VÝPOČTY • Burst test výpočty •Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 •Výrobce ho dodává v 10mg balení •Látka se rozpouští v DMSO •Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? Burst test výpočty •Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 •Výrobce ho dodává v 10mg balení •Látka se rozpouští v DMSO •Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? •Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO • Počet zamrazovacích zkumavek •Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO • Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C •Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? • • Počet ependorfek •Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO • Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C •Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? •Laborant(ka) si musí připravit 222 zamrazovacích zkumavek • • Koncentrace •Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. •Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. • Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? Koncentrace •Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. •Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. • Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? •V jedné zkumavce je 2,7ug DHR123. Čas •Na jeden Burst test pro jednoho pacienta je zapotřebí 4 zkumavky •45ug DHR123 se naředí na 500ul •Do každé zkumavky se přidává 30ul naředěného DHR •Za rok se testem na Burst test vyšetří průměrně 160 pacientů. •Na jak dlouho vydrží zásoba DHR123 v mrazáku – 222 zkumavek? Čas •Na jeden Burst test pro jednoho pacienta je zapotřebí 4 zkumavky •45ug DHR123 se naředí na 500ul •Do každé zkumavky se přidává 30ul naředěného DHR •Za rok se testem na Burst test vyšetří průměrně 160 pacientů. •Na jak dlouho vydrží zásoba DHR123 v mrazáku – 222 zkumavek? •Zásoba zkumavek vydrží na 5,5roku. 5,78 Výpočty •10mg = 10 000ug •Koncentraci 1000ug/ml získáme přídavkem 10ml DMSO. •10ml = 10 000ul/45ul=222,22 •1000ul…..1000ug DHR 123 •45ul……….45ug DHR123 a ty dáme do 500ul •ve 30ul pak je 30x45/500=2,7ugDHR v jedné zkumavce •Jeden pacient 4x30ul=120ul •Zásobní roztok 500ul/120=4,1 •160 pacientů za rok: 160/4=40 – na rok budu potřebovat 40 zkumavek •Mám zásobu 222 zkumavek /40zkumavek potřebuji na rok tj. zásobu mám na 5,5 roku • Příprava buněčné suspenze pro proliferaci •Pro test proliferace lymfocytů bylo zapotřebí izolovat PBMC z plné krve •Při izolaci bylo získáno 10x10*6 PBMC, přičemž bylo živých 95% izolovaných buněk. Buněčná suspenze byla v 1ml média. •Buňky budou stimulovány 5 různými stimulancii, dále bude zapotřebí ještě nestimulovaná kontrola. Pro každou stimulaci se použijí tři jamky, tj bude se pracovat v tripletech + 2 jamky jako rezerva •Na jednu jamku připadne 200 000 buněk a ty budou ve 200ul média. •Z buněčné suspenze připravte potřebné množství pracovního roztoku s buňkami, tak aby jeho koncentrace byla 1milion na ml. • Poznámka – médium je velice drahé a je třeba s ním šetřit! • Výpočty •100%.........10,0x10*6 •95%.........=10,0x10*6 x 95/100 = 9,5x10*6 •5 stim + 1 nestim, na každou 3 jamky =6x3=18 + 2 jamky navíc - budu potřebovat 20 jamek po 200 000bb., tj 20x200 000= 4 000 000bb = 4x10*6 . •9,5x10*6 ………..1000ul •4x10*6………….=4x1000/9,5 = 421ul •Ideální je připravit si roztok o koncentraci 1mil/ml •Tj k 421ul přidáme 3579 ul roztoku média, poté pipetujeme 200ul/jamka Příprava roztoku anti-CD28 •Anti-CD28 se používá jako kostimulační protilátka při stimulacích T-lymfocytů •Pro stanovení produkce IFN-γ, budeme stimulovat 10 pacientů a 10 kontrol, pro každou osobu budeme potřebovat 2 jamky po 200 000 buňkách ve 200ul média •Pro stimulaci použijte koncentraci 2ug/ml •Zásobní roztok má koncentraci 1mg/ml •Jak budete postupovat při přípravě pracovního roztoku? Výpočty •10 pac + 10 kontrol=20, každý 2 jamky, tj celkem 40jamek, v každé je 200ul •Koncentrace anti-CD28: 1mg/ml, tj. •1000ug/1000ul •Požadovaná koncentrace