními bunkami, makrofágmi, ...
9 základných zložiek: C1-C9
Regulátory
- pozitívne: properdin (faktor P)
- negatívne (inhibítory):
C1 INH, CR1, MCP, DAF, faktor H, faktor I, CD59, C4bp
Aktivácia
komplementu
Zdroj: Aleshin et al. JBC 287 p10210.
membranolytický komplex
(MAC)
klasická cesta
patogén + Ig / CRP
C1q,r,s
lektinová cesta
patogén + MBL
MASP 1, 2
alternatívna cesta
patogén + C3b
C3 konvertáza = C2a+C4b / C3b+Bb
C3 C3b
C5 C5b
C5b
C6, C7, C8
poly C9
C2, C4 C2, C4
C5 konvertáza = C2a+C4b+C3b / C3b+Bb+C3b
Funkcie komplementu • Lýza buniek, mikroorganizmov
(MAC)
• Opsonizácia – označenie
cudzích buniek a častíc,
podpora fagocytózy (C3b)
• Chemotaxia – privolanie
ďalších zložiek imunitného
systému (C3a,C5a)
• Propagácia imunitnej reakcie –
prozánětlivá aktivita (C3a,C5a)
• Immune clearance –
odstraňovanie
imunokomplexov z cirkulácie
(C3b, C4b)
Vyšetrenie komplementu
Indikácia:
• Deficit niektorej zo zložiek?? → testujú sa hladiny jednotlivých zložiek, vyšetria sa
funkcie celého systému
• Podozrenie na hereditárny angioedém?? → vyšetrí sa hladina a funkcia C1 INH a
hladiny jednotlivých zložiek
• Monitorovanie zápalového procesu – zložky komplementu sa chovajú ako
proteíny akútnej fázy (ich hladina vzrastá pri zápale)
• Zvýšená spotreba zložiek?? → pri silnej aktivácii komplementu (diagnostika a
monitorovanie imunokomplexových chorôb)
Deficity komplementového systému
• C1-C4 – deficit spôsobuje častejší výskyt pneumonií, pyogénnych infekcií, častý
vývoj, systémových imunokomplexových chorôb (SLE-like)
• C3-C9 – najmä náchylnosť k pyogénnym infekciám, u deficitu C9 sú typické
opakované meningokové meningitidy
• C1 INH – Hereditárny angioedém
Vyšetrenie komplementu (odber)
➢ Špeciálne odberové skúmavky (bez separátorov)
➢ Spracovanie krvi do 60 min.
➢ Sérum zamrazené v -20°C (max. týždeň); ľubovoľne bez straty aktivity pri -70°C
➢ Nesmie byť opakovane zmrazované a rozmrazované
Vyšetrenie komplementu (laboratórne metódy)
➢ Stanovenie koncentrácie jednotlivých zložiek
• Nefelometria (sérová hladina C3 a C4 (g/l), C1-INH); turbidimetria; radiálna
imunodifúzia (C2 a C5); ELISA
➢ Funkčné vyšetrenie celého systému (jednotlivých aktivačných ciest)
• Založené na hemolytickej funkcii komplementu (CH50, AH50)
• Detekcia konečných zložiek kaskády (MAC) pomocou špecifických protilátok
(ELISA)
• Funkčné vyšetrenie C1 INH
• ELISA, RIA, LIA
• Vyšetrenie komplementového systému (sérová hladina C3 a C4 (g/l),
C1-INH, MBL, C2 a C5)
↑ - zápalová aktivita (zriedka)
↓ - vrodená / získaná porucha tvorby (jaterní selhání; zvýšená
spotreba- tvorba imunokomplexov; hereditárny angioedém)
Protokol
• Hlavička:
• Jméno
• Datum
• Úloha č. …
• Název úlohy
• Protokol:
• Princip – základní popis na pár vět
(možno doplnit obrázkem,
kresbou) ne sloh na celou stranu
• Pomůcky
• Postup
• Výsledky
• Závěr
• Rozsah – 1 až 2 strany A4 + přílohy
• Zpracování na PC nebo ručně
• Tisk → odevzdání při dalším cvičení
• Listy secvaknuté, popř. kancelářská
sponka
Kreslení obrázků, vkládaní fotek
výsledků ze cvičení vítáno