je 2ug/ 1000ul, tj do 200ul potřebuji 0,4ug •Příprava zásobního roztoku: 40jamek*0,4 = 16ul zásobního roztoku anti-CD28 •Ideální je pipetovat např. 5ul na jamku, tj. potřebuji celkem 5x 40jamek= 200ul Pracovní roztok si tedy připravím: 16ul zásobního roztoku anti-CD28 + 184ul média = 200ul • Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA •Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky •Popište přípravu celkem 7 kalibrátorů získaných dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku, jamky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200ul + 50 μl rezervní objem) •Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? •Jak budete ředit dále? • • Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA •Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky •Popište přípravu kalibrátorů dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku,j amky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200 +50 μl rezervní objem) •Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Ze základního roztoku budeme pipetovat 25ul a dám je do 475ul ředícího roztoku: Ve 25ul je 500pg (v 1000ul je 20 pg), tj pokud máme 500ug v 500ul, pak je koncentrace tohoto roztoku 1000pg/1000ul, tj. 1000pg/ml. • Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA •Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky •Popište přípravu kalibrátorů dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku,j amky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200 +50 μl rezervní objem) •Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Ze základního roztoku budeme pipetovat 25ul a dám je do 475ul ředícího roztoku: Ve 25ul je 500pg (v 1000ul je 20 pg), tj pokud máme 500ug v 500ul, pak je koncentrace tohoto roztoku1000pg/1000ul, tj. 1000pg/ml. •Jak budete ředit dále? Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorescnci •Základní ředění vzorku na vyšetření ANA NIF je 1:80 (nejednoznačné vyjádření… může znamenat 1+79 nebo 1+80). Pokud jsou ANA při tomto ředění pozitivní, ordinuje odečítající většinou titraci (ředění) vzorku. •Popište, jakým způsobem byste postupovali, (jaké objemy séra a ředícího pufru byste použili), kdybyste měli naředit vzorek séra: •1:80, 1:160 a 1:320 •1:320, 1:640 s 1:1280 •Spotřeba vzorku každé koncentrace na analýzu je 50 ul (počítejte s tím, aby byl v každé zkumavce rezervní objem). • Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorscenci •Ředění 1:80: 10ul séra a 800ul ředícího pufru (PBS) •Ředění 1:160 z ředění 1:80 vzít 100ul, přidat 100ul PBS •Ředění 1:320 z ředění 1:160 vzít 100ul, přidat 100ul PBS • •Ředění 1:320 přímo ze séra: 5ul séra +1600ul PBS (nebo 10ul séra + 3200ul PBS – důležité je dodržet poměr) •Následné ředění 1:640: z ředění 1:320 vzít 100ul, přidat 100ul PBS •Následné ředění 1:1280: z ředění 1:640 vzít 100ul, přidat 100ul PBS • • • • • Výpočet absolutního počtu lymfocytů •Při vyšetření lymfocytárních subpopulací je kromě relativního počtu ještě zapotřebí určit absolutní počet lymfocytů a jejich subpopulací, tedy reálný počet buněk, který se nachází v 1l krve. •Příklad: •Počet leukocytů v krvi pacienta: 10x10*9leukocytů/l •Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? •Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? •T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? • Výpočty •10x10*9leukocytů/l •Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? 100-(20+10)=70 Granulocyty tvoří 70% ze všech leukocytů. •Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? •100%...... 10x10*9/l •20%......2x10*9 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 2x10*9 /l. • •Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? •100%...... 2x10*9 /l •60%......1,2x10*9 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 1,2x10*9 /l. • • •T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? •100%......1,2x10*9 /l •40%......4,8x10*8 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 4,8x10*8 /l.